1、蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈

2、螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅

3、襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆

4、袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇

5、蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅

6、薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅

7、薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆

8、蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄

9、蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄

10、蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅

11、螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃

12、螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄

13、螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄

14、袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)

15、袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃

16、薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃

17、薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁

18、薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂

19、蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂

20、蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀

21、螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁

22、螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞

23、螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿

24、裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃?cè)h薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈 緒論一、生化工程的概念biochemical engineering 生化工程：將生物技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室成果經(jīng)工藝及工程開(kāi)

25、發(fā)，成為可供工業(yè)生產(chǎn)的工藝過(guò)程，常稱為生化工程。生物工程的重要組成部分，包括底物或營(yíng)養(yǎng)液的準(zhǔn)備、預(yù)處理、轉(zhuǎn)化以及產(chǎn)品的分離、精制等工程和工藝問(wèn)題。一般把發(fā)酵工程、動(dòng)植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)、酶工程、生化反應(yīng)工程、生物分離工程（下游工程）、生物功能元件（如酶電極）以及生物過(guò)程中的控制和優(yōu)化都包括在生化工程之內(nèi)。二、生化工程的由來(lái)20世紀(jì)40年代，第二次世界大戰(zhàn)中青霉素大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)而誕生了生化工程。美國(guó)科學(xué)家蓋頓關(guān)于通風(fēng)攪拌傳質(zhì)的論文，作為生化工程的誕生標(biāo)志。1959年生化工程雜志biotech&bioengineering創(chuàng)刊。1965年出現(xiàn)第一本生化工程的書biochemical engine

26、ering。三、生化工程的特點(diǎn)1.以生物活細(xì)胞或由細(xì)胞提取出來(lái)的酶為催化劑生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。2.生物反應(yīng)過(guò)程通常在溫和的條件下進(jìn)行，但影響因素多。3.生化反應(yīng)器復(fù)雜，控制參數(shù)眾多。四、生化工程研究的內(nèi)容生化工程是一門邊緣交叉學(xué)科，研究的內(nèi)容非常豐富。生化工程按所處理的對(duì)象分為微生物生化工程、植物生化工程、動(dòng)物生化工程和酶生化工程。生化工程內(nèi)容按對(duì)細(xì)胞處理的方式大致分胞外控制部分和胞內(nèi)控制部分兩大部分。胞外控制部分包括：培養(yǎng)基的滅菌、通氣攪拌、固定化技術(shù)、空氣除菌、比擬放大、產(chǎn)品分離和純化、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵優(yōu)化控制和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等。胞內(nèi)控制部分包括：遺傳育種、代謝控制、培養(yǎng)基平衡等。五、生化工程

27、的發(fā)展兩大躍變第一次躍變：20世紀(jì)40年代抗生素的深層發(fā)酵的實(shí)現(xiàn)。第二次躍變：20世紀(jì)70年代后期分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展。六、今后生化工程重點(diǎn)發(fā)展的四個(gè)方面1.新型生物反應(yīng)器的研究開(kāi)發(fā)，特別是針對(duì)基因工程產(chǎn)品和動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)品的投產(chǎn)研制新型生物反應(yīng)器。重點(diǎn)在于生物安全。植物細(xì)胞對(duì)剪切力和環(huán)境敏感以及培養(yǎng)周期長(zhǎng)而防止污染的問(wèn)題。動(dòng)物細(xì)胞的附壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)。2. 新型分離方法和設(shè)備的研發(fā)，特別是針對(duì)蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品的分離。3.各種描述生物反應(yīng)過(guò)程的數(shù)學(xué)模型的建立，將有利于過(guò)程的控制和優(yōu)化以及計(jì)算機(jī)的應(yīng)用。4.生物反應(yīng)器內(nèi)重要參數(shù)的傳感器的研制和有關(guān)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)硬件及軟件的建立和完善。七、生

