1、精品文檔八寶景天抑菌活性實驗方案1 材料與儀器1.1 材料八寶景天（莖、葉、花），采摘于吉林農業大學校園，去離子水洗凈，陰干，經粉碎機粉碎 (過 4060 目篩 )，所得植物粉用密封袋于遮光處保存備用。1.2 微生物真菌：黃瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)、黃瓜黑星病菌（ Cladosporium cucumerinum）、辣椒炭疽病菌（ Colletotrichum nigrum ）由吉林省蔬菜花卉科學研究院提供。番茄葉霉病菌 ( Fulvia fulva )、番茄早疫病菌 (Alternaria solani )、甜瓜莖腐病菌 (Fusarium gramimearum

2、)、水稻立枯病菌（ Rhizoctonia solani Kuhn）、番茄灰霉病菌（ Botrytis cinerea）、黃瓜菌核病菌 (Sclerotinia sclerrotium) 均由吉林農業大學農學院植物病理研究室提供。1.3 試劑與儀器95%乙醇分析純國藥集團化學試劑有限公司葡萄糖分析純國藥集團化學試劑有限公司瓊脂粉生化試劑天津科密歐化學試劑有限公司馬鈴薯JFSD-100 粉碎機上海淀久中藥機械制造有限公司JJ200型精密電子天平美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠HH-S 數顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市醫療儀器廠RE-2000 旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠SHZ-III 型循環水真

3、空泵上海亞榮生化儀器廠TDL-5A 低速大容量離心機上海悅豐儀器儀表有限公司生化培養箱 SPX-250 型上海躍進醫療器械廠ZKF035 電熱真空干燥箱上海實驗儀器廠有限公司KQ5200B 型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司不銹鋼手提式滅菌器上海申安醫療器械廠超凈工作臺上海生物科技有限公司.精品文檔1.4 培養基的制備真菌都用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基 )馬鈴薯 ( 去皮 )200g葡萄糖20g瓊脂 20g水 1000mLpH 值 自然培養基具體制作方法是：將200g 馬鈴薯去皮，去芽眼，切成小條放入鋁鍋中，加入 1000mL 水，煮沸 20 30 分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用6

4、8 層紗布過濾，取濾汁于鍋中，補水至 1000mL，加入瓊脂熔化，再加入糖攪拌均勻，趁熱分裝于試管或錐形瓶中。分裝后 121滅菌 20min。2 試驗方法2.1 植物提取液的制備準確稱取 100 g 的樣品，于 250 ml 錐形瓶中，加入200 ml 95% 的乙醇，室溫下，超聲提取 45 min，連續提取 3 次，過濾粗提物，離心（ 3500 r/min,20 min），過濾除雜，濾液用旋轉蒸發儀濃縮至干，4 冰箱中保存備用。2.2 八寶景天（莖、葉、花）提取物抑菌活性的測定抑菌試驗樣品的準備：稱取一定量的提取物，用20%（體積分數）乙醇將植物提取物配制成質量濃度為10 g/ml 的供試藥

5、液做抑菌試驗用。菌的活化培養： 供試真菌從 4 冰箱取出， 接種于具有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的培養皿中，于28下活化培養，待菌絲長滿整個培養皿的80%時備用。菌懸液的制備： 取一定量已活化的供試菌于裝有 50mL 的液體 PDA 培養基的錐形瓶中，制成菌懸液于 28下培養 48h，用無菌的移液管取 1.0mL 培養好的菌懸液于試管中，加入 9.0mL 的無菌水依次梯度稀釋，每稀釋一個試管，濃度降低 10-1，用稀釋培養基測數法測菌體個數， 調至濃度為 6.8 106 CFU/mL（指每毫升樣品中含有的細菌群落總數） 。八寶景天（莖、葉、花）提取物抑菌活性的測定采用菌絲生長速率法、稀釋培養基測數

6、法。2.2.1 菌絲生長速率法又稱抑菌圈法或瓊脂平板法。 生長速率是指將不同濃度的藥液與融化的培養基混合，制成帶毒培養基平面， 在平面上接種病原菌， 以病菌生長速度的快慢來.精品文檔判斷藥劑毒力大小的方法，以一定的時間內菌落直徑的大小來表示。菌絲生長速率法試驗步驟： 1）制備帶毒培養基平面準確的吸取一定量的上述植物提取物加入到已融化的培養基中，混合均勻倒入已滅菌的培養皿內，冷卻后即成帶毒的培養基平面2）接種病原菌用無菌打空器將已活化的菌制成直徑為 6mm 的菌餅，用無菌鑷子將菌餅接入平板中央，每培養皿放置1 個菌餅，置于 25 28 的電熱恒溫培養箱黑暗培養。3）結果 采用十字交叉法測定菌落直

7、徑 ,按以下公式計算抑制率：抑制率 =(CK 菌落直徑 -0.6)-(處理菌落直徑 -0.6)/(CK 菌落直徑 -0.6)100%2.2.2 稀釋培養基測數法根據微生物在高度稀釋條件下， 固體培養基上所形成的單個菌落是由一個單細胞繁殖而成這一培養特征設計的技術方法，即一個菌落代表一個單細胞。稀釋培養基測數法試驗步驟如下：1）稀釋培養基測數法 (最大或然數計數法Most probable number，MPN) 測定每毫升原培養液含活菌數，根據MPN 所得結果將原培養液稀釋成約100CFU/mL； 2）吸取 20L 菌懸液于含提取物的固體培養基的平板中，用涂菌棒涂布均勻靜置15 min，將培養基平板倒置 (防止皿蓋冷凝水下滴 )于 28生化培養箱培養24 h；3）數菌落數，對照組菌落數記為C0，涂布提取物平板