1、實驗一 組培 器皿及器械的洗滌、滅菌及環境的消毒一、實驗目的通過實驗，使學生了解并掌握 組織培養用 實驗器皿及器械的洗滌、 滅菌，環 境的消毒方法。二、實驗原理實驗儀器及器械的清洗、消毒和滅菌是組織培養成功的關鍵所在，是外植體 免受污染的前提。由于滅菌劑的種類不同， 所以選擇消毒劑既要考慮良好的消毒、 殺菌作用，同時易被蒸餾水沖洗掉。無菌的環境是植物組織培養成功的前提， 因為絕大多數操作程序要求在無菌 條件下進行。三、實驗操作步驟（一）器皿與用具的洗滌1、玻璃器皿的洗滌新購置的玻璃器皿或多或少都含有游離的堿性物質。 使用前要先用 1%稀 HCL 浸泡一夜，再用肥皂水洗凈，清水沖洗后，再用蒸餾水

2、沖洗 1 次，晾干后備用。 用過的玻璃器皿，用清水沖洗，蒸餾水沖洗一次，干后備用即可。對于已被污染的玻璃器皿則必須在高壓蒸汽滅菌后， 倒去殘渣，用毛刷刷去 瓶壁上的培養液和病斑后，再用清水沖洗干凈，蒸餾水沖淋一遍，晾干備用，切 忌不可用水直接沖洗， 否則會造成培養環境的污染。 清洗后的玻璃器皿， 瓶壁應 透明發亮，內外壁水膜均一，不掛水珠。2、金屬用具的洗滌新購置的金屬用具表面上有一層油膩， 需擦凈油膩后再用熱肥皂水洗凈，清 水沖洗后，擦干備用。用過的金屬用具，用清水洗凈，擦干備用即可。3、每人清洗部分玻璃器皿清水洗凈浸入洗衣粉溶液中洗刷清水反復沖洗蒸餾水淋一遍烘干 備用。對于較臟玻璃器皿的洗

3、滌：采用先堿后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后沖洗干 凈晾干浸入酪酸洗液(一種強氧化劑，去污能力強，配制方法：重鉻酸鉀 40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制濃硫酸)，浸泡時間視 器皿的骯臟程度而定清水反復沖洗干凈蒸餾水淋洗一遍烘干備用。對于帶有石蠟或膠布的器皿：先將其除去，再用常規洗滌，石蠟用水煮沸數 次即可去掉，膠布粘著物則需用洗衣粉液煮沸數小時， 再用水沖洗，涼干后浸入 洗液，以后的步驟同前。(二) 玻璃器皿、用具及環境的滅菌1、玻璃器皿和用具的滅菌(1) 采用干熱滅菌法：將洗干凈晾干后的培養皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖針、解剖刀、鑷 子等金屬器具，用紙包好，放進電熱烘

4、干箱，當溫度升至100C時，啟動箱內鼓風機，使電熱箱內的溫度均勻。當溫度升至150C時，定時控制40min (或120C 定時120min),達到滅菌目的。(2) 采用高壓蒸汽滅菌法：即用手提式高壓滅菌鍋，在1.2個大氣壓下保持1520分鐘。有些如聚丙 烯、聚甲基戊烯等類型的塑料用具也可以進行高溫消毒。(3) 灼燒滅菌：用于無菌操作的鑷子、解剖刀等用具除高壓蒸汽滅菌外，在接種過程中還常 常采用灼燒滅菌，將鑷子、解剖刀等從浸入 95%酉精中取出，置于酒精燈火焰上 灼燒，借助酒精瞬間燃燒產生高熱來達到殺菌等目的。操作過程中要反復浸泡、 灼燒、放涼、使用，操作完畢后，用具應擦拭干凈后再放置。2、環境

5、的消毒(1)地面、墻壁和工作臺的滅菌每次使用前，將配好的20%ff潔爾滅(苯扎溴銨)溶液倒入噴霧器中，對接 種室地面、墻壁、角落均勻地噴霧。在噴房頂時 間，注意不要讓藥液滴入眼睛。 然后開啟紫外燈開關，照射1530mi n, 般紫外線消毒后不要立即進入，應在 關閉紫外燈 15-20min 后進入室內。（2）無菌室和培養室的滅菌 消毒滅菌的方法：首先將房子關閉，定期用甲醛和高錳酸鉀2：1 的比例定期熏蒸滅菌 24h 或用 70%的酒精或 0.5%苯酚噴霧降塵和消毒。 操作時要戴好口罩 和手套，用甲醛與高錳酸鉀配比時要注意避開煙霧， 封閉消毒期間不宜進入消毒 空間。三、 實驗報告1 將本次實驗內容