28、化工程的應(yīng)用1.醫(yī)藥工業(yè)主要生產(chǎn)人體或動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)生理作用的藥物。如：激素、胰島素、抗生素、干擾素、維生素以及一些高效藥物（tpa等）2.食品工業(yè)傳統(tǒng)的調(diào)味及發(fā)酵食品、醇類飲料、有機(jī)酸、氨基酸、單細(xì)胞蛋白、甜味劑、鮮味劑等。3.化工、冶金工業(yè)生產(chǎn)許多化工原料，有甲醇、乙醇、丁醇、檸檬酸、水楊酸、長(zhǎng)鏈二元酸、丙酮、甘油還有使用微生物合成聚羥基丁酸（phb）塑料和聚羥基脂肪酸酯（pha）。4.能源、環(huán)保微生物發(fā)酵生產(chǎn)甲烷等可再生能源。利用微生物處理污水。八、我國(guó)生化工程研究現(xiàn)狀我國(guó)生化工程研究起步較晚，但發(fā)展很快。初期只涉及生化反應(yīng)器及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究，現(xiàn)已擴(kuò)展到分離工程、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)及生物傳感

29、器及過(guò)程控制的研究。2.5l、5l、10l自控發(fā)酵罐已研制成功，計(jì)算機(jī)在線控制青霉素生產(chǎn)過(guò)程。工業(yè)微生物學(xué)基礎(chǔ)一、 微生物的特點(diǎn)體積小，比表面積大種類多，分布廣生長(zhǎng)旺盛，繁殖快適應(yīng)強(qiáng)，易變異細(xì)胞是生物的基本單位，其結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、其他生物按細(xì)胞結(jié)構(gòu)分類：非細(xì)胞生物（病毒、類病毒等）；原核生物（細(xì)菌、放線菌等）；真核生物（酵母、霉菌、動(dòng)植物等）原核和真核細(xì)胞是細(xì)胞進(jìn)化中的兩個(gè)層次，二者的主要區(qū)別是原核細(xì)胞無(wú)核仁核膜和細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)。二、 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的菌種應(yīng)該符合以下基本要求：（1） 生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，在較短的發(fā)酵周期內(nèi)即可產(chǎn)生大量有價(jià)值的發(fā)酵產(chǎn)物。

30、high yield（2） 發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)價(jià)格低廉、來(lái)源充足、被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的效率高。cheap medium（3） 發(fā)酵副產(chǎn)物少，產(chǎn)品相對(duì)容易分離。less by-products（4） 培養(yǎng)條件易于控制，并具有抗噬菌體感染的能力。easy to control（5） 遺傳特性穩(wěn)定，不易變異和退化。stability of microorganism（6） 對(duì)人、動(dòng)植物和環(huán)境不應(yīng)造成危害。harmless / environmentally friendly目前育種總的趨勢(shì)：從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌自然選育轉(zhuǎn)向代謝育種從誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，藻類和病毒等也正

31、在逐步變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用的生物。盡管如此，目前人們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)還是十分不夠的，已經(jīng)初步研究的不超過(guò)自然界微生物總量的10%。微生物的代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計(jì)已超過(guò)1300多種，而大規(guī)模生產(chǎn)的不超過(guò)100多種。微生物酶有近千種，而在工業(yè)上利用的不過(guò)四五十種，潛力巨大。在工業(yè)生產(chǎn)中常用的微生物主要有細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌。細(xì)菌(bacteria)屬于單細(xì)胞原核生物(unicellular prokaryote)，以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有：枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)、乳酸桿菌(lactobacillus lactics)、醋酸桿菌(acetoba

32、cter)、棒狀桿菌(corynebacterium)、短桿菌(brevibacterium),用于生產(chǎn)淀粉酶(amylase)、蛋白酶(proteinase)、乳酸(lactic acid)、醋酸(acetic acid)、氨基酸(amino acid)、肌苷酸(inosinic acid)。酵母菌(yeast)為單細(xì)胞真核生物(unicellular eukaryote)，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖質(zhì)較多的酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜和植物葉子上，以及果園土壤中。工業(yè)上常用的酵母菌有：啤酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、假絲酵母(candida)、類酵母(sa

33、ccharomycodes)等，用于釀酒、制造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、病毒(virus) 其特點(diǎn)如下：1.形體微小，體積比細(xì)菌小的多。2.沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是一種獨(dú)特分子的生物，主要由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。3.營(yíng)寄生生活，由于缺乏獨(dú)立代謝的酶體系，不能脫離寄主而自行生長(zhǎng)繁殖，有專一性。三、 微生物菌種的分離、選育與保藏1. 微生物菌種的分離spawn isolation發(fā)酵工業(yè)獲得生產(chǎn)菌株的途徑主要有：（1）從自然界分離篩選；（2）向菌種保藏中心、各實(shí)驗(yàn)室索取或購(gòu)置菌株，從中篩選；（3）直接購(gòu)置專利菌種或向生產(chǎn)單位購(gòu)置優(yōu)良生產(chǎn)菌種。從自然界分離新菌種一般步驟：采樣富集分離篩選（1）采樣collecti

