.TNF,INF的診斷意義 摘要：目的 為更好地為兒童急性再生障礙性貧血體內細胞因子濃度變化提供證據。方法 采再障組（46例）和對照組（48例）靜脈血，用酶聯免疫吸附法測定所取血樣標本中腫瘤壞死因子-（TNF-）和干擾素-（INF-）的含量。并用獨立樣本t檢驗分析兩組外周血中細胞因子是否存在顯著性差異。結果 再障組患兒外周血TNF-和INF-的含量均高于對照組兒童。結論 通過對TNF-和INF-的監測，可以有效的了解再障患兒疾病進展，治療效果和預后情況。 關鍵詞：再生障礙性貧血；腫瘤壞死因子-；干擾素- 再生障礙性貧血可分為急性再障和慢性再障兩型。其中急性再生障礙性貧血發病急、進展快，骨髓衰竭是其主要病理過程，常伴內臟出血、嚴重感染，常危及生命，預后不良。但是現在大部分的病例被診斷為特發性免疫異常導致的再生障礙性1。細胞因子失調，包括腫瘤壞死因子（TNF-），干擾素（INF-），今年來研究發現在再生障礙性貧血的發病機制中起到了重要的作用2。兒童再生障礙性貧血已經成為繼兒童白血病之后，兒童死亡率較高的一種血液系統疾病3。本研究為了給臨床上提供更好的關于兒童急性再障體內細胞因子濃度變化的證據。現報告如下： 1 資料與方法 1.1一般資料 2010年6月2013年6月我院診治的46名急性再生障礙性貧血患兒。符合我國小兒再生障礙性貧血的診斷及分型標準4?；純壕鶠榧毙栽偕系K性貧血發作。其中男20例，女26例，中位年齡6.3（214）歲。對照組選擇同期到我院體檢中心體檢的正常兒童，共48例，男21例，女27例，中位年齡7（216）歲。兩組兒童的年齡比較和性別比例上無顯著性差異，P0.05。 1.2方法 1.2.1標本收集 用肝素鈉抗凝管采集靜脈血5ml用于TNF-測定。取用無肝素采集管采集靜脈血15ml用于INF-測定。 1.2.2TNF-含量的測定 以鼠源性的抗TNF-單抗以每孔400ng的量，在PH值為9的碳酸-碳酸鈉緩沖液中包被96孔板中，置4環境過夜。取出后洗滌3次，加入預先備好的待測樣本及標準的TNF-（制作標準曲線用）。37孵育2h。用洗滌液洗滌3次，加入羊抗鼠TNF-抗體，37孵育2h后，再洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG，37孵育2h后加入底物顯色。終止顯色后在自動酶標儀上測定濃度，并以標準曲線為基準求得TNF-的含量。以（xs）ng/ml的形式表示結果。 1.2.3INF-含量測定 將上述采得的用于INF-測定的靜脈血在室溫凝固30m in，1000r /m in離心15m in，收集血清。檢測IFN-用人IFN-檢測Elisa試劑盒，操作步驟為分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50l，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測樣品10l（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37溫育30min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50l，空白孔除外。再用封板膜封板后置37溫育30min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50l，再加入顯色劑B50l，輕輕震蕩混勻，37避光顯色15min，每孔加終止液50l，終止反應（此時藍色立轉黃色）。以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。終止顯色后在自動酶標儀上測定濃度，并以標準曲線為基準求得IFN-的含量。以（xs）ng/ml的形式表示結果。 1.2.4統計學方法 應用SPSS1 12.0統計學軟件進行統計學分析，計量資料采用均x s表示，結果分析采用獨立樣本的t 檢驗，以P 0.05 為差異有顯著性。 2 結果 2.1 TNF-含量的對比結果 再障組患兒外周血中TNF-含量的平均值是：（56.5120.02） ng/ml，而對照組的患兒的平均值為（25.8810.11）ng/ml。