分離分析新技術在天然藥物研究中的應用,馬建蘋,Tel:(O) E-mail:,超臨界流體萃取技術,一.基本原理,1. 超臨界流體的特性,(1)被提取物的性質(2)壓力的影響(3)溫度的影響(4)夾帶劑的影響,2. 超臨界CO2流體的溶解性能,3.超臨界CO2流體萃取的優勢,(1)防止熱敏性物質可能產生的氧化和分解,保持各組分的原有特性。(2)無溶劑殘留問題。(3)實現選擇性提取。(4)提取較完全。(5)儀器聯用,實現高效、快速、準確分析。(6)CO2超臨界流體適合于工業化生產。,萃取釜減壓閥分離釜加壓泵,4.超臨界CO2流體萃取設備簡介,蜂膠的SFE純化流程,(1)萃取壓力(2)萃取溫度(3)CO2流量(4)萃取時間(5)粒度(6)夾帶劑,二.超臨界CO2流體萃取工藝的影響因素,1.超臨界CO2流體萃取穿心蓮有效成分功效：清熱解毒、消腫止痛。有效成分：二萜內酯類化合物(穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、去氧穿心蓮內酯)傳統方法： 水提法：ChP1990淘汰 醇提法：熱浸：得率較高、有效成分容易分解或聚合、雜質較多 冷浸：質量較好、雜質少、有效成分不分解、生產周期較長超臨界CO2流體萃取法：所得有效成分含量較高、具有該藥的天然香味,三.超臨界流體萃取在天然藥物提取中的應用,穿心蓮不同提取方法所得浸膏的質量比較,2.揮發油的提取傳統提取方法的缺點：易造成揮發油的分解或氧化等； 收率普遍較低實例：月見草油 SFE提取, 25 MPa, 50 萃取率 20% -亞麻酸 10.6% 色澤與透明度 -亞麻酸 杏仁油： SFE與石油醚提取工藝比較 收油率是后者的2.5倍 薄荷揮發油： 23 MPa, 55 加7% 乙醇夾帶劑 薄荷醇收率 0.16% 比水蒸汽蒸餾法 高 3倍 比有機溶劑法 高0.6倍,優于溶劑法,四.超臨界流體萃取技術展望,(1)成本上難以與傳統提取工藝競爭(2)對許多強極性和分子量較大的成分很難進行有效地提取(3)基礎研究比較薄弱(4)需要結合傳統中藥所要求的藥效來考察有效成分是否被萃取出及性能是否穩定(5)考慮中藥成分的協同和互溶作用,大孔樹脂吸附分離技術,一.大孔吸附樹脂的結構、原理和特點,1. 大孔吸附樹脂的結構、原理及種類(1)結構 新型非離子型高分子聚合物吸附劑 白色球形顆粒 20-60目 具多孔性 聚合單體 苯乙烯 交聯劑 二乙烯苯 致孔劑 甲苯、二甲苯(2)分離原理 吸附性和篩選性相結合 (3)大孔樹脂的種類 按化學結構分為以下四類： 非極性 如苯乙烯、二乙烯苯聚合物 中極性 存在極性基團COOR,具有一定的極性 極性 含硫氧、酰胺、腈等基團 如丙烯酰胺 極性大于酯基 強極性 如吡啶基、氨基等,一些代表性的大孔吸附樹脂,2. 大孔吸附樹脂的特點(1)分離性能優良 選擇性良好 分離效能高 脫色能力強(2)理化性質穩定 穩定性高 機械強度好 經久耐用 避免環境污染和對設備的腐蝕(3)應用范圍廣 與離子交換樹脂相比 pH不變 發酵液分離抗生素(4)使用方便 流體阻力小(5)溶劑用量少 避免乳化現象 提高提取效率(6)可重復使用 再生容易(7)其他方面 價格較貴 吸附效率易受流速和溶質濃度的影響 品種有限 操作較復雜 對樹脂的技術要求較高,二.