34、on定義：根據(jù)微生物的生態(tài)特點(diǎn)從自然界取樣分離所需菌種的過(guò)程。采樣方式一般是除去表土，取離地面5-15cm處的土樣。（并非定律）根據(jù)微生物營(yíng)養(yǎng)類型和生理特點(diǎn)確定采樣地點(diǎn)：飯店肉類加工廠蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌；糕點(diǎn)面粉加工廠淀粉酶產(chǎn)生菌；枯枝落葉爛木頭纖維素酶產(chǎn)生菌；蜂蜜甜果植物汁酵母菌；腐爛果蔬果園土果膠酶產(chǎn)生菌；溫泉堆肥火山灰高溫菌；（2）富集enrichment控制營(yíng)養(yǎng)成分：淀粉（葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨不合適）為唯一碳源產(chǎn)淀粉酶的微生物控制培養(yǎng)條件：通過(guò)熱處理較易分離到產(chǎn)芽孢的細(xì)菌（將樣品經(jīng)80水浴處理10min左右）使用抑制劑：青霉素抑制細(xì)菌和放線菌；放線酮抑制酵母菌和霉菌。（3）分離is

35、olation常規(guī)分離法：傾注平板分離法、涂布平板分離法、平板劃線分離法（最為常用）和組織分離法平皿生化反應(yīng)分離法：利用特殊的分離培養(yǎng)基對(duì)大量混雜微生物進(jìn)行初步分離的方法。分離培養(yǎng)基根據(jù)目的菌特殊的生理特性或代謝產(chǎn)物來(lái)設(shè)計(jì)。如：平皿生化反應(yīng)分離法目的微生物分離培養(yǎng)基透明圈法淀粉酶產(chǎn)生菌淀粉+碘液變色圈法果膠酶產(chǎn)生菌果膠+0.2%剛果紅溶液抑菌圈法抗生素產(chǎn)生菌工具菌：抗生素敏感菌生長(zhǎng)圈法氨基酸、核苷酸和維生素等的產(chǎn)生菌工具菌：某生長(zhǎng)因子的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（4）篩選screening舉例：-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選。2. 誘變育種mutation breeding變異（variation）又稱突變（mut

36、ation），是育種的基礎(chǔ)。l 自然突變（natural mutation）：突變頻率很小l 誘發(fā)突變（induced mutation）：提高突變頻率誘變育種的概念：p17中間段誘變育種的步驟和方法：（1） 出發(fā)菌株的選擇original/stating strain應(yīng)挑選對(duì)誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高的出發(fā)菌株。用作誘變育種的出發(fā)菌株常從以下3類菌株中選取：l 自然界新分離的野生型菌株；l 生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長(zhǎng)期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株；l 每次誘變處理都有一定提高的菌株。（2） 單細(xì)胞菌懸液的制備bacterial suspension目的是為了使出發(fā)菌株細(xì)胞均勻地接觸誘

37、變劑。菌懸液的制備應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：l 新培養(yǎng)的細(xì)胞，生理狀態(tài)同步，處于旺盛的對(duì)數(shù)期；l 菌懸液細(xì)胞處于良好的分散狀態(tài)；l 菌懸液的濃度要適當(dāng)；l 選擇合適的介質(zhì)（生理鹽水或緩沖液）。（3） 誘變劑及其劑量的選擇mutagen誘變劑主要是指某些能引起生物細(xì)胞dna結(jié)構(gòu)改變的物理或化學(xué)因子，其作用是提高變異頻率、擴(kuò)大變異幅度、改變產(chǎn)量。常用的誘變劑mutagenl 物理誘變劑：紫外線、x射線、射線、快中子、離子束等l 化學(xué)誘變劑：堿基類似物：5-溴尿嘧啶（bu）烷化劑：甲基磺酸乙酯（ems）；亞硝基胍（ntg）移碼誘變劑：溴化乙錠、吖啶類化合物脫氨劑：亞硝酸羥化劑：羥胺金屬鹽類：氯化鋰、硫酸錳l

