一、一氧化氮（nitric oxide, NO）的發現,美國紐約州立大學藥理系Furchgott教授等（1953）采用兔胸主動脈螺旋條標本研究血管平滑肌上藥物、受體間的相互作用時發現，無論是否用去甲腎上腺素預先收縮，血管擴張劑卡巴膽堿或乙酰膽堿（CCh or Ach）不僅未能使血管舒張、反而予盾地引起收縮。當時曾錯誤假設：血管平滑肌上可能存在興奮和抑制兩套膽堿能受體Furchgott等（1978）用兔主動脈離體標本（包括主動脈環和螺旋條）研究腎上腺素受體亞型時，在一次加藥和沖洗錯誤中，第一次發現對擬膽堿藥產生松馳反應，而按標準方法制備的螺旋條，內皮已被刮掉，對Ach產生收縮反應，提示Ach的血管舒張反應依賴于內皮細胞的存在,Furchgott等（1979）采用所謂“三明治夾心標本”證實Ach作用于血管內皮，產生一種非前列腺素類的彌散因子，后者作用鄰近平滑肌細胞而產生舒張反應Furchgott和Zawadski （1980）將題為“The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine”的論文投送英國Nature雜志，幾經周折，被減縮成來信形式發表Furchgott （1982）在一篇論文中首次將這種內皮細胞介質稱為內皮細胞舒血管因子（endothelium-derived relaxing factor, EDRF）美英兩個實驗室（1987）同時證明這種EDRF就是NOFurchgott 、Ignarro and Marud（1998）被授予諾貝爾生理學及醫學獎,二、一氧化氮的研究已成為熱點,1994和1995年，MEDLINE收錄的有關NO研究論文達2500篇/年有關NO研究的一些重要結果或發現，多數發表在Nature、Proc Natl Acad Sci USA、J Biol Chem、Neuroscience、Br J Pharmacol、Am J Physiol等一些國際著名期刊上世界普名大學如耶魯大學、約翰霍普金斯大學、杜克大學、康乃爾大學、劍橋大學等均有規模不小的NO研究隊伍NO成為熱點主要有兩方面的原因：NO作用的廣泛性，參與體內眾多的病理生理過程，并已有臨床應用，而且可能有新的臨床應用前景，這使生物醫學工程領域和制藥公司的專家也加入到開發研制NO藥物的行列；NO是迄今在體內發現的第一個氣體性信息分子，對今后其他信使的發現有重大啟發,三、一氧化氮的化學特性,一種含不成對電子的氣體分子、分子很小、結構簡單、性質活潑、易氧化在生物組織中半衰期僅有幾秒與Fe2+有很高的親和力具有脂溶性，極易透過細胞膜快速擴散NO與O2-以極快的反應速率反應生成氧化活性更強的ONOO-,四、神經系統中一氧化氮的合成,1. 一氧化氮合酶,一氧化氮通過一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）催化氧化L-精氨酶而生成三種同功酶：存在于內皮細胞中的內皮細胞型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）；存在于神經細胞中的神經型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）；存在于巨噬細胞、肝細胞、神經膠質細胞中的可誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）。eNOS和nNOS均為構成型酶，統稱為構成型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase, cNOS）,三種NOS由不同基因編碼：eNOS基因定位于7號染色體，長度約為21kb，有26個外顯子；nNOS基因定位于12號染色體，長度為150kb，有29個外顯子；iNOS基因定位于17號染色體，長度為37kb，有26個外顯子（Mayer and Hemmens, 1997）每種同功酶具有相同催化中心結構：羧基端為還原酶區，包括FAD（flavin adenine dinucleotide）、FMN（flavin mononucleotide）、NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）的結合位點；氨基端為氧化酶區，包括一個血紅素輔基和一個四氫生物蝶呤（terahydrobiopterin, BH4）的結合位點NOS還原酶區域還有一個鈣調蛋白（calmodulin, CaM）結合位點，NOS只有與CaM結合才具催化活性，cNOS的活性受鈣離子調控；iNOS由于CaM與酶結合緊密，其活性基本不受鈣離子影響,2. 