Loading,第十二章 喹啉與青蒿素類抗瘧藥物的分析,80k藥物分析班,第一節 喹啉類藥物的分析,瘧疾是有瘧原蟲引起的一種傳染病，每年全世界死于瘧疾的人數約250萬。寄生于人體的瘧原蟲有間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲四種，分別引起間日瘧，惡性瘧、三日瘧和卵形瘧。根據用藥的目的，將抗瘧藥分為三類：主要用于控制癥狀的抗瘧藥(如磷酸氯喹、硫酸奎寧、磷酸咯萘啶，青蒿素，蒿甲醚，青蒿琥酯，本芴醇等)；主要用于控制復發和傳播的藥物(如磷酸伯氨喹等)；主要用于病因性預防的抗瘧藥(如乙胺嘧啶、磺胺類等)。,一、喹啉類藥物的基本結構和主要性質二、鑒別實驗三、純度檢查四、含量測定,一、喹啉類藥物的基本結構和主要性質,（一）典型的藥物結構,喹啉類藥物分子結構中含有吡啶與苯稠合而成的喹啉雜環，環上雜原子的反應性能基本與吡啶相同。,（硫酸奎寧）,（二）主要的化學性質,1、堿性,奎寧為二元生物堿，其中奎寧環上的氮原子的堿性較強(pKa 8.8)，與強酸形成穩定的鹽；奎寧和奎尼丁均與二元酸成鹽，如與硫酸成鹽；喹啉環上的氮原子堿性較弱(pKa 4.2)，不能與硫酸成鹽；磷酸氯喹和磷酸伯氨喹為三元生物堿；磷酸咯萘啶為五元生物堿；磷酸哌喹為六元生物堿。,2. 旋光性,喹啉類抗瘧藥基本都具有手性，硫酸奎寧為左旋體，其比旋度為-237o至-224o；二鹽酸奎尼也為左旋體，其比旋度為-223o至-229o。磷酸哌喹和磷酸咯萘啶不具有手性。,3. 熒光特性 硫酸奎寧和二鹽酸奎尼在稀硫酸溶液中均顯藍色熒光。4. 紫外吸收光譜特征 由于喹啉類藥物分子結構中含有吡啶與苯稠合而成的喹啉雜環，具有共軛體系，可用紫外吸收光譜的特征鑒別該類藥物。,二、鑒別試驗,(一) 綠奎寧反應,奎寧為6-位含氧喹啉衍生物，可以發生綠奎寧反應(Thalleioquin reaction)。反應基本機制是6-位含氧喹啉，經氯水(或溴水)氧化氯化，再以氨水處理縮合，生成綠色的二醌基亞胺的銨鹽。,硫酸奎寧和二鹽酸奎尼的綠奎寧反應機制同上。取其水溶液，加溴試液0.2ml和氨試液1ml，即顯翠綠色，加酸成中性變成藍色，成酸性時則為紫紅色。翠綠色可轉溶于醇、三氯甲烷中而不溶于醚。因此ChP2010采用此反應鑒別硫酸奎寧和二鹽酸奎尼。 示例1 ChP2010硫酸奎寧的綠奎寧反應鑒別：取本品約5mg，加水5ml溶解后，加溴試液3滴與氨試液1ml，即顯翠綠色。,(二) 光譜特征,1. 紫外吸收光譜特征 由于喹啉類藥物分子結構中含有吡啶與苯稠合而成的喹啉雜環，具有共軛體系，可用紫外吸收光譜的特征鑒別該類藥物。 ChP2010采用本法鑒別磷酸氯喹、磷酸哌喹、磷酸咯萘啶和磷酸伯氨喹。2. 熒光光譜特征 利用硫酸奎寧和二鹽酸奎寧在稀硫酸溶液中均顯藍色熒光。 ChP2010硫酸奎寧的熒光鑒別：取本品約20mg，加水20ml溶解后，分取溶液10ml，加稀硫酸使成酸性，即顯藍色熒光。,3. 紅外吸收光譜特征 硫酸奎寧、二鹽酸奎寧、磷酸氯喹、磷酸哌喹、磷酸咯萘啶和磷酸伯氨喹在ChP2010中均采用紅外光譜的方法進行鑒別。 ChP2010磷酸氯喹的IR鑒別：取本品約0.5g，置分液漏斗中，加水25ml溶解后，加氫氧化鈉試液5ml、乙醚50ml振搖提取，醚層用水洗滌后通過置有無水硫酸鈉的漏斗濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣用五氧化二磷為干燥劑減壓干燥至析出結晶，其紅外光吸收圖譜應與氯喹的對照圖譜一致。,(三) 無機酸鹽,1、硫酸鹽的鑒別反應硫酸奎寧的硫酸根，顯硫酸鹽的鑒別反應進行鑒別。 取供試品溶液，滴加氯化鋇試液，即生成白色沉淀；分離，沉淀在鹽酸或硝酸中均不溶解。