38、生物誘變劑：噬菌體、轉(zhuǎn)座子近期研究發(fā)現(xiàn)，較低劑量比較容易出現(xiàn)正突變菌株。（4） 誘變劑處理方式treatment method單一誘變劑處理復(fù)合誘變劑處理單一誘變劑處理可以減少菌種遺傳背景復(fù)雜化、菌落類型分化過(guò)多的弊病，使得篩選工作趨向簡(jiǎn)單化。缺點(diǎn)是突變率比復(fù)合誘變劑處理要低，突變類型較少。復(fù)合誘變劑處理容易得到更多的突變類型，能導(dǎo)致較大的突變。（5） 突變株的分離與篩選isolation and screening微生物通過(guò)誘變處理，群體中產(chǎn)生各種類型的突變體，有正突變型、負(fù)突變型和穩(wěn)定型。抗性突變株或營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，常用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。高產(chǎn)突變株的篩選較難。3. 原生質(zhì)體融合技術(shù)pr

39、otoplast fusion 概念：p17最后一行 原生質(zhì)體融合可發(fā)生在：不同種屬的細(xì)胞之間、非生殖細(xì)胞之間、2個(gè)以上細(xì)胞融合原生質(zhì)體融合的主要步驟：p18第3段原生質(zhì)體融合進(jìn)行基因重組的優(yōu)點(diǎn)： p18第4段4. 菌種保藏spawn preservation目的：使菌種的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡可能降低，以減少其變異。手段：保持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低水平，缺氧、干燥、低溫、避光保藏方法：方法措施保存期優(yōu)缺點(diǎn)斜面冰箱保藏法斜面，4冰箱低溫保存3-6個(gè)月簡(jiǎn)便；短期過(guò)渡沙土管保藏法沙土，干燥+真空+冰箱數(shù)年簡(jiǎn)便，長(zhǎng)期石蠟油封存法斜面+石蠟油，低溫缺氧數(shù)年簡(jiǎn)便，長(zhǎng)期真空干燥冷凍保藏法低溫+干燥+缺氧5-15年效

40、果好，廣泛適用；設(shè)備、要求嚴(yán)格液氮超低溫保藏法-19620年適用范圍廣，保存期最長(zhǎng)；費(fèi)用高微生物的營(yíng)養(yǎng)微生物的營(yíng)養(yǎng)（nutrition）是指微生物從環(huán)境獲得它們合成自身的細(xì)胞物質(zhì)和提供機(jī)體進(jìn)行各種生理活動(dòng)所需的能量，以及形成代謝產(chǎn)物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的全過(guò)程。一、 微生物的營(yíng)養(yǎng)類型根據(jù)碳源不同，分為自養(yǎng)微生物（autotrophic microorganism）和異養(yǎng)微生物（heterotrophic microorganism）；根據(jù)所需能量不同，分為光能營(yíng)養(yǎng)（phototrophy）型和化能營(yíng)養(yǎng)（chemotrophy）型。上述營(yíng)養(yǎng)型的分類并非絕對(duì)，在自養(yǎng)和異養(yǎng)、光能型和化能型之間都存在中間過(guò)

41、渡類型，成為兼性營(yíng)養(yǎng)型。比如：氫細(xì)菌可以利用氫和co2進(jìn)行自養(yǎng)生活，也可以直接利用有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生活；紅螺菌既可利用光能又可利用化能。微生物的營(yíng)養(yǎng)類型之間沒(méi)有絕對(duì)的界限。二、 微生物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)（一）碳源（carbon source）碳源主要是碳水化合物，如葡萄糖、糖蜜、蔗糖、淀粉等。葡萄糖：活性碳源，微生物可以直接吸收利用。淀粉：惰性碳源，先要經(jīng)過(guò)微生物酶水解形成單糖才能被吸收利用。常用的淀粉原料有玉米、土豆、麩皮、米糠等，近年來(lái)木薯在發(fā)酵工業(yè)上廣泛用于生產(chǎn)酒精、檸檬酸、谷氨酸、賴氨酸等。糖蜜是制糖生產(chǎn)的副產(chǎn)品，含有豐富的糖、含氮化合物、無(wú)機(jī)鹽和維生素等，物美價(jià)廉，是發(fā)酵工業(yè)常用的原料。近年來(lái)

