1、實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的原理、操作及其的原理、操作及其應用應用- 分子生物學實驗技術 系列講座河南農業大學生命科學研究中心 張志坤2009.12.7大綱一一. .原理概述原理概述二二. .操作及結果分析操作及結果分析 (一).樣品制備 (二).引物及探針的設計與合成 (三).標準品的制備-質粒或純化后的PCR產物 (四).通道的選擇及增益的選擇 (五).標準曲線的建立 (六).加樣時應注意的細節 (七).閾值的選定 (八).熔解曲線分析 (九).操作流程三三. .應用應用 (一).絕對定量分析 (二).相對定量分析及實驗方案 (三).SNP檢測分析一、原理概述1.Real-Tim

2、e PCR 概論 實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。 實時熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整 個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方 法。 定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎上加裝了熒光激發裝置和熒光檢測裝置，PCR擴增和檢測同時進行，最終結果不需進行電泳檢測，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。 常 規 PCR技術：對PCR擴增反應的終點

3、產物進行定量和定性分析，無法對起始模板 準確定量，無法對擴增反應實時檢測。 實時定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產 物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量 分析。一、原理概述2.定量PCR常用的三個常用概念 擴增曲線、熒光閾值、Ct值 (1).擴增曲線：反映PCR循環次數和熒光強度的曲線，定量PCR儀每次輪PCR擴增都會自動 錄熒光強度的變化每個循環進行一次熒光信號的收集一、原理概述2.定量PCR常用的三個常用概念 擴增曲線、熒光閾值、Ct值 (2).熒光閾值：樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，手動 設置的原則要大于樣本的熒 光背景值

4、和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數期的最初階 段，并且保證回歸系數大于0.99。 (3).CT值： PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環 次數。一、原理概述3.熒光定量PCR所用的熒光報告基團(1).非特異性熒光標記： SYBR Green (2).特異性熒光標記： TaqMan探針 Molecular Beacon分子信標一、原理概述4.非特異性熒光染料-SYBR Green的特性(1).SYBR Green 能結合到雙鏈DNA的小溝部位(2).SYBR Green 只有和雙鏈DNA結合受激后才發 熒光(3).變性時，DNA雙鏈分開，無熒光(4).

5、復性和延伸時，形成雙鏈DNA,SYBR Green 發熒光，在此階段采集熒光信號。SYBR GreenSYBR Green一、原理概述4.非特異性熒光染料-SYBR Green的工作原理圖解5353SGNo EmissionSGSGSGExcitatiExcitationonSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitatiExcitationon 伴隨著每輪PCR的進行，特異的基因片段不斷積累，SYBR Green不斷的與新增加的基因片段結合而發出熒光，熒光信號不斷積累，熒光定量PCR儀實時記錄了熒光信號的變化。一、原理概述5.非特異性熒光染料SYBR Green的優缺點

6、優點： (1).對DNA模板沒有選擇性-適用于任何DNA (2).使用方便-不必設計復雜探針 (3).非常靈敏 (4).可做熔解曲線分析 (5).便宜 缺點： (1).對引物特異性要求較高 (2).與非特異性雙鏈DNA結合，產生假陽性,干擾實驗的準確性,尤其 是分析表達量不高的基因時,這類情況尤其突出; 需要不斷的優化反 應體系,降低非特異性擴增.一、原理概述6. TaqMan-水解型雜交探針與目標序列互補TaqMan探針的特性：(1).5端標記有報告基團(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 (2).3端標記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q)(3).探針完整，R所發射的熒光

7、能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分 開，發熒光(4).Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針一、原理概述6. TaqMan-水解型雜交探針工作原理每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環過程中任一點檢測熒光一、原理概述7.探針法的優缺點 (1).極高的特異性和準確性 由于探針法除了引物序列的特異性之外，還有探針 序列的特異性，從兩個方面保證了所 擴增基因的特異 性。 (2).良好的重復性 (3).目前合成價格較貴. (4).不能做熔解曲線分析.一、原理概述8.熒光定量PCR的數學原理理想的PCR反應： X=X0*2n (擴增效率=1)實際的的PCR反應： X=X0* (1+E

8、x)n n：擴增反應的循環次數 X：第n次循環后的產物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率一、原理概述8.熒光定量PCR的數學原理在擴增產物達到閾值線時: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量. 在閾值線設定以后,它是一個常數,我們設為M方程式(1)兩邊同時取對數得:log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3)log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4)Ct= -log X0 + log M (5)log(1+Ex) Lo

9、g（x0的初始模板量）與到達閾值時的循環數（Ct值）呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環數即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量一、原理概述8.熒光定量PCR的數學原理模板DNA量越多，熒光達到域值的循環數越少，即Ct值越小Log濃度與循環數呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量一、原理概述8.熒光定量PCR的數學原理25Sample一、原理概述9.認識一下熒光定量PCR儀 儀器本身的功能： 1、控制參數（溫度） 2、控制循環數（時間） 3、記錄整個循環過程中的熒光值的變化，在所有的時 間和溫度條件下，儀器都會忠實的記錄下熒光值的

