1、常見分子操作基本步驟1、總 RNA 的提?。?BIOZOL 法提?。?12、植物種胚中 RNA 的提?。?CTAB - LiCl提取法） 33、兩步法 RT-PCR 44、瓊脂糖核酸電泳 75、膠回收純化 DNA （AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒） 96、連接（ T 載體連接） 117、連接（ T4 酶連） 128、感受態細胞的制備（大腸桿菌） 139、質粒 DNA 的提?。▔A裂解法） 1510、酶切 1611、Ni 柱純化 His-tag 蛋白質 1711.1非變性條件下抽提 His-Tag蛋白質1711.2 變性條件下從包涵體中純化 His-Tag 的蛋白質 2112、 NTA 樹

2、脂的再生 23201、總 RNA 的提取( BIOZOL 法提取)從植物組織分離RNA的質量至關重要，包括RNA的純度和完整 性。RNA分離的最關鍵因素是盡量減少RNase勺污染。但RNas&舌性 非常穩定，分布廣泛，除細胞內源性Rnase外，環境中也存在大量Rnase。外源性的Rnase存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于 灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的 Rn ase也會造成污染。這些 外源性的Rnase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人 員的手及各種試劑。 而各種組織和細胞中則含有大量內源性的 Rnase。因此在提取RNA時，應盡量創造一個無Rnase的環境，包括去除

3、 外源性Rnase虧染和抑制內源性Rnasd活性，主要是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性Rnase,通過Rnase的阻抑蛋白Rnasin和強力的 蛋白質變性劑如異硫氰酸胍抑制內源性 Rnase (注： BIOZOL 溶液包 含異硫氰酸胍和苯酚，實驗時請格外小心)。在收集到生物材料之后，最好能即刻進行 RNA制備工作。若需 暫時儲存，則應以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80 C冷凍柜。 在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的 方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免 RNase勺作用。步驟：(1) 提取植物組織RNA前，應先將研磨用的器具洗凈； 研磨前用液 氮將所有

4、器具及待用的滅菌EP管預冷，避免樣品潮解；(2) 用液氮將上述組織研磨后迅速轉入預冷的 EP管中，每50100mg組織用1 ml BIOZOL試劑對組織進行裂解，立即混勻，在室溫1530 C下放置5分鐘；(3) 在上述EP管中，按照每1 ml BIOZOL加0.2 ml氯仿的量(1/5體 積)加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下(15 C30 C)放置23分鐘后，12000g (2 C8 C)離心15 分鐘；(4) 取上層水相置于新EP管中，加入等體積異丙醇(每1 ml BIOZOL約加0.6 ml異丙醇)，-20 C放置 1030分鐘，12000g(2 8 ) 離心10分

5、鐘；( 5)棄上清，加 1 ml 75 %乙醇進行洗滌，輕輕混合， 7500g( 2 C8 C)離心5分鐘，棄上清；( 6)讓沉淀的 RNA 在室溫下自然干燥；(7)用 Rnase-free wate溶解 RNA 沉淀。2、植物種胚中 RNA 的提取( CTAB - LiCl 提取法)植物總RNA提取技術是一項植物分子生物學的基本實驗技術， 而 某些植物組織中富含多糖、脂質及酚類物質，往往不利于RNA的分離 和純化，因此 能否有效地去除多糖和脂質是提取高質量植物 RNA 成 敗的關鍵 。 CTAB-LiCl 提取法可在不用液氮的室溫下有效地排除剝 取種胚中大量帶有的多糖和本身脂質的干擾，并進一

6、步滿足 RT-PCR 等實驗的需要，適用于富含多糖和脂質的植物組織 RNA提取。步驟：(1) 在 1. 5 ml EP管中加入 700 啲RNA提取液(2 % CTAB (w/v), 內含2 %5 % PVP (w/v) ,100 mmol/L Tris - HCl (pH8.0), 25 mmol/L EDTA (pH8.0)和2.0 mol/L NaCl，滅菌，使用前加入 憐巰基乙醇使 其終濃度為2 %5 % (v/v)，并置于65 水浴鍋中溫育0.5 h以上；(2) 將滅菌鑷子剝取的水稻種胚直接加入 RNA提取液，滅菌玻璃棒 搗碎，渦旋混合，繼續在65 溫育10 min ;(3) 加入等