42、，醇類、有機(jī)酸、石油烷烴也常被用作碳源來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)一些特殊產(chǎn)品。比如用烷烴或脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)化工原料長(zhǎng)鏈二元酸。（二）氮源（nitrogen source）有機(jī)氮源：花生餅、豆餅、棉籽餅、菜籽餅、玉米漿、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、魚粉、蠶蛹、酒糟、米糠等。提供蛋白質(zhì)、多肽、游離氨基酸，少量糖類、脂肪、無(wú)機(jī)鹽、維生素和某些生長(zhǎng)因子。無(wú)機(jī)氮源：銨鹽、硝酸鹽、尿素、氨水等，與有機(jī)氮源配合使用往往效果更好。分子態(tài)氮：固氮微生物。（三）無(wú)機(jī)元素（inorganic element）主要功能：（1）構(gòu)成菌體的組成成分；（2）作為酶活性基團(tuán)的組成部分；（3）調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)的ph和氧化還原電位；（4）某些自養(yǎng)菌的能

43、源。6種主要元素：c、h、o、n、p、s大量元素：c、h、o、n、p、s、k、mg、ca、fe微量元素：mn、co、cu、zn、ni等（四）生長(zhǎng)因子（growth factor）微生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可缺少而需要量極少的一類特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括維生素、氨基酸、核苷酸等，以輔酶或輔基的形式參與菌體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的酶促反應(yīng)。許多天然碳源、氮源，比如玉米漿、麩皮、麥糠等含有豐富的生長(zhǎng)因子。三、 微生物的培養(yǎng)基（culture medium）培養(yǎng)基：人工配制的適于微生物生長(zhǎng)繁殖或累積代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。（一）按物理狀態(tài)分類1.固體培養(yǎng)基（solid medium）麩皮、米糠、豆餅粉、花生餅粉 + 無(wú)機(jī)鹽

44、+ 水 白酒廠、釀造廠等生產(chǎn)用溶解的培養(yǎng)液 + 膠凝劑（瓊脂、明膠等） 實(shí)驗(yàn)室用2.半固體培養(yǎng)基（semisolid medium）半固體培養(yǎng)基是在培養(yǎng)液中加入少量的凝固劑（如0.2%0.5%的瓊脂）。這種培養(yǎng)基常用于觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、厭氧菌的分離和菌種鑒定等。3.液體培養(yǎng)基（liquid medium）把培養(yǎng)基成分溶解或懸浮在水中而進(jìn)行液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基。廣泛用于微生物的培養(yǎng)、研究和大規(guī)模生產(chǎn)。（二）按營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源分類天然培養(yǎng)基（complex medium）：動(dòng)植物組織或微生物的浸出物、水解液等，如蛋白胨、牛肉膏、麥芽汁、馬鈴薯、玉米粉、米糠、豆餅粉等。合成培養(yǎng)基（synthetic med

45、ium）：由已知化學(xué)成分及數(shù)量的化學(xué)藥品配制而成，適合于定性定量的研究工作。半合成培養(yǎng)基（semi-synthetic medium）：在天然培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，適當(dāng)添加一些化學(xué)藥品，補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽等不足，使之更能充分滿足微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要。在實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)中使用最多。（三）按用途分類基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basic medium）含有細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可供大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)鑒別培養(yǎng)基（differential medium）在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后會(huì)發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物。例如：伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基（emb培養(yǎng)基，eosin-methylene blue medium）

46、用于檢測(cè)水中的大腸桿菌污染。加富培養(yǎng)基（enriched medium）有利于某種微生物而不利于其它微生物生長(zhǎng)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基（selected medium）在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)以抑制不需要菌的生長(zhǎng)而保證需要菌的生長(zhǎng)，從而在混雜的微生物中選出需要的菌種。配制培養(yǎng)基的原則：（1） 目的明確：實(shí)驗(yàn)or生產(chǎn)？菌種的營(yíng)養(yǎng)類型？（2） 營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)：特別是c:n（3） 條件適宜：ph、滲透壓等（4） 經(jīng)濟(jì)節(jié)約：盡量選用容易獲得、價(jià)格低廉的原料作為培養(yǎng)基成分四、 微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收l(shuí) 被動(dòng)吸收：又稱單純擴(kuò)散，通過(guò)濾過(guò)、滲透、簡(jiǎn)單擴(kuò)散和易化擴(kuò)散（需要載體）等幾種形式，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收進(jìn)入細(xì)胞