6、整理成實驗報告。2. 試闡述為什么要對器皿和用具進行嚴格的洗滌和滅菌？實驗二 培養基母液的配制與保存（MS培養基）一、實驗目的通過學習MS培養基母液的配制與保存，掌握培養基母液濃度的換算、配制 與母液的保存方法。二、實驗原理 培養基制備之前，為了使用方便和用量準確，常常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物類、 激素類分別配制成比培養基配方需要量大若干倍的母液。 當制 備培養基時，只需要按預先計算好的量吸取母液即可。三、實驗儀器、用具及試劑（一）實驗儀器、器皿及用具電子天平（感量為 O.OOOIg、0.01g）,燒杯（1000ml, 100ml, 50ml）、量 筒（1000ml，100ml，50

7、ml）、容量瓶（1000ml, 500ml，200 ml，100ml, 50ml）、 棕色或白色廣口瓶（1000ml, 500ml, 200 ml, 100ml）、藥匙、玻璃棒、稱量紙、 標簽、冰箱。（二）試劑MS培養基所需各種試劑、IAA、IBA、NAA 6-BA、2,4-D、GA3、KT、蒸餾 水、重蒸餾水。四、實驗步驟與方法母液的配制是按所使用藥品的類別，而分別配成大量元素、微量元素、維生 素、鈣鹽、鎂鹽和鐵鹽等。配制母液時特別要注意無機鹽成分在一起，可能產生 的化學反應，如CaT和SO42-,Ca2+,Mg2+和PQ3-起溶解后，會產生硫酸鈣或磷酸鈣 的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母

8、液貯存，應分別配制和保存。配制母液時要用雙重蒸餾水等純度較高的水，藥品應采用化學純或分析純 級，藥品的稱量及定容都要準確，各種藥品先以少量蒸餾水使其充分溶解，然后按培 養基一 上的排列順序混合。現以MS培養基（Murashige和Skoog,1962）為例敘述如下：（一）、大量元素母液（濃縮10倍）的配制MS培養基配方中大量元素共有5種（表1-1 ），按照培養基配方的用量，各 種化合物擴大10倍，用電子天平分別稱好，分別用 50ml燒杯稱量，加30-40ml 蒸餾水溶解。5種化合物分別充分溶解后，按 順序混合定容在1000ml量筒中， 注意在混合定容時，一定要最后加入氯化鈣，因為氯化鈣與磷酸二

9、氫鉀形成磷酸 三鈣，磷酸鈣之類是不溶于水的沉淀（也可將鈣鹽與鎂鹽單獨配成母液存放），將配好的定容溶液倒入1000ml廣口瓶中，貼好標簽保存于冰箱的冷藏室中。配置培養基時，每配表 1-1 Murashige1L培養基取此母液100ml。和Skoog大量元素的稱量及定容化合物名稱培養基配方用量（mg/L）擴大10倍稱量（mg）用于定容KNG190019000NHNO3165016500MgSQ 7H2O(無水 MgSO)370 (190)3700 (1900)KHPO1701700CaCl2 - 2H2Q(無水 CaCb)440 (330)4400 (3300)（二）、微量元素母液（濃縮100倍）

10、的配制MS培養基配方中微量元素共有 7種（表1-2 ），按表中稱取用量，用感量為 0.0001g電子天平，分別稱取后，均放入1000ml的一個燒杯中，加蒸餾水溶解， 然后定容到1L容量瓶。貼好標簽，放入冰箱保存。配置培養基時，每配制1L培養基取此母液10ml。表1-2微量元素母液各化合物用量化合物名稱培養基配方用量（mg/L）擴大100倍稱量（mg）用于定容MnSO 4HzO (MnSQ - H2O)22.3(16.9)2230(1690)ZnSQ - 7fO8.6860CuSO 5HQ0.0252.5HBO6.2620NqMoO 2HO0.2525KI0.8383C0CI2 - 6HO0.0

11、252.5（三）、鐵鹽母液（濃縮200倍）的配制目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨配成母液。這種螯合物使用起來方便，比較穩定，又不易發生沉淀。配制方法是：用感 量為O.OIg的電子天平稱取硫酸亞鐵2.78g和乙二胺四乙酸二鈉3.73g分別溶解 在200ml蒸餾水中，兩種溶液混合定容至 500ml，用棕色廣口瓶盛裝，貼標簽， 放入冰箱保存。注意：兩種鹽用熱水分別溶解，然后混合，放置于室溫下10小時 以上看是否有沉淀產生，然后才能使用。配置培養基時，每配制1L培養基取此 母液5ml。（四）、有機物母液（濃縮100倍）的配制在MS培養基中，有機物配方成 份有維生素和氨基酸（