取供試品溶液，加醋酸鉛試液，即生成白色沉淀；分離，沉淀在醋酸銨試液或氫氧化鈉試液中溶解。取供試品溶液，加鹽酸，不生成白色沉淀(與硫代硫酸鹽區別)。,2、氯化物的鑒別反應二鹽酸奎寧中具有鹽酸根，即顯氯化物的鑒別反應進行鑒別。取供試品溶液，加稀硝酸使成酸性后,滴加硝酸銀試液，即生成白色凝乳狀沉淀；分離，沉淀加氨試液即溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀復生成。如供試品為生物堿或其他有機堿的鹽酸鹽，須先加氨試液使成堿性，將析出的沉淀濾過除去，取濾液進行試驗。取供試品少量，置試管中，加等量的二氧化錳，混勻，加硫酸濕潤，緩緩加熱，即發生氯氣，能使用水濕潤的碘化鉀淀粉試紙顯藍色。,3、磷酸鹽的鑒別反應磷酸氯喹、磷酸哌喹、磷酸咯萘啶和磷酸伯氨喹都具有磷酸根，顯磷酸鹽反應進行鑒別。取供試品的中性溶液，加硝酸銀試液，即生成淺黃色沉淀；分離，沉淀在氨試液或稀硝酸中均易溶解。取供試品溶液，加氯化銨鎂試液，即生成白色結晶性沉淀。取供試品溶液，加鉬酸銨試液與硝酸后，加熱即生成黃色沉淀；分離，沉淀能在氨試液中溶解。,三、純度檢查,(一) 硫酸奎寧的檢查,理化特性： 硫酸奎寧為白色細微的針狀結晶，輕柔，易壓縮；無臭，味極苦；遇光漸變色；水溶液顯中性反應。在氯仿-無水乙醇(2:1)的混合液中易溶，在水、乙醇、氯仿或乙醚中微溶。 有關物質 根據硫酸奎寧的制備工藝，產品中有關物質主要是生產過程中產生的中間體以及副反應產物。通過檢查以下項加以控制：酸度三氯甲烷-乙醇中不溶物質其他金雞納堿等,酸度 主要是在成鹽過程中引入。 ChP檢查法：取本品0.20g，加水20ml溶解后，用酸度計進行測定，pH值應為5.76.6。,2. 三氯甲烷-乙醇中不溶物質 本項檢查主要控制藥物在制備過程中引入的醇中不溶性雜質或無機鹽類等。 檢查法： 取本品2.0g，加三氯甲烷-無水乙醇(2:1)混合溶液15ml，在50加熱10分鐘后，用稱定重量的垂熔坩堝濾過，濾渣用上述混合溶液分5次洗滌，每次10ml，在105干燥至恒重，遺留殘渣不得過2mg。,3.其他金雞納堿,本項檢查主要控制硫酸奎寧中的其他生物堿，采用HPLC或TLC中的主成分自身對照法或雜質對照品對照法進行檢查。,TLC檢查法：取本品，加稀乙醇制成每1ml中約含10mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加稀乙醇稀釋制成每1ml中約含50g的溶液，作為對照溶液。吸取上述兩種溶液各5l，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-二乙胺(5:4:1.25)為展開劑，展開后，微熱使展開劑揮散，噴以碘鉑酸鉀試液使顯色。供試品溶液如顯雜質斑點，與對照溶液的主斑點比較，不得更深。,(二) 磷酸咯萘啶的純度檢查,在生產和貯藏過程中引入的有關物質，通過溶液的澄清度和顏色、有關物質等項目的檢查進行控制。,1. 酸度 主要是在成鹽過程中引入。本品水溶液的pH值如小于2.4，刺激性較大。檢查法： 取本品1.0g，加水25ml溶解后，用酸度計進行測定，pH值應大于2.4。,2. 水中不溶物 本品加水溶解后，稍放置即有黃色不溶物產生，影響質量。故質量標準按給藥途徑不同，規定其不同限量以控制質量。 檢查法：取本品2.0g，加水25ml振搖使溶解，放置30分鐘，用置105恒重的4號垂熔玻璃坩堝濾過，沉淀用水15ml分次洗滌，在105干燥4小時，遺留殘渣不得過4mg(供注射用)或7mg(供口服用)。,3.氯化物 系生產工藝中帶入。檢查時為了避免溶液顏色的干擾，先加堿使咯萘啶沉淀析出，然后再對濾液進行檢查。