1、基于稀疏輪廓掃描的滑動焦點光聲顯微成像方法摘要：在基于光聲共焦的超聲分辨光聲顯微成像系統中，只有焦點處的吸收體可以獲得高分辨率高信噪比的成像，而實際的生物組織往往具有不規則的輪廓，導致成像結果分辨率和信噪比不均勻。本文提出了一種基于手動描繪輪廓的滑動焦點光聲顯微成像方法，首先在固定的焦點上稀疏掃描輪廓，結合人工選擇輪廓點獲取輪廓的稀疏矩陣，然后通過線性擬合獲取完整的輪廓矩陣，并將輪廓矩陣的信息轉化為焦點位置信息，最后進行二次掃描，根據焦點的位置信息在每次掃描之前調整焦點位置，使得在整個掃描過程中，樣品始終處于焦點的位置，從而獲得分辨率和信噪比均勻的光聲顯微圖像。通過在體皮下血管成像和皮下腫瘤血

2、管再生成像，證明了該方法可以有效提高光聲成像的質量。關鍵詞：圖像處理；光聲成像；滑動焦點1 引言光聲顯微成像（photoacoustic microscopy）是光聲成像技術的一種新興模式，通過使用聚焦型超聲傳感器探測1，或者聚焦光入射2的辦法，目前已實現亞波長的高分辨成像3，在生物醫學研究和臨床應用等領域展示了巨大的潛力。通過暗場反射式照明配合聚焦型超聲探頭，實現了軸向15 um、側向45 um的分辨率以及3 mm的最大成像深度，目前已用于小動物的皮下血管成像4、腫瘤及周圍血管結構與功能成像5、顱下血管成像6等領域。相對于激光散斑成像、光學相干成像、共聚焦顯微成像等高分辨光學成像技術，光聲顯

3、微成像可以在更深的深度實現高分辨的內源及外源信號成像。暗場反射式光聲顯微成像的系統描述和成像原理可在文獻7中找到，這里簡要介紹一下系統的圖像重建，通過時間分辨的超聲探測，乘以超聲在組織中的傳輸速度，可以獲取x-y平面上一個位置的深度信息（a scan），通過沿x軸掃描，可以獲取x-y平面上一條線的截面信息（b scan），通過在x-y平面上二維光柵掃描，可以獲取三維的結構信息（c scan），通過三維可視化重建，即可得到組織的三維結構圖。除此之外，二維的最大值投影圖（map）使用也很廣泛，由于血液的吸收遠大于周圍組織，所以血管的光聲信號遠大于周圍組織，從而在某個方向上求取最大值，可以保留血管的

4、信號，當然最常用的還是在深度方向上求取最大值投影，這樣不但可以獲取x-y平面上的血管分布，而且可以抵消部分運動偽跡。本文展示的結果主要采用b型掃描和沿深度方向最大值投影圖的形式。在暗場反射式光聲顯微成像系統中，為了實現高分辨的光聲顯微成像，需要使用高中心頻率、寬帶寬、高數值孔徑的球形聚焦超聲傳感器，而這種結構設計的劣勢就是焦深也隨之降低8，這導致當成像物體離焦時，成像質量會迅速下降，在傳統的掃描方式下，探頭在x-y平面上以固定的高度掃描，樣品的輪廓波動大于焦深時就會導致部分區域的成像質量下降，在重建圖像上直觀的表現為分辨率下降導致的血管變粗以及信噪比的下降。一維8和二維9數值孔徑合成算法可以在

5、一定的離焦范圍內改善這種惡化，但是目前只有一定的方向上進行合成才能獲得比較好的效果，而且這種算法并未考慮組織與水的不同聲阻抗參數，故而存在一定的誤差10。因此有必要設計出一種能夠使得探頭的焦點沿樣品輪廓掃描的方法和系統，保證成像的分辨率和信噪比在整幅圖像上一致。本文設計了一種基于輪廓掃描的滑動焦點光聲顯微成像方法，并在現有的光聲顯微成像系統上實現了該方法，通過在成像前稀疏掃描樣品輪廓，人工選擇部分輪廓點結合線性插值的辦法獲取樣品的輪廓矩陣，并將輪廓矩陣信息轉化為焦點的位置移動信息，在成像時每移動一個位置，就相應調整焦點的位置，使得在整個掃描過程中樣品始終處于焦深范圍內，從而獲得均一、高分辨、高