7、體積的氯仿+異戊醇，渦旋混勻后4 10000g離心10 min, 用滅菌槍頭小心剔除漂浮的脂肪層,吸取上清；(4) 重復上述步驟,并在合并的上清中加入 1/4體積的10 mol/L LiCl 溶液并混勻，4 條件下過夜，使RNA沉淀；(5) 次日，于4 , 10000 rpm離心20 min,棄上清；(6) 用 Rnase-free wate溶解 RNA;(7) 再加入0.1體積3 mol/L的NaAc和2.5體積95 %乙醇，置于-20 C 環境下30mi n使RNA沉淀；(8) 4 , 10000 rpm再次離心20 min，棄上清，最后用70 %的乙醇 清洗沉淀，吹干后用Rnase-fr

8、ee wate溶解RNA沉淀，保存于-20 C 冰箱中備用。3、兩步法 RT-PCR步驟：第一步：逆轉錄反應( TaKaRa AMV 酶法)(1) 將以下實驗材料 混勻后，離心，65 5 min，立即冰水浴，稍離心，以去除二級結構Reagent （反應物）Quantity, for 20 l a of reaction mixtureOligo (dT)1 h10 mM dNTP mix2 hRNase Free dHO5 h實驗樣品RNA (12 a)2 altTotal10 h /Sample（2）將以下材料混勻，離心，42 2 h,最后95 10min （使AMV 變性），混勻離心后-2

9、0 C保存。ReagentQuantity, for 20 l a of reaction mixture5 AMV buffer4 hAMV0.5 l aRNase Free dO5.5 l 卩Total20 |l /Sample第二步：PCR反應(1)按下列組成在PCR反應管中調制反應液ReagentQuantity, for 20 l 卩 of reaction mixture火菌水14.6 b10 Taq Buffer2 h25 mM MgCI 21.2 I a10 mM dNTP mix0.4 I 卩1上游引物10 pmol/ 口10.3 I 卩下游引物10 pmol/ 口10.3

10、I 卩Taq酶0.2 I 卩cDNA模板1 hTotal20 /Sample(2)按以下條件進行反應rStepTemperature, CTime,minNumber ofcyclesNote1預變性9451r變性940.525-35r退火37-650.5退火溫度比 理論退火溫 度大概低 5 C,再根據 反應結果優 化1延伸72根據擴增產物的大小Taq酶每分鐘延伸1000 bp最終延伸721014、瓊脂糖核酸電泳(1) 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈， 擦干后放在制膠平板上, 封閉模具邊緣，架好梳子；(2) 根據欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂 糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，

11、加入到配膠用的三角燒瓶內，定量加入電泳緩沖液(TBE);(3) 放入到微波爐內加熱熔化。輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液，冷卻片刻(以不燙手為宜)，倒入電泳槽中，待其凝固；(4) 室溫下30分鐘左右凝膠完全凝結，小心拔出梳子，將凝膠安放 在電泳槽內；(5) 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣 品孔內有氣泡，應設法除去；(6) 在DNA樣品中加入6 x體積的載樣緩沖液(loading buffer), 混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內；(7) 接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極 往正極泳動(靠近加樣孔的一端為負)。一般60100V電壓， 電

12、泳2040min即可；(8) 根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；(9) 電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置, 并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍(bp)0.5 %1,00030,0000.7 %80012,0001.0 %50010,0001.2 %4007,0001.5 %2003,0002.0 %50 2,0005、膠回收純化 DNA （AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒）一、實驗準備（1）、第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定體積的無水

13、乙醇。（2）、準備無核酸和核酸酶污染的 Tip頭、離心管。（3）、準備75 水浴。（4）、使用前，檢查Buffer DE-B是否出現沉淀，若出現沉淀，應于70 C溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后再使用。二、操作步驟（1）、在紫外燈下切下含有目的 DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠 表面液體并切碎。計算凝膠重量（提前記錄離心管重量），該重量 作為一個凝膠體積（如100 mg=100 體積）。（2）、加入3個凝膠體積的Buffer DE-A ,混合均勻后于75 C加熱（低 熔點瓊脂糖凝膠于40 C加熱），間斷混合（每2-3 min）,直至凝 膠塊完全熔化（約6-8 min ）。* Buffer DE-A