大孔吸附樹脂吸附分離技術要求,大致操作步驟：樹脂預處理樹脂上柱藥液上柱樹脂的解吸 樹脂的清洗、再生樹脂預處理：加甲醇或丙酮浸泡24小時，加熱回流洗脫裝柱：蒸餾水濕法裝柱，乙醇流動清洗，大量蒸餾水清洗,藥液的上柱吸附：（1）泄漏曲線與吸附容量的考察（2）藥液上柱前的預處理（3）上柱工藝條件的選擇 樹脂自身特性、樣品濃度、pH值、吸附柱徑高比、上樣流速（4）樹脂的解吸 樹脂的清洗、再生： 無水乙醇或95乙醇洗至無色，大量水洗去醇,三.大孔吸附樹脂技術 在天然藥物提取純化中的應用,在天然藥物有效成分的提取、純化領域大有用途：1.許多提取成功的單味中草藥，奠定良好的基礎2.不斷有新型的吸附樹脂問世到目前為止,已成功用于黃酮類、皂苷類、生物堿類、酯類、萜類等成分的分離,1.黃酮類藥物的提取,實例：銀杏葉提取物 （GBE） 主要有效成分 黃酮苷 萜內酯 溶劑萃取法 24 6 樹脂吸附法 Amberlite XAD-7 30 未達標 Duolite-761 達標 達標 ADS-F8 6065 2530,其他中草藥：毛冬青根、山楂、葛根、黃芩根、苦蕎麥、沙棘等,2.皂苷類藥物的提取,實例：絞股藍皂苷 研制出強極性吸附樹脂ADS-7、S-038 S-038，吸附量達65.5 mg/ml，70乙醇洗脫,人參皂苷 吸附和脫色雙重作用 ADS-7 ，70乙醇洗脫，粗品（棕色） 白色或微黃色,實例：絞股藍皂苷 絞股藍：葫蘆科植物絞股藍的根狀莖或全草，多年生草質藤本植物 功效：鎮咳、清熱解毒有效成分：皂苷、黃酮類、多糖類 “綠色的金子” “第二人參” “人參寶草”提取工藝：絞股藍干莖葉 熱水浸提 浸提除雜 樹脂吸附乙醇解吸 脫色 濃縮干燥 粉碎 絞股藍皂苷粉末,7-8倍熱水浸提三次,調節酸堿性靜置除雜,DA大孔樹脂水洗除雜,50%乙醇70%乙醇,DB樹脂,真空干燥,80-100目,3.生物堿的提取,實例：喜樹堿 弱堿 AB-8 pH 8，鹽濃度(1-2.5)mol/L, 吸附量達160 mg/g,小檗堿 堿性大 水溶性大 10%H2SO4, 10%NaOH, 非極性吸附樹脂 小檗堿含量為原生藥含量的97%,4.影響大孔樹脂分離純化天然藥物效果的因素,(1)樹脂性質 吸附容量大 吸附速度快 機械強度好(2)藥液pH 酸性物質易在酸性溶液中被吸附 堿性物質在堿性溶液中被吸附(3)藥液濃度 符合Frendich 和 Augmur經典吸附式 (4)上柱液溫度 室溫(5)鹽濃度 無機鹽的加入降低了吸附質在介質內的溶解度(6)樹脂柱徑高比 合適的徑高比為分離提供較高的柱效(7)樹脂柱的清洗 非吸附性成分 水 吸附性雜質 一定濃度的酸或堿液(0.1-1.0 M NaOH 或 HCl) (8)洗脫液的選擇及解吸,制備色譜技術,色譜技術：有效成分的定性與定量工作開發出療效好、質量指標明確的中藥新藥,一.色譜技術的基本原理,按照分離過程的原理不同分為：吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜親和色譜,二.制備色譜工藝流程單色譜柱：最簡單、最為常用，能分離復雜組分的混合物 溶劑消耗量大，回收溶劑的能耗高模擬移動床色譜：分離效率高、溶劑消耗低、便于連續操作 設備復雜、工藝要求高柱切換、移動進料和移動接口色譜等： 實現復雜組分分離、大大提高吸附劑生產率、 減少溶劑消耗、減少設備投資和操作費用,三.常用的制備色譜工藝,1.