神經系統中一氧化氮的合成及其調控,在突觸后神經元，谷氨酸等興奮氨基酸結合到NMDA受體（N-methyl-D-aspartate receptor）上，引發Ca2+內流，Ca2+結合CaM后激活nNOS，從而產生NO其它與離子通道偶聯的谷氨酸受體亞型如AMPA受體（-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor）、紅藻氨酸受體（Kainate receptor）可能參與了神經元中NO合成的過程乙酰膽堿、腎上腺素等神經遞質也具有調控作用（Garthwaite and Boulton, 1995）PKA、PKC、PKG、CaM-K等蛋白激酶都能通過磷酸化修飾nNOS而調控酶的活力（Zhang and Snyder, 1995）,NO通過促進cAMP和cGMP的產生而對nNOS的活性也具有調控作用海馬神經元中NO的合成還受神經生長因子等細胞因子的調控（Lam et al, 1998）膠質細胞中NO主要通過不依賴于Ca2+信號的iNOS合成內毒素，以及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）、白介素-2（interleukin-2, IL-2）、-干擾素（interferon-r，IFN-）等細胞因子誘導膠質細胞表達iNOS，從而使膠質細胞持續地產生NO（Gross and Wolin, 1995）,五、一氧化氮在神經系統中的生理作用,1. 一氧化氮的主要作用“靶”,主要分兩大類：一類是蛋白質的血紅素輔基、鐵硫中心如可溶性鳥苷酸環化酶（soluble guanylate cyclase, sGC）、烏頭酸酶；另一類是與蛋白質生理功能密切相關的某些“活性”疏基如血紅蛋白的Cys 93半胱氨酸殘基、NMDA受體的氧化還原調控位點sGC是一種含有血紅素輔基的酶，以三磷酸鳥苷為底物合成環單磷酸鳥苷（cGMP），NO與sGC中血紅素輔基的鐵離子結合，使sGC構象發生改變，激活sGC，大大增加cGMP的產生。cGMP作用于血管平滑肌，使平滑肌舒張，增加血流、降低血壓。cGMP通過調控多種離子通道、蛋白激酶、磷酸二酯酶而啟動一系列信號轉導系統，執行包括調節腦血流、學習、記憶、調控基因表達等在內的多種重要生理功能（Gathwaite and Boulton, 1995; Belsham, et al, 1996）,2. 一氧化氮對神經遞質的調控作用,NO常與其它神經遞質共同發揮生理作用如小腦顆粒細胞具有谷氨酸受體，藍狀細胞是一種-氨基丁酸（-amino-n-butyric acid; GABA）能神經元，而紋狀體一氧化氮合酶陽性神經元以神經肽Y作為神經遞質在腦片、培養細胞、突觸體等不同實驗體系中，內源或外源NO對多巴胺（zhu and Luo, 1992）、乙酰膽堿（Hirsch et al, 1993）、去甲腎上腺素（Montagne et al, 1994）、GABA（Ohkuma et al, 1996）、谷氨酸（Bonfoco et al, 1996）等多種神經遞質的釋放均有調控作用,3. 一氧化氮對受體的調節作用,Liptun等系統研究NO對NMDA受體的調節作用，發現NMDA受體具有氧化還原調控位點、NO以及由其衍生的亞硝酰離子等化合物通過與該位點的疏基結合而部分改變NMDA受體的構象、從而抑制由NMDA受體激活引起的鈣離子內流、保護神經細胞（Lipton et al, 1996, 1998）,六、一氧化氮與神經損傷,一氧化氮引起細胞損傷的機制,1. 一氧化氮對線粒體的損傷作用。