14、為紅色溶液。在熔化凝膠的過程中，可以幫助觀察凝 膠是否完全熔化。（3）、力口 0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B ,混合均勻；當分離的DNA片段小于400 bp時，加入1個凝膠體積的異丙醇。*加Buffer DE-B后混合物顏色變為黃色，充分混勻以保證形成均一的黃色溶液。(4) 、吸取步驟3中的混合液，轉移到DNA制備管(置于2 ml (試劑 盒內提供)離心管)中，12,000Xg離心1 min。棄濾液。(5) 、將制備管置回2 ml離心管，加500卩l EUffer W1 , 12,000x g離 心30 s,棄濾液。(6) 、將制備管置回2 ml離心管，加700卩B

15、uffer W2 , 12,000X g離 心30 s,棄濾液。以同樣的方法再用 700卩l Buffer W2洗滌一次 12,000X g 離心 1 mi n。* 確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無 水乙醇。* 兩次使用 Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除,消除對酶切反 應的影響。(7) 、將制備管置回2 ml離心管中，12,000X g離心1 min。(8) 、將制備管置于潔凈的 1.5 ml 離心管 (試劑盒內提供 )中,在制備膜中央小心加入25-30 hEluent或去離子水，室溫靜置1 min; 12,000X g離心1 mi

16、n洗脫DNA。*將Eluent或去離子水加熱至65C將提高洗脫效率。三、注意事項(1) 、在步驟 1 中,將凝膠切成細小的碎塊可大大縮短凝膠熔化時間(線型 DNA 長時間暴露在高溫條件下易于水解) ,從而提高回收 率。勿將含 DNA 的凝膠長時間地暴露在紫外燈下,減少紫外線對 DNA 造成的損傷。(2) 、在步驟2中凝膠必須完全熔化，否則將嚴重影響 DNA回收率(3) 、將Eluent或去離子水加熱至65 C,有利于提高洗脫效率。(4) 、DNA 分子呈酸性，建議在 2.5 mM Tris-HCI，pH 8.5洗脫液中保存。流程圖含冇口的DNA凝膠計算凝膠體積加Buffer DE-A.溫浴75

17、QC 化凝膠加泮 0.5 個 Buffer DE-A 體枳的 Buffer DE-B加 500 Hl Buffer W1加 700 川 Buffer W2加 700 川 Buffer W2加25-30山Eluent或丿】離子水熔化滌先FIIIJ洗脫6、連接(T載體連接)經Taq DNA聚合酶擴增后的PCR產物末端都帶有單個A。正是基 于這一原理，pMD19-T質粒經EcoR V切成平端后，在開口端加上一 個T制成T載體，一方面避免了自身環化，另一方面由于 T-A互補，從 而提高了 T載體與PCR產物之間的連接效率。由于 T-A克隆只需純化 PCR產物，因而操作較為簡便。步驟：(1) 在PCR管

18、中加入如下成分:ReagentQuantity, for 10 l 卩 of reaction mixturepMD19-T Vector0.5 1卩Solution I5 hDNA片段4.5 l aTotal10 h /Sample(2)混勻樣品并短暫離心，將離心管置于 4 C連接過夜；連接完的 樣品可直接用于轉化，也可放4 冰箱短期保存。7、連接(T4酶連)(1) 連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度(載體與片段的摩爾比為1:31:5為宜)。(2) 在PCR管中加入如下成分：ReagentQuantity, for 10 l h of reaction mixture10X T4 連接

19、Buffer1 hDNA片段約 0.3 pmol載體約 0.1 pmolT4連接酶0.5 l adH2OAdd up to10 l /Sample（3）混勻樣品并短暫離心，將離心管置于 4 連接過夜（或16 連 接46 hr）;連接完的樣品可直接用于轉化，也可放 4 冰箱短期保 存。8感受態細胞的制備（大腸桿菌）一、菌種純化（1）使用LB平板培養基，用接種針挑取大腸桿菌（-70 C甘油保存 菌），在平板培養基上分級劃線，以能出現單菌落為宜；（2）將上述劃線的平板培養基倒置于恒溫培養箱中 37 C過夜培養。二、菌體培養（1）在劃線平板培養基上挑取單菌落，接菌至1 ml LB培養基中，37 C搖菌