6、信噪比的圖像。2 方法2.1 輪廓信息的獲取焦點的滑動是按照輪廓信息來執行的，因此在成像之前需要首先獲取輪廓信息，這一過程主要分為以下兩步：2.1.1 稀疏輪廓b型圖像的獲取稀疏輪廓b型掃描基于傳統的固定焦點掃描，樣品放置好之后，先將焦點調整到感興趣區域，然后掃描多個位置的b型圖像，位置的選取要充分考慮樣品表面輪廓的波動情況，當波動較大時，可以適當的密集掃描b型圖像，當波動較小時，可以適當的稀疏掃描b型圖像。為了方便后面的插值，一般要求輪廓b型圖像的掃描要包括視場的邊界。2.1.2 輪廓矩陣的獲取獲取輪廓稀疏b型掃描圖像之后，需要人工介入選擇每幅b型圖像上的輪廓位置，然后通過biharmoni

7、c樣條曲面插值獲取整個視場中的輪廓點位置（aij），該插值方法的原理簡述如下11：對于二維空間中分布的n個控制點，i=1n，biharmonic樣條曲面插值可以轉化為求取方程組（1）的解：（1）其中為biharmonic算子，為單位沖擊函數，p為二維空間中待插值的位置，為p處插值的結果。方程組（1）的解為：（2）式中的可以通過求解線性方程組（3）獲得：（3）式中為二維green函數，即。插值得到的輪廓矩陣aij即為（2）式中的。該插值方法整體平滑且局部性能好，而且對控制點的分布和數量沒有限制12。插值得到的位置是絕對位置，為了避免水和組織聲阻抗特性的差異造成的誤差，將絕對位置換算為相對位置：（

8、4）式中rij為每次b型掃描的焦點移動矩陣，ti為每次b型掃描起點的焦點移動矩陣，即認為在起始點時感興趣區域（如血管）處于焦深范圍，后面各點的掃描焦點的移動均以該點為參照。將相對位置矩陣乘以z軸每個像素代表的深度（6 um），即可得到焦點的移動信息矩陣，由于z軸的移動指令數據格式為整形，所以最后還需要進行數據格式轉換。輪廓信息的獲取過程示意如圖1所示。圖 1 輪廓信息的獲取過程示意2.2 滑動焦點掃描滑動焦點掃描依然基于b型掃描，每次b型掃描之前，首先將該線所對應的焦點移動矩陣（aik）送入內存，然后在激光器觸發脈沖的觸發下依次完成信號的采集、掃描軸（x軸）的步進以及焦點（z軸）的調整。一次b

9、型掃描完成之后，掃描軸電機回歸至初始位置，正交軸（y軸）步進，同時z軸帶動焦點也回歸到起始點的位置，這時再將tk送入內存，控制焦點移動到下一條b型掃描線的起始位置，重復上述b型掃描過程，完成整個視場的掃描。這里之所以在每條b型掃描線結束后焦點歸零（起始位置），是為了防止掃描過程中的一個可能的焦點移動錯誤帶入到后面的掃描過程中，從而避免了誤差的蔓延與累積?；瑒咏裹c掃描過程對應于圖2所示的流程圖。圖2 滑動焦點掃描流程圖3 實驗3.1 模型實驗對一塊表面包被黑色pvc絕緣膠帶的圓柱形金屬塊沿橫截面方向進行b型掃描，掃描圖像如圖3a所示，圖中自上而下第一條亮帶為絕緣膠帶的上表面產生的光聲信號，第二條

10、亮帶為絕緣膠帶的下表面產生的光聲信號，在9 mm的掃描范圍內，絕緣膠帶豎直方向的跨度約為1 mm，超出了超聲探頭的焦深（約0.3 mm），因此圖像兩側的信噪比逐漸下降。采用滑動焦點掃描的圖像如圖3b所示，由于探頭沿著膠帶的輪廓滑動，因此b型掃描的結果不再有明顯的弧度，而且均處于焦深范圍內，表現出一致的信噪比。這里需要說明的是：圖3b中的亮帶可見細微波動，主要原因在于插值的誤差和電機驅動的格式轉換誤差，但圖中的亮帶波動峰值在70 um以內，因此依然處于焦深范圍內。圖3 表面包被黑色pvc膠帶的圓柱塊b型掃描結果。a為固定焦點掃描結果，b為滑動焦點掃描結果3.2 小鼠皮下血管成像使用一只26 g的