10、變化。 熒光定量PCR儀就是通過對所記錄的參數來計算樣品的初始模板量的。循環數和熒光值曲線溫度和熒光值曲線一、原理概述ABI 7300型96孔熒光定量PCR儀，由于樣品間存在光程差，需ROX校正。RoterGene3000型36孔熒光定量PCR儀，旋轉加熱式，不需ROX校正二、操作及結果分析1、樣品的制備 DNA樣品，主要是DNA提取，提取的DNA可TE緩沖液溶解后-20度保存；對于RNA樣 品，抽提RNA后要迅速反轉錄，將RNA反轉錄為cDNA，TE緩沖液溶解后可-20度保 存。 DNA或cDNA樣品也不要長期存放，因為在存放過程中會有少量的DNA降解，從而 影響樣品中目的基因的含量。對于大

11、量的樣品最佳的檢測方案是： 根據實際情況安排好每天要提取的樣品數量，提取后若是RAN立即進行反轉錄反 應，并且將當天反轉錄的樣品進行定量PCR檢測；千萬不可先將所有的樣品都提取RNA，提取完RNA后再統一反轉錄，然后在對cDNA樣品進行定量檢測，千萬不要這樣做，因為RNA是極不穩定的，哪怕是存放于-80度冰箱，一方面RNA極其容易降解從而影響檢測的準確性，另一方面萬一實驗室的超低溫冰箱放生故障造成停機或停電，那所有提取的RNA將會很大程度的降解，對樣品造成不可挽回的損失！最好的安排是：當天提取或反轉錄的樣品，當天就進行定量PCR的檢測，最大程度的減少RNA的降解，這樣測定的結果才更準確。二、操

12、作及結果分析2、定量PCR引物及探針的合成 定量PCR所擴增的片段長度一般都不超過300bp，這樣才能確保結果更準確；染料法對引物的特異性要求較高，探針法對引物的特異性要求不高，探針法所擴增的片段長度更短，一般都在200bp以下。引物和探針都要進行Blast分析，以避免非特異性擴增。二、操作及結果分析3、標準品的制備-質粒或純化后的PCR產物這一步驟一般在預實驗時完成，嚴格意義上的操作要求將PCR產物切膠后進行膠回收，并進行質粒的連接、轉化到感受態大腸桿菌中，質粒在大腸桿菌中增值后提取質粒，并用分光光度計測定含有PCR產物的質粒的OD值，借此來確定質粒的摩爾量，將已知摩爾量的質粒做5倍或10倍

13、的連續梯度稀釋，做成質粒標準品，這是準確測定樣品中目的基因模板量的定量基礎。現在也有的不做質粒，直接測定純化后的PCR產物的摩爾量，然后梯度稀釋PCR產物，以此來作為標準品。 一般做四個標準品左右 5-25-125-625-3125 10-100-1000-10000-100000二、操作及結果分析4、通道的選擇及增益的選擇對于任何一款熒光定量PCR儀來說，都有一組或幾組激發光和濾光片以及相應的檢測器和濾光片，這些就構成了定量PCR儀的通道。不同的發光基團都有相應的激發光和相應的檢測器。定量PCR儀從最初的單通道發展到現在的多通道，常用的通道有FAM/HEX/JOE等。可根據自己所用的發光基團

14、來選擇相應的通道。增益（gain），是熒光信號的放大倍數，發光基團的熒光是很微弱的，必須經過適量的信號放大才能被檢測，否則，整個擴增曲線的熒光強度非常小，以致無法準確檢測。所以在實驗前，要選擇合適的增益倍數。二、操作及結果分析5、標準曲線的建立梯度稀釋后，標準品的擴增曲線間距相等，標準曲線上的間距也相等，說明標準曲線建立的很成功，假如間距參差不齊，說明梯度稀釋時操作誤差太大，建議重新做標準品的梯度稀釋，重新做標準曲線，直到擴增曲線之間的間距相等為止。因為這一步直接影響著樣品中目的基因原始模板量的準確性。二、操作及結果分析6、加樣時的操作所有的加樣操作要圍繞著盡量使反應體系均一化為目的，除了樣品

15、外，其他試劑都要進行預混，預混后分裝到各個PCR管中，最后加樣品，移液器要盡量準確，因為這一步的操作可以說是差之毫厘，謬以千里。二、操作及結果分析7、閾值的設定定量PCR反應結束時開始對結果進行分析，此時需要劃定閾值，也就是在擴增曲線的指數期劃一條直線，這條線就叫閾值線，在閾值線上，所有的樣品的熒光值都一致相同，不同的只是所對應的CT值和初始模板量！閾值的設定要盡量讓回歸系數最大！圖中的虛線即為閾值線二、操作及結果分析8.熔解曲線分析熔解曲線（melt分析）是指定量PCR反應結束后讓樣品繼續升溫直到PCR產物的雙鏈全部打開，這時由于雙鏈打開，熒光染料不發熒光，這樣熒光值會有一個陡然的突降，借以