47、內(nèi)。這種吸收形式不需要消耗能量。一些分子量低的物質(zhì)，如簡(jiǎn)單多肽、各種離子、電解質(zhì)和水等的吸收即為被動(dòng)吸收。l 主動(dòng)吸收：又稱主動(dòng)運(yùn)輸，必須通過(guò)機(jī)體消耗能量，依靠細(xì)胞載體蛋白來(lái)完成的一種逆濃度梯度的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)形式。是細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要機(jī)制。被動(dòng)吸收和主動(dòng)吸收主要區(qū)別有兩點(diǎn)：主動(dòng)運(yùn)輸需要能量和載體，可以跨濃度梯度運(yùn)輸。被動(dòng)吸收有濾過(guò)、滲透、簡(jiǎn)單擴(kuò)散和易化擴(kuò)散，除易化擴(kuò)散外都不需要載體，但都是順濃度梯度運(yùn)輸，即靠滲透壓來(lái)運(yùn)輸，但都不消耗能量。五、 影響微生物生長(zhǎng)發(fā)育的因素1.溫度微生物的生長(zhǎng)實(shí)際上可以看做是生物體的一系列生物化學(xué)反應(yīng)的有機(jī)組合，溫度是這些反應(yīng)的必須條件。最適溫度是一個(gè)相對(duì)的概念，最

48、適生長(zhǎng)溫度未必最適合微生物的生物合成，反之亦然。2.ph一般霉菌、酵母最適ph為35，細(xì)菌、放線菌6.58。不同生長(zhǎng)階段要求ph值不同，過(guò)程中ph值會(huì)發(fā)生改變（變酸為主），改變的原因是3.通氣（aeration）與攪拌（agitation / stirring）根據(jù)微生物對(duì)氧的需求不同，可將其分為3類：l 好氧微生物：工業(yè)發(fā)酵中應(yīng)用最多l(xiāng) 厭氧微生物：分子態(tài)氧對(duì)其有毒害作用，如丙酮-丁醇產(chǎn)生菌l 兼性微生物：酵母菌有氧生長(zhǎng)繁殖，無(wú)氧發(fā)酵產(chǎn)生酒精發(fā)酵過(guò)程中通氣一般前少后多攪拌能打碎氣泡，增加氣液接觸面積，加速氧的溶解，提高空氣利用率，促進(jìn)微生物的繁殖，但過(guò)度劇烈的攪拌會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液產(chǎn)生大量氣泡，增

49、加污染雜菌的機(jī)會(huì)。4.基質(zhì)濃度菌體生長(zhǎng)速率是基質(zhì)濃度的函數(shù)，常用monod方程來(lái)描述菌體生長(zhǎng)速率與基質(zhì)濃度的關(guān)系：微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)的目的：l 以菌體為產(chǎn)品（如酵母、scp的生產(chǎn)）l 以酶為產(chǎn)品（酶制劑生產(chǎn)）l 除去某物（污染治理）l 獲得代謝產(chǎn)物（酒精、檸檬酸、味精等的生產(chǎn)）l 特定的轉(zhuǎn)化反應(yīng)（酒精轉(zhuǎn)化為醋的生產(chǎn)）一、 微生物的培養(yǎng)方法（一）固體培養(yǎng)設(shè)備簡(jiǎn)單，適于小規(guī)模生產(chǎn)，但勞動(dòng)強(qiáng)度大，產(chǎn)品質(zhì)量不太穩(wěn)定。近年來(lái)固體培養(yǎng)有新的發(fā)展，如用于酒精發(fā)酵等大工業(yè)生產(chǎn)中的厚層通風(fēng)發(fā)酵。（二）液體深層培養(yǎng)生產(chǎn)效率高，便于控制、適于機(jī)械化和自動(dòng)化，是當(dāng)前微生物發(fā)酵工業(yè)中的主要生產(chǎn)方式。（三）載體培養(yǎng)以

