1、 現 代 分 子 生 物 學 課 程 論 文題 目 基因敲除技術 班 別 生物技術10-2學號 10114040220 姓 名 陳嘉杰 成 績 基因敲除技術的研究進展要摘 基因敲除是自80年代末以來發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。此后經歷了近20年的推廣和應用，直到2007年10月8日，美國科學家馬里奧卡佩奇（mario capecchi）和奧利弗史密西斯（oliver smithies）、英國科學家馬丁埃文斯（martin evans）因為在利用胚胎干細胞對小鼠基因金星定向修飾原理方面的系列發現分享了2007年諾貝爾生理學或醫學獎。基因敲除

2、技術從此得到關注和肯定，并對醫學生物學研究做出了重大貢獻。本文就基因敲除的研究進展作一個簡單的綜述。關鍵詞 基因敲除、rnai、生物模型、同源重組前言 基因敲除又稱基因打靶，該技術通過外源dna與染色體dna之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改制，具有轉移性強、染色體dna可與目的片段共同穩定遺傳等特點。應用dna同源重組技術將滅活的基因導入小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cells，es cells）以取代目的基因，再篩選出已靶向滅活的細胞，微注射入小鼠囊胚。該細胞參與胚胎發育形成嵌合型小鼠，再進一步傳代培育可得到純合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使許多與人類疾病相

3、關的新基因的功能得到闡明，使現代生物學及醫學研究領域取得了突破性進展。上述起源于80年代末期的基因敲除技術為第一代技術，屬完全性基因敲除，不具備時間和區域特異性。關于第二代區域和組織特異性基因敲除技術的研究始于1993年。tsien等1于1996年在cell首先報道了第一個腦區特異性的基因敲除動物，被譽為條件性基因敲除研究的里程碑。該技術以cre/loxp系統為基礎，cre在哪種組織細胞中表達，基因敲除就發生在哪種組織細胞中。2000年shimizu等2于science報道了以時間可調性和區域特異性為標志的第三代基因敲除技術，其同樣以cre/loxp系統為基礎，利用四環素等誘導cre的表達。該

4、技術使目的基因的敲除在時間上可人為控制，避免了死胎或動物出生后不久即死亡等現象的出現。 2004年該實驗室cui等又報道了第四代基因工程技術，即可誘導的區域性蛋白質敲除技術，用這一技術構建的模式動物可在幾分鐘內反轉性地激活或敲除特定蛋白質的功能，從根本上改變了前三代基因敲除技術對蛋白質代謝速度的內在依賴性，達到空前的時間精度，成為目前功能基因組和功能蛋白質組研究最先進的工具之一。1. 基因敲除技術簡介基因敲除是自80年代末以來發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。通常意義上的基因敲除主要是應用dna同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而

5、達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組外，新的原理和技術也逐漸被應用，比較成功的有基因的插入突變和irna，它們同樣可以達到基因敲除的目的。2實現基因敲除的多種原理和方法：2.1.1 利用基因同源重組進行基因敲除基因敲除是80年代后半期應用dna同源重組原理發展起來的。80年代初，胚胎干細胞（es細胞）分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985 年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。到1987年，thompsson首次建立了完整的es細胞基因敲除的小鼠模型 1。直到現在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的

6、使用方法。 2.1.2條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法2。它實際上是在常規的基因敲除的基礎上，利用重組酶cre介導的位點特異性重組技術，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設置一個可調控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態2.1.2.1條件性敲除的原理利用creloxp 和來自酵母的flpfrt 系統可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導致的表型4。通過常規基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的1oxp，并以此兩側裝接上loxp 的(“loxp floxed”)es

7、 細胞產生“loxpfloxed”小鼠,然后，通過將“loxp floxed”小鼠與cre 轉基因鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入cre 重組酶)，產生靶基因發生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠。在“loxp floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側已各裝上了一個loxp，但靶基因并沒有發生其他的變化，故“1oxp noxed”小鼠表型仍同野生型的一樣。但當它與cre 轉基因小鼠雜交時，產生的子代中將同時帶有“loxp floxed”靶基因和cre 基因。cre 基因表達產生的cre 重組酶就會介導靶基因兩側的1oxp 間發生切除反應，結果將一個loxp 和靶基因切除。這樣，靶

8、基因的修飾(切除)是以cre 的表達為前提的。cre 的表達特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即cre 在哪一種組織細胞中表達，靶基因的修飾(切除)就發生在哪種組織細胞；而cre 的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進行修飾的效率。所以只要控制cre 的表達特異性和表達水平就可實現對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。32.1.2.2 誘導性基因敲除法誘導性基因敲除也是以cre/loxp 系統為基礎，但卻是利用控制cre 表達的啟動子的活性或所表達的cre 酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制或利用cre 基因定位表達系統中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統轉移到動物體內的過程在

9、時間上的可控性，從而在1oxp 動物的一定發育階段和一定組織細胞中實現對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術。人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現死胎或動物出生后不久即死亡的現象。常見的幾種誘導性類型如：四環素誘導型；干擾素誘導型；激素誘導型；腺病毒介導型。2.2利用隨機插入突變進行基因敲除。2.2.1 原理：此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞5,6。根據細胞的不同，插入載體的選擇也有所不同