11、昆明小鼠進行在體實驗證明該方法對皮下血管成像的有效性，實驗使用584 nm的激光激發光聲信號，在這個波長下血液產生的光聲信號比周圍軟組織高出10倍以上5。實驗前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg烏拉坦進行麻醉，對該小鼠的背部同一區域的皮下血管先后進行固定焦點掃描成像和滑動焦點掃描成像，實驗結果如圖4所示，其中a為固定焦點掃描的最大值投影圖，b為滑動焦點掃描的最大值投影圖，可以明顯的看出，a圖左側由于離焦導致血管逐漸模糊，而且信噪比逐漸下降，而滑動焦點的方法可以使得圖像具有均勻的分辨率和信噪比，在最大值投影圖上表現為整個視場內血管清晰可辨。c和d分別為a和b圖中虛線標示位置的b型掃描

12、結果圖，可以清晰的看到由于沿著輪廓掃描，滑動焦點的結果保證了皮下血管均處在焦深的范圍內。圖4 皮下血管掃描結果對比。(a)固定焦點掃描最大值投影圖；(b)滑動焦點掃描最大值投影圖；(c)和(d)分別為(a)和(b)中虛線所示區域的b型掃描結果3.3 大鼠顱下血管成像使用一只140 g的wistar大鼠進行在體實驗證明該方法對顱下血管成像的有效性，實驗依然使用584 nm的激光激發光聲信號。實驗前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg烏拉坦進行麻醉，然后將圖5a黑色方框所示區域的顱骨敲除，對該區域的顱下血管先后進行固定焦點掃描成像和滑動焦點掃描成像，實驗結果分別如圖5b和5c所示，圖5b

13、自上而下血管逐漸模糊，同時伴隨著信噪比逐漸下降，而滑動焦點的方法沿著顱骨的走向移動焦點，從而在整個視場內血管清晰可辨。圖5 顱下血管掃描結果對比。(a)開顱成像區域示意圖；(b)固定焦點掃描結果；(c)滑動焦點掃描結果3.4 荷瘤小鼠皮下血管再生成像對一只背部種有b16黑色素瘤細胞的c57小鼠（體重26 g）進行成像，腫瘤直徑約有1 cm，凸起約有3 mm，同時導致腫瘤周圍皮膚有1 mm左右的起伏。成像前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg烏拉坦進行麻醉，用脫毛膏對腫瘤及周圍區域脫毛，利用滑動焦點掃描的方法對黑色素瘤周圍的皮下血管進行成像，成像結果如圖6所示。雖然肉眼還無法識別成像區

14、域是否已侵染腫瘤，但是從光聲成像的結果可以看出，血管的形狀變得異常，分布也變得雜亂無章，同時信噪比下降，表明腫瘤已經在逐漸侵染這一區域。圖6的右上角為黑色素瘤部位，由于腫瘤部位分泌了非常多的黑色素，導致光聲信號非常強。圖6 腫瘤周圍皮下血管光聲顯微成像結果4 結論本文設計了一種滑動焦點光聲顯微成像方法及系統，并通過模型實驗、在體皮下血管成像和顱下血管成像證明了該方法的有效性，最后展示了這種方法對于腫瘤周圍血管成像的結果。本文提出的方法在獲得輪廓信息時需要人工介入，事實上在實際應用中完全可以根據樣本的信號特點進行計算機擬合，本文提出的方法預留了這種改進的接口函數，可以很方便的實現自動獲取輪廓，但

15、是需要指出的是，由于生物組織的多樣性，很難保證一種計算機擬合方法在所有的樣品上獲得好的效果，因此，人工介入的辦法依然具有很強的實用性。參考文獻1 k. maslov, g. stoica,l. h. v. wang, in vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopyj, optics letters, 2005, 30(6): 625-627.2 k. maslov, h. f. zhang, s. hu, etc, optical-resolution photoacoustic microscopy for in viv

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