50、天然或合成多孔材料為微生物生長(zhǎng)的載體。此法兼?zhèn)涔腆w與液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。載體可反復(fù)使用。從不同的角度也可將培養(yǎng)方法分為l 靜置培養(yǎng)適于厭氧發(fā)酵l 通氣培養(yǎng)適于好氧發(fā)酵l 分批培養(yǎng)（batch culture）l 連續(xù)培養(yǎng)l 半連續(xù)培養(yǎng)二、微生物的分批培養(yǎng)典型的微生物分批培養(yǎng)工藝流程圖（p30圖2-13）（一）種子擴(kuò)大培養(yǎng)目的在于提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。作為種子必須具備下列條件：生長(zhǎng)繁殖快；接種量適宜；生理狀態(tài)穩(wěn)定；無(wú)雜菌；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。1.種子制備的工藝流程p31圖2-142.種子罐的級(jí)數(shù)指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，根據(jù)種子的生長(zhǎng)繁殖速度而定。谷氨酸等氨基酸發(fā)酵所用菌種是細(xì)菌，生長(zhǎng)繁殖速度很

51、快，常采用一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，稱二級(jí)發(fā)酵，即將種子接入種子罐中擴(kuò)大培養(yǎng)后移入發(fā)酵罐；抗生素的生產(chǎn)中，放線菌的生長(zhǎng)繁殖速度較慢，常采用二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，也稱三級(jí)發(fā)酵。一般50m3以上的發(fā)酵罐都采用三級(jí)甚至四級(jí)發(fā)酵。3.種齡和接種量種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。通常以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為宜。接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。大多數(shù)抗生素發(fā)酵的最適接種量為7-15%，棒桿菌生產(chǎn)谷氨酸發(fā)酵中的接種量只需1%。采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵周期，但也不宜過(guò)大，因?yàn)榉N子培養(yǎng)費(fèi)時(shí)，且過(guò)多的代謝廢物會(huì)影響正常發(fā)酵。（二）微生物群體的生長(zhǎng)規(guī)律微生物典型生長(zhǎng)曲線p32

52、圖2-15微生物分批培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線，代表了微生物在新的適宜環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖直至衰老死亡全過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化，根據(jù)微生物生長(zhǎng)繁殖速率不同，可將生長(zhǎng)曲線大致分為延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)階段。1. 延滯期（lag phase）接種后，細(xì)胞往往并不立即生長(zhǎng)繁殖，其細(xì)胞數(shù)在一定時(shí)間內(nèi)無(wú)明顯增加，這一階段稱為延滯期（又稱調(diào)整期或適應(yīng)期）。發(fā)酵工業(yè)中縮短延滯期的措施：使用對(duì)數(shù)期微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；增大接種量；在種子培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分，使菌種加快對(duì)發(fā)酵過(guò)程的適應(yīng)。2. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（log phase）細(xì)胞數(shù)目呈幾何級(jí)數(shù)增加，也成為指數(shù)期。n2=n12n繁殖代數(shù)n=(lgn2-lgn1)

53、/lg2世代時(shí)間=(t2-t1)lg2/(lgn2-lgn1)生長(zhǎng)速率r=n/(t2-t1)=1/對(duì)數(shù)期是發(fā)酵生產(chǎn)中種子的最佳種齡期。3. 穩(wěn)定期（stationary phase）細(xì)胞總數(shù)處于動(dòng)態(tài)平衡，在數(shù)量上處于最高峰，為最佳收獲期，生長(zhǎng)速率為零。許多發(fā)酵產(chǎn)品主要在此階段形成和積累。生產(chǎn)中常采用補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)整ph等措施，延長(zhǎng)穩(wěn)定器，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。4. 衰亡期（decline phase）營(yíng)養(yǎng)成分耗盡，代謝產(chǎn)物大量積累，死亡的細(xì)胞數(shù)增多，活細(xì)胞數(shù)顯著下降，生長(zhǎng)速率為負(fù)。大多數(shù)分批培養(yǎng)都在進(jìn)入衰亡期前結(jié)束。三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture）在微生物培養(yǎng)中不斷