16、檢測PCR產物的特異性，相當于進行電泳檢測。因為不同的PCR產物片段其TM值不同，單一的雙鏈DNA其熒光陡降的溫度一致，加入含有非特異性擴增產物，那么其熒光陡降的溫度不止一個（兩個或更多或雜亂無章）。如圖：特異性強的溶解曲線二、操作及結果分析8.熔解曲線分析二、操作及結果分析9、操作流程確立實驗方案樣品制備設計引物及探針預實驗標準品及標準曲線的建立定量PCR檢測分析數據三、熒光定量PCR技術的應用1、絕對定量分析 這是熒光定量PCR技術的直接應用，可用于檢測病毒及細菌的濃度！三、熒光定量PCR技術的應用2、相對定量分析及實驗方案 基因表達(gene expression)是指細胞在生命過程中,

17、把儲存在DNA順序中遺傳信息經過轉錄和翻譯,轉變成具有生物活性的蛋白質分子. 遺傳物質DNA首先要把所攜帶的遺傳信息轉錄成為信使RNA（mRNA）,攜帶遺傳信息的mRNA從細胞核進入到細胞質中與核糖體結合，在核糖體中mRNA攜帶的遺傳信息被翻譯成為多肽，多肽經過進一步加工后變成蛋白質，至此遺傳物質DNA完成了表達過程。期間的轉錄過程是基因表達中非常重要的調節步驟，所轉錄的mRNA的多少直接影響著相關最終蛋白質的多少，所以通過對細胞內某條基因mRNA含量多少的分析，就能大致判斷出該條基因的表達是否活躍。三、熒光定量PCR技術的應用2、相對定量分析及實驗方案 研究基因表達的情況，我們只需搞清楚該基

18、因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。基因表達調控研究中，由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進行基因表達調控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。所謂的看家基因即內參基因，是指在各生理階段表達量恒定的基因，也稱奢侈基因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作參照，常用的內參基因有GAPDH基因、-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表達調控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。 假定在1生理時期，

19、X基因的表達量為X1；其內參基因表達量為Y1；X1/Y1就將1生理時期的取樣、RNA提取、純化、反轉錄等過程的所有偏差均一化了；同樣在2生理時期，X2/Y2就將2生理時期的取樣、RNA提取、純化、反轉錄等過程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能較為真實的反應在1、2生理時期，X基因的變化情況。 常用的相對定量方法主要有兩種，雙標準曲線法和Delta-delta Ct法。三、熒光定量PCR技術的應用2、相對定量分析及實驗方案-雙標準曲線法所謂的雙標準曲線法就是對內參基因和所研究的目的基因都做絕對定量，然后將各生理階段的目的基因的量和內參基因的量相除，得出一個比

20、值；最后再將不同生理階段所得的比值相除，最終得出目的基因在不同生理階段的表達變化。雙標準曲線法思路直觀、條理清晰，最大限度的避免了實驗的誤差，是一種很好的分析方法。三、熒光定量PCR技術的應用2Delta-delta Ct法 此法是經定量的數學原理推導而來 該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量，但同時默認兩個基因擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，因此實驗條件需要嚴格優化，并且總會存一定的偏差。在預實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。軟件會自動給出兩組標準曲線的R值、擴增效率等信息，如果兩組標準曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個基因的擴增效率已非常接近，那么后續實驗中

21、就可以用此法進行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優化實驗，使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。三、熒光定量PCR技術的應用3、SNP檢測分析 基因組DNA是生物體各種生理、病理性狀的物質基礎。人類眾多個體的基因組序列的一致性高達99%以上，但個體之間各種性狀的差異仍然很大，包括對疾病的易感性、對同一疾病治療藥物的反應性等。在同一生物種群中明顯存在兩種以上不同的遺傳性狀，而且出現頻率較高，稱為遺傳的多態性(polymorphism)，而遺傳物質DNA的多態性如RFLP、STR、ABO血型、HLA和單核

22、苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)是個體間差異的遺傳學基礎。 SNPs是指在基因組水平上由于單個核苷酸位置上存在轉換(C與T互換，在其互補鏈上則為G與A互換)或顛換(C與A，G與T，C與G，A與T互換)等變異所引起的DNA序列多態性。SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。三、熒光定量PCR技術的應用3、SNP檢測分析 通常所說的SNP都是二等位多態性的，轉換的發生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發生幾率相似。轉換的幾率之所以高，可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。 在基因組DNA中，任何堿基均有可能發生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區內的SNP(cSNP)比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此c