1、試驗菌濃菌液貯藏周期驗證方案文件編碼：項 目姓 名簽 名日 期起 草審 核審 核批 準生效日期年 份 試驗菌工作菌貯藏周期驗證目錄1、試驗菌濃菌液貯藏周期驗證計劃2、試驗菌濃菌液貯藏周期驗證小組名單3、試驗菌濃菌液貯藏周期驗證方案4、試驗菌濃菌液貯藏周期驗證培訓記錄5、試驗菌濃菌液貯藏周期驗證附屬記錄6、試驗菌濃菌液貯藏周期驗證報告7、試驗菌濃菌液貯藏周期驗證合格證書試驗菌濃菌液貯藏周期驗證計劃根據我公司認證領導小組的要求及驗證委員會的安排，對試驗菌濃菌液貯藏周期進行驗證，具體安排如下：一、2012年03月01日2012年03月02日，制定驗證方案，由試驗菌濃菌液貯藏周期驗證小組組長負責起草。

2、二、2012年03月03日2012年03月04日，驗證方案討論、修改、審批和培訓。三、2012年03月05日2012年03月20日，驗證工作實施。 四、2012年03月21日2012年03月22日，根據驗證情況與記錄，書寫驗證報告。五、2012年03月23日2012年03月24日，驗證報告審核批準，合格證發放。試驗菌濃菌液貯藏周期驗證小組名單組 長： 成 員： 1、 目的驗證試驗菌濃菌液在28貯藏條件下保存期限。2、 適用范圍適用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的濃菌液貯存周期驗證。3、 內容1. 概述微生物檢查試驗中，試驗菌的制備至關重要

3、，加入菌量的都少直接影響檢測結果。而中華人民共和國藥典2010年版二部對試驗菌的制備和菌量都提出了明確的要求，并對試驗菌菌液貯藏條件都有嚴格規定。為保證微生物檢測實驗的準確性，需要對濃菌液的貯藏時間和貯藏條件進行驗證。 2. 驗證項目及認可標準試驗菌 項目貯藏條件菌落計數結果金黃色葡萄球菌2850100cfu/ml大腸埃希菌2850100cfu/ml枯草芽孢桿菌2850100cfu/ml生孢梭菌2850100cfu/ml銅綠假單胞菌2850100cfu/ml白色念珠菌2850100cfu/ml黑曲霉2850100cfu/ml3. 驗證依據中華人民共和國藥典2010年版二部4. 驗證方法與內容4

4、.1. 驗證方法：平皿計數法4.2. 驗證內容4.2.1. 環境條件要求：所有檢查在環境潔凈度10000級下的局部100級潔凈度的單向流空氣區（生物安全柜）內進行，其全過程嚴格遵守無菌操作，能防止微生物再污染。4.2.2. 儀器設備：實驗中所用的玻璃儀器及金屬器皿在使用前均經過121濕熱滅菌至少30分鐘。名稱生產廠家型號校驗情況生化培養箱電熱恒溫培養箱自動臺式滅菌器電子天平數字酸度計生物安全柜4.2.3. 驗證前準備：a. 驗證用試驗菌 均來自貴州省藥品檢驗所試驗菌 項目試驗菌編碼代數接種日期金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌銅綠假單胞菌白色念珠菌黑曲霉b. 培養基的制備：名稱生產廠

5、家批號配制批號營養肉湯培養基硫乙醇酸鹽流體培養基改良馬丁培養基營養瓊脂培養基改良馬丁瓊脂培養基以上培養基按照說明書配制后灌裝于潔凈的容器中，加塞，按經過驗證合格的滅菌程序進行滅菌，培養基的適用性檢查應符合規定。c. 稀釋液的制備： 0.9無菌氯化鈉溶液：取氯化鈉9.0g，加水溶解至1000ml，121滅菌20min。 0.05聚山梨酯80無菌氯化鈉溶液：取土溫80 0.5ml，加0.9無菌氯化鈉溶液至1000ml，121滅菌20min。d. 菌原液制備： 將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物分別接種至營養肉湯培養基中，經30-35培養18-24小時。 將生孢梭菌