10、。逆轉率病毒可用于動植物細胞的插入；對于植物細胞而言農桿菌介導的t-dna轉化和轉座子比較常用；噬菌體可用于細菌基因敲除。 2.2.2基因捕獲法基因捕獲法是最近發展起來的利用隨機插入突變進行基因敲除的新型方法。通常基因捕獲載體還包括一個無啟動子的報道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到es 細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉錄調控元件實現表達的es 克隆可以很容易地在含g418 的選擇培養基中篩選出來，從理論上講，在選擇培養基中存活的克隆應該100地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標記基因側翼cdna或染色體組序列分析來獲得2.3.rnai引起的基因敲除。由于少量的雙鏈rna就

11、能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中,所以rnai的反應過程也可以用于基因敲除。近年來，越來越多的基因敲除采用了rnai這種更為簡單方便的方法。2.3.1 rnai阻斷基因表達的機理雙鏈rna進入細胞后，能夠在dicer酶的作用下被裂解成sirna，而另一方面雙鏈rna還能在rdrp （以rna為模板指導rna合成的聚合酶rna-directed rnapolymerase，rdrp）的作用下自身擴增后，再被dicer酶裂解成sirna。sirna的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物，argonaute2是目前唯一已知的參與復合物形成的蛋白。此復合物同與sirna互補的mr

12、na結合，一方面使mrna被rna酶裂解，另一方面以sirna作為引物，以mrna為模板，在rdrp作用下合成出mrna的互補鏈。結果mrna也變成了雙鏈rna，它在dicer酶的作用下也被裂解成sirna。這些新生成的sirna也具有誘發rnai的作用，通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內的sirna大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的sirna到幾百個核苷酸的雙鏈rna都能誘發rnai，但長的雙鏈rna阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈rna7。2.3.2 rnai基因敲除的優點及應用.比用同源重組法更加簡便，周期大大縮短。.對于哺乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會

13、死亡的基因，可以在體外培養的細胞中利用rnai技術研究它的功能。.由于rnai能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導通路的良好工具。.rnai還被用來研究在發育過程中起作用的基因，如可用rnai來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中其起著關鍵作用。2.4實現基因敲除的其他原理。除上述幾種已經比較成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，還有一些基于其他原理的敲除技術正處于研究和完善過程中，如tfos（triple helix forming oligonucleotides）引導的基因敲除術以及反義技術在基因敲除技術中的運用等。隨著遺傳學，分子生物學理論的發展，新

14、的基因敲除原理也在不斷的發現和發掘中。3基因敲除技術的缺陷隨著基因敲除技術的發展，早期技術中的許多不足和缺陷都已經解決，但基因敲除技術始終存在著一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗余的， 敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能；另一方面，對于某些必需基因，敲除后會造成細胞的致死性，也就無法對這些必需基因進行相應的研究了。 4基因敲除技術的應用及前景：建立生物模型。在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技術就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而

15、進行相關的研究。這些模型可以是細胞，也可以是完整的動植物或微生物個體。最常見的是小鼠，家兔、豬、線蟲、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見于報道。.疾病的分子機理研究和疾病的基因治療。通過基因敲除技術可以確定特定基因的性質以及研究它對機體的影響。這無論是對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標都有重大的意義。. 提供廉價的異種移植器官。眾所周知，器官來源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素，而大量廉價的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因為異源生物的基因會產生一些能引起人體強烈免疫排斥的異源分子，如果能將產生這些異源分子的基因敲除，那么動物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來具大

16、的福音。如：ppl therapeutics 公司于1999 年已成功地在豬的體細胞中用基因敲除技術敲除了1，3gt 基因。使每只豬都缺乏產生a半乳糖基轉移酶的基因的個拷貝。這些酶在細胞表面產生一種糖分子，人體的免疫系統可以立即辨認出這種糖分子為異源性，從而引發超急性免疫排斥反應。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應即不會再發生8。. 免疫學中的應用。同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時或多或少會有一定的免疫排斥，使得人用抗體類藥物的生產和應用受阻。而如果將動物免疫分子基因敲除，換以人的相應基因，那么將產生人的抗體，從而解決人源抗體的生產問題。改造生物、培育新的生物品種。細菌的基因工程技術

17、是本世紀分子生物學史上的一個重大突破，而基因敲除技術則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術支持。參考文獻1王又紅 基因敲除技術的應用現狀與發展前景 國外醫學 1999 26-52muller,-u. ten years of gene targeting: targeted mouse mutants, from vectordesign to phenotype analysis. mech-dev. 1999 apr; 82(1-2): 3-23.yunfengli 基因敲除技術的最新進展 丁香園電子期刊2003124. andrew holmes

18、 targeted gene mutation approaches to the study of anxiety-likebehavior in mice neuroscience and biobehavioral reviews 25 (2001) 2612735. u. klinner *, b. schafer genetic aspects of targeted insertion mutagenesis in yeasts fems microbiology reviews 28 (2004) 2012236. joel s. bedford, howard l. liber applications of rna interference for studies in dna damage processing, genome stability, mutagenesis, and cancer seminars in cancer biology 13 (2003) 3013087georg mellit