12、表1-3）。按表1-3 中的用量用電子天平進行稱量，分別溶解，混合定容至 100 ml。貼標簽，放入 冰箱保存。配置培養基時，每配制1L培養基取此母液10ml。表1-3有機物母液的稱量化合物名稱培養基配方用量（mg/L）擴大100倍稱量（mg）VB（硫胺素）0.44.0VB （鹽酸吡哆醇）0.55.0(NaOH 溶解)VB (煙酸)0.55.0(NaOH 溶解)肌醇1001000甘氨酸220（五）、生長調節物質（激素）母液的配制（濃度1mg/ml）激素的使用比較靈活，要根據培養的植物種類和目的而定。為了操作方便， 節約時間，激素也可如同配制上述母液一樣，先配成濃縮母液（1mg/ml），這樣 配

13、制培養基時只要稍加計算，按需要量取即可。生長調節物質一般不溶于水，可先用少量不同的溶劑來溶解。 例如，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA ），赤霉素（GA，2, 4-D等生長素和玉米素（Ze） 可先用少量95%酒精助溶，然后再加蒸餾水定容至刻度。激動素（KT）和6-芐 基嘌呤（6-BA）可先溶于少量1mol/L的鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解（見 附表2）。用電子天平分別稱量各種生長調節物質 50mg并先用相應的少量有機溶劑 進行助溶，再加蒸餾水定容至50ml，可得到濃度為1mg/ml的生長調節物質母液, 即配制的母液每毫升含有生長調節物質 I.Omg。貼好標簽，寫明配制的激素濃度， 存于冰箱

14、保存（04C）。配制培養基時，如每升（1000ml）需添加的生長調節劑物質為0.5mg時，則 取0.5ml母液即可。注意：各種母液配制好后應存放在 4C冰箱中，使用中防止污染和沉淀（貯 存溫度過低時會產生針狀結晶），發現有沉淀或霉團時，則不能繼續使用。五、實驗報告1、將本次實驗內容整理成實驗報告。2、制備母液時應注意哪些問題？為什么？3、 根據所給母液濃度、蔗糖、瓊脂用量、PH值，按MS配方計算各種母液 吸取量，填入下表：表1-5按MS配方需要量和母液濃度計算各種母液吸取量并填入下表藥品名稱MS配方需要量母液濃度-配制培養基母液吸取量/ml1000ml500 ml300mlF .曰.: 人量元

15、糸10倍液微量兀素1000倍液鐵鹽5ml/LVB（硫胺素）0.4mg/L1mg/LVB6 （煙酸）0.5mg/L1mg/LVB （鹽酸吡哆醇）0.5mg/L1mg/L甘氨酸2mg/L2mg/L肌醇100mg/L20mg/L2，4-D0.5mg/L1mg/LKT1mg/L0.5mg/L蔗糖20g/L瓊脂8g/L實驗三 MS固體培養基的配制及滅菌、實驗目的通過MS培養基的配制，學習培養基配制與滅菌的操作方法。、實驗原理植物材料培養要獲得成功，并正常生長，培養基的組成成分是一個決定性因 素，不同植物要求不同的培養基，因此，在進行大量工作之前，對不同培養基應 進行分析、比較、試驗，選擇一個符合實驗材料

16、需要的適宜培養基。大多數植物組織培養所用的培養基由無機營養物質、碳源、維生素、生長調 節物質和有機附加物等五類物質組成。、實驗儀器、用具及試劑（一）實驗儀器、器皿及用具移液管（槍）、量筒（50ml、500ml）、電爐（或微波爐）、pH值試紙（或 酸度計）、不銹鋼鍋、培養瓶、標簽、記號筆、高壓滅菌鍋、 燒杯（ 300ml 、 500ml、 1000ml）、封口膜等。（二）試劑配制 MS培養基的各種母液、6-BA（ 1mg/ml）、2, 4-D （1mg/ml）、0.1NNaoH0.lNHCl 、瓊脂、蔗糖、蒸餾水。四、實驗步驟與方法（一）培養基的配制與分裝1、計算各種母液的用量（按配制1000m

17、lMS培養基計算）根據配方計算母液用量,以此配方為例： 1L MS+2, 4-D 1.0 mg/L +6-BA 0.5 mg/L +3%蔗糖+ 0.8%瓊脂, PH=5.8。通過計算得：大量元素（10倍）取100ml、微量元素（100倍）取10ml、有 機物（100倍）取 10ml、鐵鹽（200倍）取 5ml、2, 4-D 取 1.0ml、6-BA取 0.5ml、 蔗糖30g、瓊脂8g。2、每組取 50ml 的燒杯一只,按上述用量用量筒或移液管（不能混用）,量 取或吸取各種母液,放于燒杯中,同時加上激素,備用。3、每組取1000ml的燒杯一只，加300ml蒸餾水，加入瓊脂8g，在石棉網 上加熱