20、過夜。（2）取0.5-1ml過夜培養的菌液轉種到100 ml LB中,37 C（ 180 rpm）震蕩培養，直至OD600達到0.40.5 （約培養4小時），放置冰上停（3）將培養菌體轉移到50 ml離心管中，4 C 4,000 rpm/min離心5 min；同時配置CaCb溶液。（4）棄上清，取10 ml過濾除菌的0.1 mol/L CaCI?溶液重懸菌體沉淀，冰浴 10-15 min，4 C 4,000 rpm/min 離心 5 min。（5）棄上清，沉淀重懸于10 ml過濾除菌的0.1 mol/L CaCl2 15 %甘油（v/v）溶液，冰浴 10min, 4 C 4,000 rpm/m

21、in 離心 5 min。(6) 棄上清，加入2 ml過濾除菌的0.1 mol/L CaCl2 15 %甘油(v/v)溶 液重懸菌體。(7) 以每管100卩的量將菌液分裝于1.5 ml EP管中，液氮冷凍后-80 C 凍存。注意事項(1) 制備感受態所用的離心管、槍頭、細菌過濾器、EP管等均需實驗前滅菌處理；( 2) 整個制備過程均需在冰浴條件下進行 ；( 3) 離 心前離心機應事先預冷 ；(4) 重懸菌體時不可太劇烈，以免影響感受態的轉化效率；( 5) 農桿菌的感受態制備與上述過程大致相同，但培養條件應控制在28 ,且培養基中應加入Rif (利福平)以排除雜菌干擾。三、轉化(熱激法)(1)取1

22、00 口1感受態細胞于 冰浴上融化。加入5 8 口1純質粒或連接產物，輕輕吹打混勻，冰浴10 min。將菌液放入42 C水浴中熱激70秒，立即放入冰浴中2 min。(4) 加入100卩LB培養也，于37 C恒溫搖床上200 rpm搖菌1小時。(5) 將菌體均勻涂布于含適當抗生素的瓊脂平板表面，平板于37 C倒置培養過夜。注：新倒的平板可于37C培養箱中預先放置數小時至過夜干燥。當轉化的是TA克隆連接產物時可在菌液中加入1000X24 mg/ml IPTG和1000X20mg/ml X-gal (避光)以進行藍白斑篩選。四、重組子的篩選和鑒定(1) 取培養過夜的平板，挑取單菌落(藍白斑篩選時挑白

23、斑，同時 可挑取12個藍斑做陰性對照)于 1 ml LB 培養液中， 37 C 搖菌 過夜；(2) 每個樣本取0.5-1.0卩l菌液為模板用PCR法鑒定，每管反應體 系最低可減少至10卩,PCR產物電泳，能得到所需條帶的樣本進 一步提取質粒酶切鑒定或送樣品測序。9、質粒 DNA 的提取(堿裂解法)此方法適用于小量質粒DNA的提取。提取的質粒DNA可直接用于酶 切PCR擴增。(1)、取1 ml培養菌體于2 ml EP管中，12000 rpm離心3分鐘，棄 上清液，使細菌沉淀盡量干燥；(2) 、將細菌沉淀重懸于用冰預冷的100 |溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA p

24、H 8.0， 25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0 )中，吸打 均勻；(3) 、加入200 噺配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH，終濃度1 % SDS(m/v)，先加SDS,),蓋緊EP管口，來回輕輕顛倒離心管，以混 合混合物，確保離心管的整個內表面與溶液 II 接觸，不要渦旋，置 于冰浴中；(打開蓋有絲狀物)(4) 、加入150 l預冷溶液III (每100 ml的溶液川 中含60 ml 5 mol/L乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml出0)，蓋緊EP管口，反復顛倒 數次，使溶液 III 在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于 冰上 23分鐘；(5)