54、放出培養(yǎng)液，同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮培養(yǎng)基，保持微生物恒定的培養(yǎng)條件，有效延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期到穩(wěn)定期的階段，使微生物的生長(zhǎng)代謝處于恒定狀態(tài)，從而達(dá)到增加產(chǎn)量的目的。（一）單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)1. 物料衡算0 + cxv fcx = vdcx/dt加入 生長(zhǎng) 流出 積累式中 菌體的生長(zhǎng)比速率，h-1； cx反應(yīng)器中的菌體濃度，g/l； v反應(yīng)器中培養(yǎng)液體積，l； f培養(yǎng)基流入流量或培養(yǎng)液流出流量，l/h。=f/v=d式中 d流量f與培養(yǎng)液體積之比，稱為稀釋率，表示單位體積培養(yǎng)液的流加量，量綱為時(shí)間-1，即培養(yǎng)液在反應(yīng)器內(nèi)平均停留時(shí)間的倒數(shù)。生長(zhǎng)比速率是微生物的特性，在分批培養(yǎng)中無(wú)法控制，但在連續(xù)培養(yǎng)中只要通過(guò)改變流量

55、f，就可以改變稀釋率，從而改變菌體的生長(zhǎng)比速率。對(duì)限制性基質(zhì)進(jìn)行物料衡算：fcs0 fcs cxv/yx/s = vdcs/dt流入 流出 生長(zhǎng)消耗 積累式中 cs0加料中限制性基質(zhì)濃度，g/l； cs反應(yīng)器中的限制性基質(zhì)濃度，g/l； yx/s對(duì)限制性基質(zhì)的菌體得率系數(shù)，其定義為yx/s=cx/cs在穩(wěn)態(tài)時(shí)，cx=yx/s(cs0-cs)2. 過(guò)程分析找出系統(tǒng)內(nèi)底物濃度、菌體濃度、產(chǎn)物濃度與系統(tǒng)操作參數(shù)的關(guān)系。monod方程：若以菌體為目的產(chǎn)物，則菌體的生產(chǎn)率為生產(chǎn)率p存在一個(gè)極大值，對(duì)應(yīng)最大生產(chǎn)率的稀釋率dm稱為最適稀釋率。（二）具有細(xì)胞循環(huán)的單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)（三）多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)具有多個(gè)串聯(lián)培養(yǎng)

56、器（發(fā)酵罐）的連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)。以獲取菌體或與菌體同步生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物為目標(biāo)時(shí)，只要用單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)即可。若要獲取與菌體生長(zhǎng)不同步的次級(jí)代謝產(chǎn)物，就應(yīng)根據(jù)菌體和產(chǎn)物的生產(chǎn)規(guī)律，采用與之適應(yīng)的多級(jí)培養(yǎng)裝置，第一級(jí)以培養(yǎng)菌體為主，后幾級(jí)則以生產(chǎn)代謝產(chǎn)物為主。如丙酮-丁醇生產(chǎn)。（四）連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量穩(wěn)定；縮短培養(yǎng)周期，提高設(shè)備利用率；減輕勞動(dòng)強(qiáng)度，便于自控。缺點(diǎn)：較易污染雜菌；菌體變異退化的可能性較大；收率和產(chǎn)物濃度比分批式低；設(shè)備要求高。四、補(bǔ)料分批培養(yǎng) 又稱半分批培養(yǎng)或半連續(xù)培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)中補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，但不同時(shí)取出培養(yǎng)液的方法。介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間。可用于以下情況：（1） 發(fā)生底物抑制的過(guò)程。（2） 發(fā)生快速利用碳源而產(chǎn)生阻遏效應(yīng)的過(guò)程。（3） 細(xì)胞高密度培養(yǎng)。（4） 前體補(bǔ)充滅菌技術(shù)為什么要滅菌？（雜菌污染的后果）1. 營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)或產(chǎn)物被消耗損失，造成生產(chǎn)能力下降；2. 雜菌的代謝產(chǎn)物導(dǎo)致提取困難，收率降低，產(chǎn)品質(zhì)量下降；3. 雜菌繁殖導(dǎo)致ph改變，造成生物反應(yīng)異常；4. 噬菌體污染會(huì)使生產(chǎn)菌細(xì)胞裂解，導(dǎo)致發(fā)酵生產(chǎn)失敗。一、滅菌方法滅菌（sterilization）是指利用物理或化學(xué)方