18、熔解，稱取30g蔗糖放入溶解的瓊脂中，同時加入取好的各種母液，用玻 璃棒不斷攪拌混合，并加蒸餾水至 1000ml。4、調整pH:將培養基攪勻，用PH試紙或PH計測其PH值，可用0.1NHCI 或 0.1NNaOH調至 5.8。5、培養基分裝、封口：把配制好的培養基趁熱分裝到培養瓶中，培養基應 占試管或三角瓶的 1/4-1/3 左右為宜；注意不要將培養基沾到管壁上， 以免引起 污染。分裝后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口， 注明培養基的名稱與配制 時間等。（二）培養基的滅菌培養基中含有大量的有機物， 特別含糖量較高， 是各種微生物滋生、 繁殖的 理想場所。 而接種材料需在無菌的條件下培養很長時

19、間， 如果培養基被微生物所 污染便達不到培養的預期結果。 因此，培養基的滅菌是植物組織培養中十分重要 的環節。培養基滅菌的方法有多種，這里主要用的是高壓蒸汽滅菌法。1、高壓蒸汽滅菌法將分裝好的培養基及需滅菌的各種用具、 蒸餾水等，放入高壓滅菌鍋的消毒 桶內，將外層鍋內加水，水位高度不超過支柱高度。蓋好鍋蓋，上好螺絲。加熱 后，當壓力表指針移至0.5kg/cm2，扭開放氣閥排出冷氣，使壓力表指針回復零 位，關好放氣閥門繼續加熱。當指針移至 1.11.2kg/cm 2時，將火調小，保持 該壓力1520min(在121C下保持1520min)，切斷電源，緩慢放出蒸汽，即 達到消毒目的。當壓力逐漸降低

20、到零后，才能打開鍋蓋，從鍋中取出滅菌物品， 放入白磁盤，存放于培養室待用。此時鍋及鍋內物品都很燙，操作時需戴加厚棉 手套。高壓蒸汽滅菌注意事項：(1) 鍋內冷氣必須排盡，否則壓力表指針雖達到一定壓力，但由于鍋內冷 空氣的存在并達不到應有的溫度因而影響滅菌效果。(2) 當達到一定壓力后，注意在保持壓力過程中，嚴格控制時間，時間過 長會使一些化學物質遭到破壞影響培養基成分，時間短則達不到滅菌效果。(3) 三角瓶中的液體不超過總體積的 70%否則當溫度超過100C時，培養 基會噴溢，造成培養瓶和包頭紙的污染。2、干熱滅菌法(1)洗滌。把組織培養的培養皿、三角瓶、試管等玻璃器皿進行徹底清洗。(2)滅菌

21、。把洗滌干凈的玻璃器皿放到烘箱中，在150C溫度下，干熱滅菌1h,或120C 2h。滅菌完畢，待冷卻后取出。五、完成實驗報告1、實驗分組進行，按上述方法每組配制1000 ml培養基(培養基配方：MS+2,4-D 1.0 mg/L +6-BA0.5 mg/L + 3% 蔗糖 +0.8%瓊脂)。先配母液，再配培養 基，火菌，備用。2、高壓滅菌時應注意哪些事項？3、計算下列培養基各種母液的用量(ml)培養基MS+NAAO.mg/L+6-BA1.0mg/L +2% 蔗糖(1000ml)1/2MS+NAA1.5mg/L +6-BA2.0mg/L +5% 蔗糖(1000ml)MS+NAA1.0mg/L+6

22、-BA2.0mg/L +3% 蔗糖(500ml)人量元糸微量元素有機物Fe鹽6-BANAA蔗糖(g)實驗四 外植體的消毒與滅菌一、實驗目的學會外植體的選擇和處理方法，掌握選擇表面滅菌劑的要求，熟練掌握外植 體的滅菌方法、接種前的準備工作和接種技術。二、實驗原理接種用的材料表面，常常附有多種多樣的微生物，這些微生物一旦帶進培養 基，就會迅速滋生，使實驗前功盡棄。因此，材料在接種前必須進行滅菌。滅菌 時，既要將材料上附著的微生物殺死，同時又不能傷及材料。經常使用的滅菌劑有酒精（7075%、次氯酸鈉、過氧化氫、漂白粉、溴 水和低濃度的氯化汞等。 使用這些滅菌劑， 都能起到表面殺菌的作用。 但氯化汞

