1、辣根過氧化物酶標記抗體技術及應用進展,2,實驗原理,1）免疫標記技術 免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統中抗原或抗體的性質與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的免疫檢測技術被稱為3大免疫標記技術。目前，使用的免疫標記物還有化學發光物質、鐵蛋白和膠體金等,2）辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體的原理 a. 辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP廣泛分布于植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18。HRP由多

2、個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為pH39，酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58以下的硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。 HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2H2O2D2H2O,4,b. 辣根過氧化物酶標記方法 酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。 辣根過氧化物酶的標記常用過碘酸鹽

3、氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結合。后者可進一步用NaBH(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體,5,在酶標過程中一般都混有未結合的酶和抗體。游離酶理論上不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此需要對制備的酶結合物進行純化，去除游離的酶和抗體。純化的方法很多，硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想。用離子交換層析、分子篩法可得到最佳的分離效果，但費用較貴,6,四 操作步驟 （1）稱取5mgHRP溶解于0.5ml蒸餾水中。 （2）向溶液中

4、加入0.5ml新配的0.1M NaIO溶液，混勻， 4靜置30分鐘。 （3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混勻， 靜置30分鐘。（4）加入含5mg抗體的水溶液1ml，混勻裝入透析袋，pH9.5 碳酸鹽緩沖液透析，4過夜,7,5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH液，混勻，再置4 , 2h。 （6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4 1h。 （7）3000 r/min 離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15 moL/L pH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離

5、子后(用萘氏試劑檢測)，10,000 r/min 離心30 min 去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存,8,酶制劑及其底物,凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的 酶應滿足下列要求：(1)來源方便，易于純化；(2)比活性高，性質穩定；(3)酶活性和量能 用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶 (AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等,9,由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩定，分子量小，純酶容 易制備，所以最常用。HRP廣泛分

6、布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕 色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等 電點為PH39,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和 58以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一 般以OD403nm OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應 在3.0左右(最高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活 性，如當酶變性后，RZ值仍可不變,10,HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2

7、O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型 染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下: HRP DH2H2O2D2H2O 供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。如DAB(3.3二氨基聯苯胺)的反應產物為 不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早 期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現已很少應用。OT(鄰聯 甲苯胺)的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且 由于產物不穩定，需要在短時間內進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD (鄰苯二胺)和TMB(四甲基

8、聯苯胺)。前者形成的產物為深桔黃色或棕色，后者產物為藍綠 色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近于無色，靈敏度上據報道后者比前 者可高4倍以上,11,另外，還有一種供氫體稱ABTS2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺 酸)，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面， ABTS與TMB皆是值得被優選的供氫體。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應 控制在經較短時間反應后呈色即達高峰（說明HO已消耗殆盡）。這樣即使再延長時間 也不會增加反應產物的顏色,12,HRP標記抗體的方法,酶與抗體交聯的方法有

9、許多種,根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結 合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用,13,戊二醛二步法,1.原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共 價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物,14,2.標記步驟,1)稱取HRP25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。 (2)反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml1分 鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪 拌。 (3)將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌

10、下逐滴加入酶溶液中。 (4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3?小時,15,5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。 (6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置41小時。 (7)3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于 少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用 萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保 存,16,3.結果判定,1)定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免

11、疫球蛋白抗體)作 雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。 最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選 擇,17,2)定量和克分子比值測定,2)定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。 酶量(mgml)OD403nm0.4 IgG量(mgml)OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62 酶量(mgml) IgG量(mgml) 酶量 克分子比值 4 40,000 160,000IgG量,18,注意事項,1）為提高標記效率，應嚴格掌握整個反應體系中9的抗體含量。 （2）碘酸鈉要新鮮配制。 （3.）室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液,19,注意事項,4）在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高,效價高(最低116),純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要