6、的新鮮培養物接種至硫乙醇酸鹽流體培養基中，經30-35培養18-24小時。 將白色念珠菌的新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中，經23-28培養24-48小時。 接種黑曲霉的新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，2328培養57天，加入35ml含0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，備用。e. 新制備原菌液計數 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌的菌原液，用稀釋液0.9無菌氯化鈉溶液，以十倍遞增稀釋法制備菌液。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌用營養瓊

7、脂培養基計數；生孢梭菌用硫乙醇酸鹽流體培養基計數；白色念珠菌用改良馬丁瓊脂培養基計數。 取黑曲霉孢子懸液，用稀釋液0.05聚山梨酯80無菌氯化鈉溶液，以十倍遞增稀釋法制備菌液，用改良馬丁瓊脂培養基計數。f. 保存條件的確認 將上述原菌液及各稀釋級別菌液包扎好后，置冰箱（2-8）保存，原菌液一定時間計數一次，計數方法嚴格同上，使操作帶來的誤差減少到最少。g. 各項計數結果見驗證報告。 5. 組織實施5.1. 驗證機構的組成5.1.1. 公司驗證委員會，負責所有驗證工作的領導和組織、審批驗證方案和驗證報告、發放驗證證書。5.1.2. 試驗菌濃菌液貯藏周期驗證工作小組，負責該驗證項目的驗證方案起草、

8、實施、組織與協調實施，負責驗證樣品檢測，完成各項記錄，根據檢驗和確認結果進行評定、完成驗證報告。部門部門職責責任人工作劃分質量部方案起草、實施、書寫報告操作實施質量部取樣、檢驗、出報告操作實施驗證委員會方案審定、批準、實施、發放驗證合格證方案審核方案批準4、 附件及相關表格文件試驗菌濃菌液貯藏周期驗證報告文件編碼：項 目姓 名簽 名日 期起 草審 核審 核批 準生效日期年 份1、 驗證概述由于中華人民共和國藥典2010年版二部對試驗菌的制備和菌量都提出了明確的要求，并對試驗菌菌液貯藏條件都有嚴格規定。為保證微生物檢測實驗的準確性，對濃菌液的貯藏時間和貯藏條件進行驗證，以規范實驗室試驗菌的制備和

9、使用。 1. 驗證組織與實施1.1. 驗證小組成員及職責分工部門部門職責責任人工作劃分質量部方案起草、實施、書寫報告操作實施質量部取樣、檢驗、出報告操作實施驗證委員會方案審定、批準、實施、發放驗證合格證方案審核方案批準1.2. 本驗證由質量部負責并由相關人員根據試驗菌濃菌液貯藏周期驗證方案所規定的方法與步驟實施。2. 實施時間為：年月日年月日。2、 各項目驗證結論1. 新制備原菌液計數結果菌液名稱稀釋度稀釋日期計數（cfu/ml）計數日期結果判斷平皿1平皿1平均數金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉操作人：復核人：2. 濃菌液貯藏期間菌落計數結果2.1. 金

10、黃色葡萄球菌貯藏日期稀釋度稀釋日期計數（cfu/ml）計數日期結果判斷平皿1平皿1平均數操作人：復核人：2.2. 銅綠假單胞菌貯藏日期稀釋度稀釋日期計數（cfu/ml）計數日期結果判斷平皿1平皿1平均數操作人：復核人：2.3. 大腸埃希菌貯藏日期稀釋度稀釋日期計數（cfu/ml）計數日期結果判斷平皿1平皿1平均數操作人：復核人：2.4. 枯草芽孢桿菌貯藏日期稀釋度稀釋日期計數（cfu/ml）計數日期結果判斷平皿1平皿1平均數操作人：復核人：2.5. 生孢梭菌貯藏日期稀釋度稀釋日期計數（cfu/ml）計數日期結果判斷平皿1平皿1平均數操作人：復核人：2.6. 白色念珠菌貯藏日期稀釋度稀釋日期計數（cfu/ml）計數日期結果判斷平皿1平皿1平均數操作人：復核人：2.7. 黑曲霉貯藏時間稀釋度稀釋日期計數（cfu/ml）計數日期結果判斷平皿1平皿1平均數操作人：復核人：3、 建議、結果分析和驗證總結1. 建議 1.1. 加強生測室檢驗人員的操作技能培訓，使試驗菌濃菌液的制備過程標準化，程序化。2. 結果分析及驗證總結2.1. 根據上述驗證過程及