23、滅菌后，汞離子在材料上不易去掉，必須將材料用無菌水多清洗幾次。消毒劑的種類不同，消毒滅菌的效果不同。因此，選擇消毒劑，既要考慮具 有良好的消毒、 滅菌作用， 同時又易被蒸餾水沖洗干凈或能自行分解的物質。 使 用時需要考慮使用濃度和處理時間。三、實驗儀器、用具及試劑（一）實驗儀器、器皿及用具接種工具、 無菌杯、 燒杯、外植體材料、 培養皿、 培養基、 脫脂棉、手推車、 剪刀、鑷子、洗衣粉、毛筆、工作服、拖鞋、記號筆、香皂。（二）試劑70%酒精、 2.0%次氯酸鈉、 10%次氯酸鈣 ，0.1%升汞、無菌水四、實驗方法步驟1、外植體的采集春夏季節，選擇健壯、 無病蟲害癥狀的外植體。 取材部位最好是幼

24、齡植株的 幼嫩部位。2、外植體的預處理去掉外植體不用的部位； 剩余部分按培養要求剪成大小合適的材料； 將材料 刷洗干凈；置于流水下沖洗 6 24 小時（ 因材料種類不同而定 ）。3、外植體的滅菌：在超凈工作臺上進行。把培養材料放進70%勺酒精中浸泡約30s，再在0.1%的升汞中浸泡lOmin, 或在 10%的漂白粉上清液中浸泡 10l5min ，浸泡時可進行攪動，使植物材料與 滅菌劑有良好的接觸；然后用無菌水沖洗 35 次。（ 1 ）花藥的滅菌用于組織培養的花藥， 按小孢子發育時期要求， 實際上大多沒有成熟， 花藥 外面有萼片、花瓣或穎片、稃片包裹著，通常處于無菌狀態。所以一般用 70%酒 精

25、對整個花蕾或幼穗浸泡數秒， 用無菌水清洗 2或 3次，然后將整個花蕾浸泡在 飽和漂白粉上清液中10min,或2.0%次氯酸鈉消毒10min,或用0.1%升汞處理 5-10min左右，處理后用無菌水清洗 35次，然后剝取組織接種。（2）果實及種子的滅菌根據果皮或種皮的軟硬結實程度及干凈程度而異。對于果實，一般用2%勺次氯酸鈉溶液浸泡10min,用無菌水沖洗2或3次, 然后解剖內部的種子或組織接種；種皮較厚且堅硬 的種子，通常用 10%的次氯酸 鈣或 0.1%0.2%升汞浸泡 2030min 或數小時，或者常規消毒后無菌水浸泡 30min 至數小時。另外也可以用砂布打磨、溫水或開水浸煮 5min

26、左右以軟化種 皮。進行胚或胚乳培養時，可去掉堅硬勺種皮后進行常規消毒。（ 3）莖尖、莖段、葉柄及葉片勺滅菌滅菌方法與花藥勺滅菌方法相同。 對于莖葉， 因為暴露在空中， 且生有毛或 刺等附屬物，所以滅菌前洗滌至關重要，尤其是多年生木本材料，要用洗衣粉、 肥皂水等進行洗滌，然后用自來水長時間流水沖洗（0.52h）,之后用吸水紙將水吸干，再用 70%酒精漂洗。然后，根據材料勺老、嫩和枝條勺堅硬程度，用 1.010%次氯酸鈉溶液浸泡615min,或用0.1%升汞消毒515min,用無菌水 沖洗 35 次，用無菌紙吸干后進行接種。（ 4）根和貯藏器官勺消毒這類材料大多埋于土中, 材料上常有損傷及帶有泥土

27、。 滅菌比較困難。 滅菌 前,要用自來水沖洗, 并用毛刷或毛筆將表面凹凸不平處及芽鱗或苞片處刷洗干 凈,再用刀切去損傷或難以清洗干凈勺部位,用吸水紙吸干后用70%酒精漂洗一下，再用0.10.2%的氯化汞浸泡510min,或用28%次氯酸鈉溶液浸 5 15min,接著用無菌水清洗35次及用無菌濾紙吸干水分，進一步切削與消毒液 直接接觸的外部組織,然后接種。在消毒過程中,進行抽氣減壓,有助于消毒劑 滲入,可使外植體徹底消毒。五、實驗報告1 、如何對外植體材料進行消毒滅菌處理？2、對外植體材料進行消毒滅菌應注意哪些問題？實驗五、外植體的無菌操作技術（接種）、實驗目的通過在超凈工作臺上進行無菌操作訓練