檢查法 取本品0.10g，加水4ml使溶解，加20碳酸鈉溶液5ml，搖勻，使沉淀完全，用5號垂熔玻璃漏斗濾過，容器用水15ml分次洗滌、濾過，合并濾液，加水使成25ml，依氯化物法檢查，與標準氯化鈉溶液3.0ml制成的對照液比較，不得更濃(0.03)。,4. 甲醛 在合成磷酸咯萘啶的反應中使用了甲醛進行縮合，甲醛具有毒性，應對產品中可能剩余的甲醛進行檢查。檢查法：取本品50.0mg，加水2ml使溶解，加5%碳酸鈉溶液4ml，攪勻，濾過，濾液加硫酸溶液(12)3ml，冷卻后加品紅亞硫酸試液5ml，在2030保溫30分鐘，如顯色，與新制的甲醛溶液(每1ml含甲醛0.10mg的水溶液)1.0ml用同一方法制成的對照液比較，不得更深(0.2%)。,5. 四氫吡咯 在合成磷酸咯萘啶的反應中使用了四氫吡咯進行縮合，四氫吡咯具有毒性，應對產品中可能剩余的四氫吡咯進行檢查。檢查法：取本品10mg，加水2ml溶解后，加5碳酸鈉溶液2ml，攪拌，濾過，濾液加新制的亞硝基鐵氰化鈉乙醛試液1ml，搖勻，5分鐘內不得顯藍紫色。,四、含量測定,(一)硫酸奎寧的含量測定,硫酸奎寧具有生物堿的性質，很難在水溶液中用酸直接滴定。而在非水酸性介質中，堿性顯著增強，即可以在冰醋酸或醋酐等酸性溶液中，用高氯酸滴定液直接滴定，以指示劑或電位法確定終點。 由于硫酸為二元酸，在水溶液中能進行二級解離，但在冰醋酸介質中，只能解離為HSO4，所以生物堿的硫酸鹽在冰醋酸中只能滴定至硫酸氫鹽。 (BH+)2SO42- +HClO4 BH+ClO4- +BH+HSO4 測定時還應注意生物堿分子結構中氮原子堿性的強弱，正確判斷反應的摩爾比，以準確計算結果。,ChP2010硫酸奎寧的含量測定法：,取本品約0.2g，精密稱定，加冰醋酸10ml溶解后，加醋酐5ml與結晶紫指示液12滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液顯藍綠色，并將滴定的結果用空白試驗校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相當于24.90mg的(C20H24N2O2)2H2SO4。,奎寧為二元堿，喹核氮可與硫酸成鹽，喹啉環氮不與硫酸成鹽，但在冰醋酸介質中用高氯酸滴定時，卻能與高氯酸成鹽。即：因此，1 mol硫酸奎寧消耗3 mol高氯酸滴定液。即1 mol奎寧可以結合4 mol質子，其中1 mol質子是硫酸提供的，其它3 mol質子是由高氯酸提供的。USP與本法相同。,ChP2010 硫酸奎寧片的含量測定法：,取本品20片，除去包衣后，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于硫酸奎寧0.3g)，置分液漏斗中。加氯化鈉0.5g與0.1mol/L氫氧化鈉溶液10ml，混勻，精密加三氯甲烷50ml，振搖10分鐘，靜置，分取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，精密量取續濾液25ml，加醋酐5mL與二甲基黃指示液2滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液顯玫瑰紅色，并將滴定結果用空白試驗校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相當于19.75mg的 (C20H24N2O2)2H2SO4 2H2O。,測定中1mol硫酸奎寧可轉化為2mol奎寧，每1mol奎寧消耗2mol高氯酸，故1mol硫酸奎寧消耗4mol高氯酸。反應式為：,顯然其片劑分析與原料藥有所不同。另外還應注意考察共存物的干擾，片劑中如有較多輔料，如硬脂酸鹽、苯甲酸鹽等，也消耗高氯酸滴定液，故應先用強堿溶液堿化，使之游離，經三氯甲烷提取分離后，再用高氯酸滴定液滴定。 