25、、12000 g離心15 min，取上清液于另一新15 ml EP管(注意勿 吸入下層雜質)；(6) 、加入等體積(約400 gl )的氯仿振蕩混勻，于室溫放置2分鐘， 12000溝離心3分鐘；(7) 、取上清用兩倍體積的乙醇沉淀雙鏈 DNA，混合后-20 C放置30 分鐘以上，12000為離心15分鐘；(8) 、去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，再 將附于管壁的液滴除盡；(9) 、加1 ml 70 %乙醇洗滌沉淀，混勻，12,000 離心2分鐘，棄上清， 將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發，直至EP管中內沒有可見的液 體存在(510分鐘)，用適量的ddHzO (二級水)或Rn

26、ase水溶 解；(10) 、電泳或PCR鑒定。10、酶切( 1)酶切前需確定待切樣品的濃度，并選擇合適的限制性內切酶和配套 Buffer。(2)在PCR管中加入如下成分：ReagentQuantity, for 10 l 卩 of reaction mixture10Buffer1 h待切樣品8.5 l a酶0.5 l 卩Total10 h /Sample(3)混勻樣品并短暫離心，將PCR管置于37 中溫育3-4 hr,若待切樣品為PCR產物，則可將反應時間適當延長。(4)用未酶切的質粒作為對照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結果。注：當酶切樣品用于回收而不是鑒定時， 可按比例適當加大反應體積。雙酶切可

27、選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星號反應。11、Ni柱純化His-tag蛋白質11.1非變性條件下抽提His-Tag蛋白質下列方法適用于從細菌中抽提通常含有連續6個組氨酸尾(HisTag Protein)的具有天然結構的可溶性重組蛋白質 (Native Protein)。 其他來源的蛋白質樣品，如果目標蛋白質具有 His-Tag結構，提供的 層析方法可供參考。一、樣品準備(1)準備細胞，接種，誘導表達。對于實驗室用的pET載體表達系列，在細胞OD600=0.5-0.8時，用1mM IPTG誘導1-6小時(也可做 時間進程），可以獲得理想的表達效率。收集細胞，

28、置于 -70 度或立 即進行步驟 2 操作。（2）加入 1/20 細胞生長體積的 NTA-0 Buffer （20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCI , 10 % Glycerol ）和 PMSF。PMSF 用無水乙醇配制成200 mM儲存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作濃度位1 mM ; 注意： PMSF 見水分解,需要在使用前加入。該步驟冰上操作。（3）將細胞懸浮起來，加入溶菌酶（工作濃度位 0.2-0.4 mg/ml，如 果表達的宿主細胞內含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混勻， 冰上放置 30分鐘,超聲破碎細胞（用超聲破碎儀破菌 6次,每次

29、 10 sec,間歇10 sec,電壓200-300 V）。該步驟冰上操作。（ 4） 加入 10% Triton X-100, 使 Triton 的終濃度為 0.05%,充分混勻, 冰上放置 15 分鐘,間或混勻）；冰上超聲破碎細胞,同時降低粘稠 度。（5）加入1M MgCl2，使MgC“的終濃度為1mM，混勻。加入DNase, 使DNase的終濃度為10 mg/ml，混勻，室溫放置10分鐘。（6）12000耳,4度離心。（ 7）重組蛋白質的可溶性鑒定12000%, 4C,離心20 min，取上清（為溶液 A）, 20 C保存；另將沉淀用同樣裂解液1溶解（為溶液B）,同樣20 C保存， 供后繼

30、分析使用。將上述A、B溶液和誘導前后的細菌進行 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色, 比較分析重組蛋白質的溶解性。 如果誘導表達的蛋白質位于 A 溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在 B 溶液中，則為非可溶 蛋白。二、層析（ 1） 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗。（2） 將樣品（步驟 2（6）加到 NTA 層析柱中，流速控制在 15 ml/ 小時左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質的結合情況。 （ 3） 層析用 5 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗，流速控制在 30 ml/ 小時左右。（4）分別用