28、， 使學生初步掌握組織培養的無菌操 作技術。二、實驗原理植物組織培養要求嚴格的無菌條件和無菌操作技術。 無菌操作是植物組織培 養的關鍵技術，因為培養基含有豐富的營養物質， 不僅適宜培養材料的生長發育， 更適合微生物的滋生。 一旦微生物接觸到培養基， 就會迅速生長和繁殖， 不僅大 量消耗營養物質， 其繁殖過程中還會形成有毒有害物質直接危害植物組織， 甚至 直接利用和消耗植物材料，導致組織壞死直至失去培養價值。三、實驗材料與用具（一）材料任意一種植物的莖尖。（二）實驗儀器、器皿及用具超凈工作臺、接種工具 （ 主要是剪刀、鑷子、解剖刀等 ） 、植物材料（已滅過 菌）、已配制好的培養基（實驗四）、酒精

29、燈 （或干熱滅菌器）、酒精噴壺 、天 平、脫脂棉、記號筆、白大褂、工作帽、拖鞋等。（三）試劑70%的酒精、 95%的酒精、無菌水、 2%次氯酸鈉四、實驗方法步驟（一）無菌操作前的準備工作1、培養室、無菌操作室的清掃和滅菌 （ 參照實驗二 ）2、配制培養基（參照實驗四）3、培養基、接種工具等滅菌（參照實驗二）（二）打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射3Omin。（三）30min 后，關閉紫外燈。（四）工作人員接種前用香皂洗凈雙手， 一般洗兩次， 于緩沖間內穿上滅菌 的白大褂、 戴上工作帽、換上拖鞋， 將所用物品 （培養基、接種工具、 脫脂棉等） 帶進接種室。（五）用 70%的酒精棉球擦拭（或

30、噴霧）工作臺和雙手。（六）將接種器械及其它所用物品放進工作臺（將初步洗滌及切割的材料放 入燒杯，帶入超凈工作臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分， 取出放置在滅過菌的干燥濾紙上）。（七）接種前先用 70%酒精擦拭（或噴霧）培養瓶，然后解開并拿走培養瓶 封口膜，使培養瓶傾斜，并將瓶口置酒精燈火焰區，轉動瓶口烘烤數秒鐘。（八）左手將培養瓶幾乎水平拿著，用右手拿鑷子夾一塊植物材料（滅過菌 的）送入瓶內，輕輕插入培養基上，再將瓶口置酒精燈火焰區烘烤數秒鐘后，迅 速蓋上封口膜，綁好瓶口。 （ 每人接種 5-10 瓶）。如果是進行培養材料的轉接，對培養材料要進行合理的分割，然后再接種。操作期間

31、應經常用 70%酒精擦拭（或噴霧）工作臺和雙手；接種器械應反復在 95%的酒精中浸泡和在火焰 （或干熱滅菌器） 上滅菌，以防止交叉污染。（九）在培養瓶外標清培養基編號、培養材料、接種日期，送入培養室。（十）接種結束后，清理和關閉超凈工作臺。五、完成實驗報告1、以任意一種植物莖尖為材料，每位同學接種 3瓶，58芽/瓶。接種一 周后，觀察接種材料的污染情況，并分析發生污染的原因。2、無菌操作的技術關鍵是什么？3、接種時應該從哪些方面避免污染？實驗六 園藝植物的莖尖、 莖段培養及微體快速繁殖技術一、實驗目的通過本次試驗，熟練掌握外植體的表面滅菌方法，并鞏固掌握無菌操作的 基本要領， 重點掌握園藝植物

32、的器官的離體培養的基本程序； 同時，掌握園藝植 物微體快繁培養基的設計和配制。二、實驗原理植物莖尖處于比較幼嫩的部位，其細胞具有旺盛的生命力，易于培養而獲 得成功。莖尖培養根據其目的不同， 取材的大小有較大的差異， 較小的僅為十至 幾十微米的莖尖分生組織（獲得無病毒苗） ，較大的可利用幾十毫米的莖尖甚至 更大的芽， 莖尖越大培養越易獲得成功。 如果進行植物快速繁殖， 則采用較大的 莖尖，以帶有葉原基的生長為宜，這樣既能提高成活率，又能加快繁殖速度。三、實驗材料及用具（一）實驗材料 選取品種性狀典型，生長健壯無病蟲的園藝植物（葡萄、楊樹、月季、香石 竹、蘭花）優良單株的嫩莖切段， 也可以用 頂芽