USP34 硫酸奎寧片含量的HPLC測定法,(二)磷酸氯喹制劑的含量測定,ChP2010中磷酸氯喹片的紫外-可見分光光度含量測定法：,取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于磷酸氯喹0.13g)，置200ml量瓶中，加0.lmol/L鹽酸溶液適量，充分振搖使磷酸氯喹溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液2ml，置100ml量瓶中，用0.lmol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，在343nm的波長處測定吸光度；另取磷酸氯喹對照品適量，精密稱定，加0.lmol/L鹽酸溶液溶解并定是稀釋制成每lml中約含13g的溶液，同法測定，計算，即得。 本品含磷酸氯喹(C18H26ClN32H3PO4)應為標示量的93.0%107.0%。,ChP2010中磷酸氯喹注射液(本品含磷酸氯喹的滅菌水溶液。含磷酸氯喹(C18H26ClN32H3PO4)應為標示量的95.0%105.0%。)的含量的提取酸量測定法： 精密量取本品適量(約相當于磷酸氯喹0.3g)，用水稀釋至30ml，加20%氫氧化鈉溶液3ml，搖勻，用乙醚提取4次，每次20ml，合并乙醚液，用10ml水洗滌，水洗滌液再用15ml乙醚提取1次，合并前后兩次的乙醚液，蒸發至近23ml時，精密加鹽酸滴定液(0.lmol/L)25ml，溫熱蒸去乙醚并使殘渣溶解，冷卻，加溴甲酚綠指示液數滴，用氫氧化鈉滴定液(0.lmol/L)滴定。每lml鹽酸滴定液(0.lmol/L)相當于25.79mg C18H26ClN32H3PO4 。 USP 采用提取后HPLC測定磷酸氯喹注射液的含量。,第二節 青蒿素類藥物的分析,青蒿素簡介,青蒿素(artemisinin)又名黃蒿素，是我國學者從從菊科植物黃花蒿(artemisia annua L.)中提取分離得到的一個含過氧基團的新型倍半萜內酯。青蒿素是一種高效、速效、低毒的新型抗瘧藥。本品為脂溶性，易透過血腦屏障。在體內代謝很快，排泄快，有效血藥濃度維持時間短。主要用于耐氯喹的惡性瘧，包括腦型瘧的搶救。因有效血藥濃度維持時間短，殺滅瘧疾原蟲不徹底，復燃率高達30%，與伯氨喹合用，可使復燃率降至10%。1986年中醫研究院研制的青蒿素抗瘧藥獲得我國實施新藥審批辦法以來的第1個新藥證書。但是，由于當時中國還沒有專利法，所以，我國沒有申請發明專利。,青蒿素發展史,青蒿素的多種衍生物均是治療瘧疾的有效單體，國內外公認的首創新藥。將青蒿素結構中C-10位羰基還原成羥基得到雙氫青蒿素，進一步烷氧基化得到蒿甲醚，而進行酯化可得到青蒿琥酯隨著對青蒿素類藥物藥理作用研究的不斷深入，證實其具有抗瘧、抗孕、抗纖維化、抗血吸蟲、抗弓形蟲、抗心律失常和腫瘤細胞毒性等作用。 1990年，為了控制瘧疾對青蒿素的耐藥性，世界衛生組織建議在治療中必須將青蒿素同別的抗瘧藥聯合使用2007年5月，在瑞士日內瓦舉行的第60屆世界衛生大會上，世界衛生組織聲明，單方青蒿素會引發耐藥性，建議在全球范圍內推廣復方類抗瘧藥。,一、青蒿素類藥物的基本結構和主要性質二、鑒別實驗三、純度檢查四、含量測定,青蒿素,一、青蒿素類藥物的基本結構與主要性質,將青蒿素結構中C-10位羰基還原成羥基得到雙氫青蒿素(dihydroartemisinin)，進一步烷氧基化得到蒿甲醚(artemether)，而進行酯化可得到青蒿琥酯(artesunate)。,青蒿素Artemisine,雙氫青蒿素Dihydroartemisinin,青蒿琥酯Artesunate,蒿甲醚Artemether,10,（一）、主要化學性質,UV吸收特性 由于青蒿素類藥物分子結構中母核，不具有共軛體系，其紫 外吸收光譜的主要是末端吸收。