N0引起的線粒體功能障礙可能是早老性癡呆，帕金森氏病等多種神經系統疾病的重要病原因素之一（Heales et al, 1999）Bolanos等發現內源性 及外 源性NO均不可逆地抑制線粒體呼吸鏈復合體II-III、復合體IV的活力（Bloanos et al, 1994,1996,1997）Stamler推測NO可能通過破壞鐵硫中心而導致呼吸鏈酶失活（Stamler, 1994）Clementi等推測NO可能通過氧化修飾呼吸鏈酶的疏基而表現出抑制作用（Clementi et al, 1998）,線粒體呼吸的抑制直接導致細胞內ATP含量下降，從而啟動細胞凋亡程序，引起細胞凋亡（Richter et al, 1996）線粒體呼吸鏈酶被抑制后，線粒體電子泄漏增加，導致內源性超氧陰離子（O2-）的產生，而O2-與NO反應生成的ONOO-進一步對線粒體造成嚴重損傷，導致細胞死亡（Podertosd et al, 1996;Bolanos et al, 1995; Wei et al, 1998）,NO直接導致DNA鏈交聯、斷裂，引起細胞受損（Nguyen et al,1992）神經細胞經高濃度的谷氨酸處理后，由谷氨酸受體激活產生的內源性NO導致DNA鏈斷裂，并激活聚腺苷二磷酸核糖基合成酶（Zhang et al,1994）活化后的聚腺苷二磷酸核糖基合成酶以NAD+為底物，對受體蛋白進行修飾，導致細胞內NAD+耗竭（de Murcia et al,1994）合成Imol NAD+需要消耗4mol ATP，因此NAD+耗竭又會導致細胞內ATP耗竭，引致細胞嚴重損傷，甚至細胞死亡,2. NO對DNA的損傷作用,3. NO對機體抗氧化體系的損傷作用,NO及其相關化合物（亞硝酸離子、過氧化亞硝基等）不僅直接氧化維生素C、E、尿酸、小分子疏基化合物等內源抗氧化劑，破壞非酶抗氧化防御體系，還對過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活力有抑制作用，這些抗氧化酶的失活導致胞漿內過氧化物含量升高，引發細胞氧化損傷（Gross and Wolin,1995;Padmaja et al,1998; Asahi et al,1995）,1. 一氧化氮與腦缺血損傷,NO在腦缺血過程中起著典型的“雙刃劍”作用，既能部分緩解腦缺血，又介導更嚴重的損傷腦缺血初期，由eNOS產生的NO能夠擴張血管，抑制血小板、白細胞的粘附，從而部分緩解缺血，同時NO通過修飾NMDA受體的氧化還原調控位點而減弱由谷氨酸釋放而引起的鈣離子內流，部分減輕腦損傷（Iadecola,1997）隨著缺血時間延長，nNOS產生大量NO，同時nNOS的底物（L-精氨酸）以及輔因子（BH4）等逐漸成為NO合成的限制因素，導致O2-，H2O2等活性氧生成（Mayer and Hemmens,1997）腦缺血后期，由中性粒細胞、星形細胞iNOS持續產生的大量NO，也參與了缺血引起的神經元死亡,七、一氧化氮與神經系統疾病,2. 一氧化氮與早老性癡呆,早老性癡呆（Alzheimers disease, AD）是一種常見的神經退行性疾病，占65歲以上老年人的5-10%（Hurtley, 1998）主要表現為記憶力減退、智力低下病理改變主要包括廣泛的神經元減少（在大腦皮層和海馬中表現得尤為明顯）、細胞內神經纖維纏結（ neurofibrilloy, tangles）、細胞外形成老年斑（senile plaque）在AD患者腦組織中常有幾種異常蛋白的表達水平增高，其中研究較多的有-淀粉樣蛋白（amyloid -peptide, AB，一種含有39-43個氨基酸殘基的疏水性蛋白，是老年斑的主要成分之一）、S100蛋白（星形細胞產生的一種鈣離子結合蛋白）等研究顯示，A能夠激活神經元、星形細胞、內皮細胞產生NO和O2-、H2O2（Akama et al, 1998; Hu et al, 1998; Mark et al, 1997; Suo et al,1997）。S100能夠激活星形細胞產生NO（Hu and Van Eidik,1996）。同時產生的NO、O2-對細胞具有協同損傷作用,3. 一氧化氮與帕金森氏病,帕金森氏病（Parkinsons disease, PD）也是一種常見的神經退行性疾病，以運動障礙、肌強直、靜止性震顫為典型特征病理特征是腦區內黑質的多巴胺能神經元大量死亡最常用的動物模型和細胞模型是采用MPTP引起多巴胺能神經元選擇性死亡研究表明MPTP處理導致酪氨酸羥化酶硝基化，使酪氨酸羥化酶失活，從而導致神經細胞內多巴胺水平下降、多巴胺能神經元死亡（Ara et al, 1998）PD患者多巴胺能神經元周圍存在大量表達iNOS的膠質細胞，由膠質細胞iNOS產生的高濃度NO可能是多巴胺能神經元死亡的重要原因之一（Hirsch et al, 1998）,4. 一氧化氮與多發性硬化癥,多發性硬化癥（mutiple sclerosis, MS）是一種發生在中樞神經系統中的自身免疫疾病，目前的研究表明，NO以及由N