33、或側芽。（二）設備、儀器及用具超凈工作臺、 滅菌鍋、解剖刀、長把鑷子、酒精燈、燒杯、培養皿、移液管、 培養瓶（三）試劑MS 、B5 、White 培養基母液、 70%酒精、 0.1%升汞、 1mg/ml IBA 、1mg/ml 6-BA、 1mg/ml NAA無菌水四、實驗內容1. 實驗材料的篩選與處理2. 外植體的誘導增殖培養3. 無根芽苗的生根培養五、方法和步驟（一）實驗材料的篩選與處理1、培養基的篩選 :通過查閱文獻資料， 根據所選擇的培養材料每小組同學任 選其中一種基本培養基， 并確定添加的激素種類和濃度， 制定用于培養的分化培 養基、繼代培養基和生根培養基。2、培養基 的配制：參照實

34、驗四3、實驗材料的篩選與滅菌處理各實驗小組在查閱文獻資料的基礎上，分別選擇易于培養的任意一種園藝植物的嫩莖切段510cm，除去葉片，流水沖洗1530mins,浸入75%勺酒精消毒1530秒鐘（視材料的幼嫩程度而定）,無 菌水浸洗后用0.1%的HgCI2浸泡810mins,用無菌水浸洗34遍，用消毒的 濾紙吸干表面水分，備用。（二）外植體的誘導增殖培養1、無菌外植體的建立： 在無菌條件下,于超凈工作臺上將莖段切成 0.5 1.0cm的帶節切斷，接種于分化培養基中，每小組接種10瓶，每個培養瓶接種5 6個嫩莖切段，于2426C、20004000lx光照強度下培養，每日光照16h。培 養 15 20

35、 天后，可見一些綠色的芽點和不定芽出現，再培養一段時間后，將出 現叢生苗。2、莖芽的誘導增殖培養： 為了擴大繁殖， 將初次培養獲得的培養物切割成有 23 個芽的芽叢轉入繼代培養基中，每瓶放置34 個芽叢，每小組接種 10瓶，于培養室內培養。3、 無根芽苗的生根培養：待幼芽長至34cm長時，從芽叢基部剪下并切 割分離單個芽，轉接到生根培養基中進行生根培養， 一個月后可形成良好的根系。六 實驗結果與分析1、統計初代培養中外植體材料的培養成活率和接種污染率（每瓶按照接種 外植體數量分別統計） ，并分析造成污染的原因。2、統計繼代培養試管苗的增殖率，并分析激素種類和濃度對試管苗增殖的 影響。分化培養基

36、：MS+6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.02mg/L 。實驗七 花藥的離體培養技術、實驗目的學習植物花藥的采集、滅菌、接種、培養等一整套花藥培養的具體方法。二、實驗原理花藥培養是植物育種的一種有效方法， 即用離體花藥培養的方法， 使其中的 花粉發育成一個完整的植株， 由于花粉細胞的染色體數目僅為花粉母細胞或體細 胞染色體數目的一半， 稱為單倍體植物。通過這一途徑獲得單倍體后再使之加倍， 就能得到大量無分離的純合二倍體， 從而實現對雜種后代的早期選擇， 縮短育種 年限。在單倍體細胞中只有 1個染色體組，表現型和基因型一致， 一旦發生突變， 無論是顯性還是隱性， 均可在當代表現， 從而為準

37、確研究性狀遺傳規律和雜種優 勢的利用打下基礎。因此單倍體是體細胞遺傳研究和突變育種的理想材料。 同時， 有的植物花藥培養還能有效脫除母株所帶病毒，獲得無病毒苗。三、實驗材料與用具（一）實驗材料 蘋果、梨、草莓、小麥、玉米、水稻、楊樹、茄子或油菜等植物的花蕾，根據季節選擇其中23種。（二）設備、儀器及用具超凈工作臺、 滅菌鍋、解剖刀、長把鑷子、酒精燈、燒杯、培養皿、移液管、培養瓶、紗布、塑料袋、三角瓶、冰箱、顯微鏡、醋酸洋紅、載玻片、蓋玻片、 各種滅菌、接種、培養用具和器皿等（三）試劑MS 、B5、White 培養基母液、 75%酒精、 0.1%升汞、 1mg/L IBA、1mg/L 6-BA、

38、1mg/L NAA 無菌水。四、實驗內容每 4 人為一個實驗小組，根據專業特點及開課季節選擇適宜的植物花藥， 完成花藥的預處理、滅菌、接種及培養過程。五、實驗方法和步驟（一）鏡檢確定花粉發育期： 本實驗在培養前先采集處于適宜時期的花蕾利用醋酸洋紅壓片法進行鏡檢， 確定花粉適宜發育時期。（二）材料預處理 采集花粉發育處于單核中期至晚期的新鮮花蕾，用濕紗布包好放入塑料袋， 置于35C冰箱中預處理35天，可提高胚狀體的誘導率。（三）培養基制備以MS或N6為基本培養基，通過查閱文獻資料和了解不同激素對植物花藥培 養的誘導作用，各小組篩選確定 2 種適宜的誘導培養基（蔗糖 3 6%）和 1 種適 宜的分