但C-10由于取代基的不同具 有一定吸收特征。,氧化性 由于青蒿素類是具有過氧橋的倍半萜內酯類化合物，這類化合物具有氧化性。,旋光性 青蒿素類藥物都均有旋光性，均為右旋體藥物。青蒿素其比旋度為 +75o+78o。蒿甲醚其比旋度為+168o+173o。,水解反應 青蒿素結構中由于有內酯，在堿性條件下，發生水解，但其 他藥物由于母核中沒有內酯，沒法發生水解。,二、鑒別試驗,(一) 呈色反應,ChP2010青蒿素的鑒別：取本品約5mg，加無水乙醇0.5ml溶解后，加碘化鉀試液0.4ml，稀硫酸2.5ml與淀粉指示液4滴，立即呈紫色。 ChP2010雙氫青蒿素片的鑒別：取本品的細粉適量(約相當于雙氫青蒿素20mg)，加無水乙醇2ml使雙氫青蒿素溶解，濾過，濾液中加碘化鉀試液2ml與稀硫酸4ml，搖勻，加淀粉指示液數滴，溶液即顯藍紫色。,由于青蒿素類是具有過氧橋的倍半萜內酯類化合物，這類化合物具有氧化性。在酸性條件能將I-氧化成I2與淀粉指示液，生成藍紫色。,1. 碘化鉀試液-淀粉反應(過氧橋的氧化反應),含有內酯的化合物、羧酸衍生物和一些酯類化合物在堿性條件與羥胺作用，生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。ChP2010收載了青蒿素和青蒿琥酯的羥肟酸鐵鑒別反應。,2. 羥肟酸鐵反應,ChP2010青蒿素的鑒別：取本品約5mg，加無水乙醇0.5ml溶解后，加鹽酸羥胺試液0.5ml與氫氧化鈉試液0.25ml，置水浴中微沸，放冷后，加鹽酸2滴和三氯化鐵試液1滴，立即顯深紫紅色。 ChP2010青蒿琥酯的鑒別：取本品約50mg，加含7鹽酸羥胺的乙醇溶液(80100)1ml，再加乙醇制氫氧化鉀試液3ml，置水浴中加熱至沸，放冷，加稀鹽酸至呈酸性，再加三氯化鐵試液l滴，即顯紫紅色。,香草醛-硫酸溶液又稱硫酸香蘭素顯色劑，很多的物質如有機酸、揮發油、甾醇、萜類等都可以顯色。,3.香草醛-硫酸反應,ChP2010青蒿琥酯的鑒別：取本品約50mg，加三氯甲烷1ml溶解后，取34滴置白瓷板上，待三氯甲烷揮發后，加2香草醛硫酸溶液1滴，顯紅色。,硫酸香草醛溶液顯色原理:使羧基脫水，增加雙鍵結構，再經雙鍵位移，雙分子縮合等反應生成共軛雙鍵系統，又在酸作用下形成陽碳離子鹽而顯色。是一種通用顯色劑。,(二)、吸收光譜特征,青蒿素類抗瘧原料藥在ChP2010中均采用紅外光譜的方法進行鑒別。,1. 紅外吸收光譜特征,ChP2010青蒿琥酯片的鑒別：取本品的細粉適量(約相當于青蒿琥酯0.1g)，加15ml丙酮振搖使溶解，濾過，濾液揮干，殘渣用硅膠為干燥劑減壓干燥。殘渣的紅外光吸收圖譜應與青蒿琥酯的對照圖譜一致。,但是制劑的紅外光吸收圖譜鑒別須經提取分離，殘渣干燥后，進行紅外光吸收圖譜與對照的圖譜比較。,要求所得的紅外光吸收圖譜應與對照的圖譜一致。,由于青蒿素類藥物分子結構中母核，不具有共軛體系，其紫外吸收光譜的主要是末端吸收。但C-10由于取代基的不同具有一定吸收特征。ChP2010均未采用本法鑒別所收載青蒿素類藥物。,2. 紫外吸收光譜特征,(三)、色譜法,利用比較供試品溶液主峰與對照品溶液主峰的保留時間(tR)是否一致或比較供試品溶液所顯主斑點的位置和顏色與對照品溶液主斑點的位置和顏色是否相同進行鑒別。HPLC法一般都規定在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。青蒿素類抗瘧原料藥在ChP2010中均采用HPLC的方法進行鑒別。但制劑中也有采用TLC法進行鑒別。,三、純度檢查,目前青蒿素的制備仍以天然藥材分離提取為主，并用于其衍生藥物的生產，所以藥品中通常都存在結構類似的有關物質，主要通過TLC和