薄層色譜 操作簡單、費用低廉、應用廣泛新型薄層色譜法 離心制備薄層色譜 （PCLC）旋轉離心、連續洗脫的圓形色譜技術，分離效果優于常規的制備薄層色譜和柱色譜獨特的優點： 對固定相不會造成損壞 裝填容量、分離速度和分離效能得到極大提高,實例：龍膽屬植物 Sstrictiffora 甲醇提取物 bellidifolin 和 desmethylbellidifolin 離心薄層色譜法 聚酰胺開口柱色譜 30 min. 12hr.,2.柱色譜特殊的柱色譜：（1）干柱色譜干法裝填上樣洗脫推出、切割譜帶溶劑萃取特點：溶劑消耗很少，操作迅速（1530min）（2）真空液相色譜 (VLC)抽真空裝柱低極性溶劑沖柱上樣洗脫收集餾分、抽干特點：操作簡便、處理量大（一次可達30g）,3.壓力液相色譜 (PLC)閃蒸色譜 (約0.2 MPa) 價格低廉、操作方便低壓液相色譜 ( 2.0 MPa) 分離效率高、應用范圍廣實例：銀杏內酯A、銀杏內酯B、白果內酯的分離純化硅膠H柱 (10-40 m) 流動相：乙酸乙酯石油醚（8：2）(5) 超臨界流體色譜 介于液相色譜和氣相色譜之間的色譜方法特點：分離速度快、產品易回收、應用范圍廣、有可能替代正相HPLC,4.離子交換色譜固定相：離子交換樹脂 可再生性和重復使用性交換功能基團：陽離子和陰離子形態：凝膠型（水溶脹）和大孔型（永久性微孔）特點：使用方便、成本低廉、重復使用性好、分離速度快應用范圍：生物堿、糖類、氨基酸、蛋白質以及核酸實例：總生物堿制備生藥粗粉0.1%HCl滲漉強酸性陽離子交換樹脂蒸餾水洗樹脂倒出晾干10%NaOH堿化樹脂氯仿回流干燥重結晶,5.逆流色譜 (CCC)以液相物質為固定相的液液色譜離心逆流色譜 (CCCC)：（1）分離物質的極性范圍很寬（2）沒有拖尾現象（3）樣品定量回收實例：銀杏葉中的黃酮糖苷 固定相：水，流動相：乙酸乙酯乙酸乙酯（異丁醇）乙酸乙酯/異丁醇 (6:4)高速逆流色譜 (HSCCC),6.其他形式色譜體積排阻色譜 分子篩機理凝膠過濾色譜凝膠滲透色譜優點：操作簡單、快捷、流動相選擇寬泛(2)親和色譜 大多被利用來分離純化生物大分子載體：瓊脂糖凝膠、交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠(3)疏水作用色譜 主要分離對象為蛋白質特點：分離條件溫和，易于保持生物蛋白質的活性,7.多種色譜方法的聯用最初分離步驟：如閃蒸色譜、逆流色譜或凝膠過濾色譜等最后的純化過程：如HPLC實例：生物堿 液相色譜法排阻色譜法,實例：水飛薊黃酮的提取 水飛薊：也叫乳薊，菊科植物，一年或兩年生草本 功效：抗肝臟中毒和保護肝細胞有效成分：水飛薊素提取工藝：水飛薊種子 去油種子餅 去油種子渣 過濾 提取液 濃縮 總黃酮油液 總黃酮 溶解 上柱 洗脫 濃縮干燥 水飛薊素,機械榨油,粉碎,提取4次每次4h,分離植物油,丙酮,硅膠柱,四. 制備色譜技術的發展關鍵：色譜過程放大和操作最優化柱色譜：分辯率高、結合容量大、成本低、放大快速簡便 現有色譜分離工藝70連續性色譜技術：移動床色譜、環形色譜、錯流梯度色譜 模擬流動床SMB： 特點：設備結構小、放大快速簡便、產率高和生產能力大,指紋圖譜技術,一.概述1.中藥指紋圖譜： 運用光譜、色譜、X-射線衍射或各種技術的聯用等現代分析技術，對中藥化學信息通過色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖等）方式進行表征，并通過計算、分析、比較、評價等過程，以技術參數、指紋特征等加以說明。 