39、化培養基（蔗糖 3%）（配制方法參照實驗四）。（四）花藥滅菌及接種 花蕾用自來水及蒸餾水沖洗干凈后在無菌條件下用 75%的酒精浸泡 1020s f無菌水清洗f 0.1%升汞溶液滅菌815min無菌水沖洗35遍無菌濾紙吸 干水分f取出花藥接種于誘導培養基中（注意不要破壞花藥），每瓶接種2030 個花藥，每個實驗小組每種誘導培養基接種各 10瓶。（五）初代培養 先將培養瓶置于暗處培養 57 天，再轉入光照培養，光照強度 1500 2000IX,每天光照14h，溫度2528C,以誘導形成胚狀體或愈傷組織。（六）誘導分化及再生當愈傷組織長到23mm寸，將其及時轉入分化培養基，進行植株的分化培 養，誘導

40、再生植株。六 實驗結果與分析1、定時觀察并記錄胚狀體或愈傷組織的誘導情況，統計愈傷組織的誘導率，并比較分析兩種誘導培養基對花藥培養的影響2、觀察并記錄愈傷組織的分化狀態，統計分化率附錄一、酒精稀釋簡便方法原理是稀釋前后純酒精量相等。即：原酒精體積分數X取用體積=稀釋后的體積分數X稀釋后的體積比如原酒精體積分數為95%,欲配成70%酒精。配制方法為：取95%酒精 70ml （稀釋后的酒精體積分數數值），加蒸餾水至95ml （原酒精體積分數數值） 搖勻，即為70%的酒精。附表二、常用生長調節劑物質和維生素特征表名稱縮寫分子式相對分子量溶劑2, 4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenox

41、 yacetic acid )2,4-DC8H6O3CI2221.04乙醇吲哚乙酸(indole-3-acetic acid)IAAC10H9NO2175.181mol/L NaOH3吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)IBAC12H13NO2203.231mol/L NaOHa萘乙酸(anaphthalene acetic acid)NAAC12H10O2186.201mol/L NaOH&苯氧乙酸( naphthoxy acetic acid)性NOAC12H 10。3202.201mol/L NaOH腺嘌吟（adenine）A, Ad, AdeC5H5N5 3H2O18

42、9.13H2O硫酸腺嘌吟(adenine sulphate)AdSO4(C5H5N5)2 H2SO4 2H2O404.37H2O6-芐基腺嘌吟BA , BAP , 6-BAC12H11N 5225.261mol/L NaOH(6-benzyladenine,benzy-laminopurine)異戊烯基腺嘌呤(2-isopentenyl adenine)2ip,IPAC10H13N5203.251mol/L NaOH激動素，動力精（Kinetin）KTC10H9N5O215.211mol/L NaOH玉米素（Ziatin ）ZT,Zt,ZC10H13N5O219.21mol/L NaOH噻苯隆

43、(thidiazuron)TDZ220.2乙醇赤霉素(gibberellin,gibberellic acid)GA 3C19H22O6346.4乙醇脫落酸(abscisic acid)ABAC15H20O4264.31mol/L NaOH秋水仙素（colchicine）C22H25NO6399.4H2O附錄三各種培養基成分表（單位：mg/L）化合物成分培養基White(1963)MS(1962)B5(1966)Nitsch(1969)N6(1974)MT(1969)Heller(1953)ER(1965)RM(1965)KC(1946)NT(1971)Read(1984)MgSO4 7H2o

44、7503702501851853702503703702501233370NaH2PO4 2出019150125CaCl2 2H2O44015016616644075440400220440KCI65750AICI30.03KNO380190025009502830190019001900950202Na2 EDTA 2出037.337.3M oO30.001NH4NO31650720165012004950825400KH2PO417068400170340170250680408NaN03600Na2SO4200(NH 4)2SO4134463500132Ca(NO3)2 4出030010

45、00FeS04 7H2O27.827.827.827.827.827.82527.8Na2 EDTA37.337.337.337.337.337.3FeNa EDTA56MnSO4 4H2o522.3254.422.30.12.2322.37.522.316.9MnSO4 2H2o10KI0.750.830.750.80.830.010.830.83FeCb 6H2O1NiCl2 6H2O0.03CoCl2 6H2O0.0250.0250.0250.00250.0250.025ZnSO4 7H2O38.62101.518.65.68.6CuSO4 5H2O0.010.0250.0250.0250.0250.030.00250.0250.0250.025H3BO31.56.23101.66.