31、 5 倍 NTA 體積的 NTA-20 , NTA-40 , NTA-60 , NTA-80 , NTA-100, NTA-200 , NTA-1000 Buffer 洗脫，流速控制在 15ml/小時 左右，收集洗脫液，每管收集一個 NTA 體積。（ 5） 確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 BBST 的 Bradford 蛋白質測定試劑盒， 快速確定蛋白質的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質的分布。（6） 目標蛋白質需要進一步純化需要根據蛋白質的用途確定。純化 的目標蛋白質的保存條件需要根據蛋白質的性質和用途確定。 附溶液配方：NT

32、A-0 Buffer:20 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.5 M NaCl, 10 % Glycerol,NTA-20 Buffer:20 mM TisHC_ -midazo-e(#萇) NTA40 Buffed20 mM TisHC_ -midazo-e(#萇) NTAboBuffed20 mM TisHC_ -midazo-e(#萇) NTA80Buffec20 mM TisHC_ -midazo-e(#萇) NTA100BuffepH 79 0.5 MpH 79 0.5 MpH 79 0.5 MpH 79 0.5 MNap10 %Nap10 %Nap10 %Nap10 %G

33、-yceroL 20 mMG-yceroL 40 mMG-yceroL 60 mMG-yceroL 80 mM20 mM TisHC_-midazo-e(#萇)NTArbOOBUffed20 mM TisHC_-midazo-e(#萇)NTA1000 Buffed20m M TisHC_-midazo-e (#萇)pHpHpH79 0.579 0.579 0.5NaCL 10 %NaCL 10 %NaCL 亠 0 %G_yceOL soG_yceOL 200G-yceroL 1000mMmMmM11.2 變性條件下從包涵體中純化 His-Tag 的蛋白質有些蛋白質細菌或其他細胞中表達效率很高，

34、 但溶解性很差， 通 常形成包涵體。這些蛋白質的溶解通常需要用鹽酸胍或尿素。 與 MBP 和 GST 的親和層析材料相比， NTA 樹脂可以在 6 M 的鹽酸胍存在的 情況下與具有His Tag的蛋白質結合。整個層析過程都是在有鹽酸胍 的條件下進行。 純化后的蛋白質需要進行復性， 正確復性的蛋白質才 具有生物學活性。下列方法（步驟 4-5）用于從細菌中抽提含 His-Tag 位于包涵體 變性蛋白質。一、樣品準備（ 1） 準備細胞，接種，誘導表達。對于實驗室用的 pET 載體表達系 列，在細胞OD600=0.5-0.8時，用1mM IPTG誘導1-3小時，可以獲 得理想的表達效率。收集細胞，置于

35、 -70度或立即進行步驟 2操作。（2）加入 1/20 細胞生長體積的 GuNTA-0 Buffer （20 mM Tris-HCl pH 7.9,0.5 M NaCI ,10 % Glycerol, 6 M Guanidium HCl ）和 PMSF。PMSF 用無水乙醇配制成200 mM儲存液，-20度或4度保存；PMSF使用 的工作濃度位1 mM ;注意：PMSF見水分解，需要在使用前加入。（3）將細胞懸浮起來,冰上超聲破碎細胞,降低粘稠度。（4）室溫放置 30 分鐘,間或混勻或用磁力攪拌。（5）12000 g, 4度離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20度 保存。、層析（ 1）

36、 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 GuNTA-0 Buffer 洗。（2） 將樣品（步驟 2（5）加到 NTA 層析柱中，流速控制在 15 ml/ 小時左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質的結合情況。層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/ 小時左右。（4）分別用 5 倍 NTA 體積 GuNTA-20， GuNTA-40， GuNTA-60， GuNTA-100 , GuNTA-500洗脫，流速控制在15 ml/小時左右，收集 洗脫液，每管收集一個 NTA 體積。（5）確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE 分析。也可以用 BBST 的 Bradford 蛋白質測定試劑盒， 快速確定蛋白質的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質的分布。（6）目標蛋白質需要進一步純化需要根據蛋白質的用途確定。（7）純化的目標蛋白質需要復性，復性常用的手段可以參考有關手 冊確定的原則，根據蛋白質的特性來摸索具體的方案。附溶液配方：GuNTA-0 Buffer:20 mM