制備分析比較評價校驗,分析圖譜：準確的辨認 精密的測量比較圖譜：相似 相同評價結果：模糊屬性 求索細枝末節 分析比較的結果：對差異性或一致性作出評價,2.中藥指紋圖譜的分類：狹義：中藥化學（成分）指紋圖譜廣義： 中藥材（原料藥材）指紋圖譜應用對象 中藥原料藥（包括飲片、配伍顆粒）指紋圖譜 中藥制劑指紋圖譜 中藥化學（成分）指紋圖譜 最主要、常用 中藥HPLC指紋測定手段 中藥生物指紋圖譜,3. 中藥指紋圖譜研究的目的及意義：目的：（1）對中藥質量控制的補充和提高（2）控制中間體、成品的一致性，減少批間差異意義： 中藥現代化 表征中藥有效物質的整體性和復雜性 推動中藥新藥研究開發和傳統產品的二次開發,4.中藥指紋圖譜建立的原則：系統化學成分研究和相同的藥理學研究為依托系統性：應包括中藥有效部位所含大部分成分的種類，或指標成分的全部 如：中藥人參 皂苷類成分 銀杏葉 黃酮類和銀杏內酯類特征性：化學成分信息具有高度選擇性，區分中藥的真偽和優劣，成為“化學條碼” 如：五味子 已知木脂素 未知木脂素 成分之間的順序、比值重現性：在規定的方法和條件下，不同操作者和不同實驗室應能做出指紋圖譜,二.中藥指紋圖譜的建立,1.指紋圖譜測定方法的選定色譜法：TLC、HPLC、GC、CE光譜法：UV、IR、NIR其他方法：X射線衍射法、NMR及聯用技術等HPLC法最常用，具有如下特點： 分離效能高 選擇性高 檢測靈敏度高 分析速度快 應用范圍廣,HPLC指紋圖譜測定方法的選定,研究對象的確定及預處理 文獻調研，確定分析檢測目標 例如：黃芪含黃酮、皂苷及多糖三類有效成分 黃芪多糖注射液 多糖 原藥材 黃酮、皂苷及多糖 復方：君臣佐使 供試品的制備 例如：黃芪 黃酮 堿水萃取 皂苷 大孔樹脂吸附 除雜，避免干擾或對色譜柱的損耗色譜條件選擇 最重要、關鍵性 流動相：對樣品有一定溶解度、適用于使用的監測器、化學惰性好、低黏度、低沸點 純度高、安全、毒性低、環境友好 改性劑、助溶劑（異丙醇、四氫呋喃、氯仿） 、梯度洗脫 檢測波長、柱溫、色譜柱、進樣量、檢測器,黃酮類、酚酸類 乙腈水酸系統皂苷類 乙腈水系統生物堿類 乙腈三乙胺系統,2.色譜條件的優化及規范化 (1) 樣品中所有組分能被檢出或檢出組分數目盡可能多 (2) 各組分達到滿意的分離度 (3) 分析時間短優化：流動相組成、濃度、值、添加劑規范化：色譜柱、試劑、儀器操作參數固定，可重現3.指紋圖譜的信息化和知識化指紋圖譜信息化指紋圖譜知識化4.指紋圖譜的建立與辨認,三.中藥指紋圖譜的應用,1.丹參藥材指紋圖譜研究 有效成分： 水溶性 丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、丹參素丙、丹參酸乙、丹酚酸A、丹酚酸 B、迷迭香酸、丹參酸 A、3,4-二羥基桂皮酸、-谷甾醇-葡萄糖苷、異阿魏酸、原紫草素、紫草酸 脂溶性成分 丹參酮類 （丹參酮A）(1) 供試品的制備 水提取酸化乙酸乙酯萃取檢測 方法簡便、重現性好(2) 參照物的制備 主成分：原兒茶醛作參照物檢測方法 流動相的選擇 甲醇-0.1%冰乙酸（5:95） 檢測波長 254 nm 穩定性及精密度試驗 相對標準偏差 3.0% 重現性試驗 相對標準偏差 3.0%,(4) 丹參原藥材HPLC指紋圖譜檢測標準 色譜條件與系統適用性試驗： 填充劑 ODS 流動相 甲醇-0.1% (5:95) 檢測波長 254 nm 柱溫 室溫 流速 1.0 mL/min