通過獨立樣本t檢驗分析，P=0.0080.05，差異具有顯著性。 2.2 INF-含量的對比結果 再障組患兒外周血中INF-含量的平均值是：（21.29.22） ng/ml，而對照組的患兒的平均值為（8.8710.11）ng/ml。通過獨立樣本t檢驗分析，P=0.0010.05。 3 討論 近年來，越來越多的證據表明，再生障礙性貧血發病與免疫異常有關。已經有不少學者從細胞因子水平方面研究再生障礙性貧血5。到目前為止雖然再生障礙性貧血精確的發病機制還沒有被完全的闡明，但是大量證據表明T細胞介導的免疫調節異常在再障的發病機理中發揮了重要的作用。Th1功能失調被認為是再障發病的一個重要原因，Th1功能活躍導致TNF-和INF-過表達成為了再障炎癥改變的基礎6。 腫瘤壞死因子，是單核-巨噬細胞分泌的單核細胞刺激因子，在炎癥和免疫反應中起著重要的作用。人的TNF具有兩種形式TNF-和TNF-。由于TNF-又稱為淋巴毒素只限于局限分泌，而TNF-則被廣泛分泌到外周血循環中。所以在關于機體免疫功能的研究中，一般都是檢測TNF-的含量。研究表明，再障患者體內TNF的含量有明顯增加7。最初的研究認為，TNF是造血祖細胞的負調節因子，能夠抑制粒紅細胞集落形成單位、粒單細胞集落形成單位、紅系爆式集落形成單位及紅系集落形成單位的形成8 。但后期證實，TNF對正常造血細胞具有雙向調節作用9。在正常情況下，TNF-濃度較低，適量的TNF-對機體有保護作用，在疾病的病理改變下，TNF-大量分泌，以致對機體產生損害作用。最近的研究證實，TNF升高是由于患兒存在自身免疫功能缺陷，特別是組織免疫受到抑制，過量的TNF-刺激單核-巨噬細胞從而分泌更多的結果。是否還有其它因素影響，尚待進一步探討10。本研究的結果為再障兒童體內外周血TNF-含量顯著高于正常兒童含量提供了臨床依據。 INF-主要由輔助T（Th）細胞產生，INF-是可調節Th細胞極化的細胞因子 。在這種調節機制中， 細胞分泌的INF- 發揮著十分重要的作用，能顯著地促進Th1應答，且抑制Th2應答11。國外已經有學者研究表明再障患者外周血中存在高水平的INF-12升高的機理可能是患兒血清中血管內皮生長因子水平明顯低于正常患兒，也可能是由于患兒外周血T、B淋巴細胞調節紊亂，機體的免疫功能發生障礙的原因。再障患兒Th1功能活躍，超過了機體正常的調節功能，產生高水平的INF-，進而對造血又起抑制作用，進一步惡化再障。所以體內的INF-含量可以有效的體現再生障礙性患者疾病的嚴重程度。在我們這次研究中，也可以看到急性再生障礙性貧血患兒外周血中的INF-的含量與對照組患兒體內INF-的含量差異具有顯著性。這里后期應該追加急性再障和慢性再障患兒體內外周血INF-含量比較的研究，以提供更完善的證據證明INF-的含量可以反映再障疾病的嚴重程度。 綜上所述，在再生障礙貧血的發展過程中，通過對TNF-和INF-三種細胞因子的監測，可以有效地了解疾病的情況、治療效果和疾病的預后，具有較重要的意義。本研究為再障的新治療靶點提供有效的臨床依據。同時，提示我們較新的研究思路，有助于進一步研究兒童再生障礙性貧血。 參考文獻： 1Jianping Li，Qinjun Zhao，Wen Xing，et al.Terleukin-27 enhances the production of tumour necrosis actor-a and interferon-c by bone marrow T lymphocytes in aplastic anaemiaJ.British Journal of Haematology，2011，153：764-772. 2Hara，T.Ando，K.Tsurumi H.& Moriwaki H.Excessive production of tumor necrosis factor-alpha by bone marrow T lymphocytes is essential in causing bone marrow failure in patients with aplastic anemiaJ.European Journal of Haematology，2004，73：10?C16. 3劉亞平.兒童再生障礙性貧血242例實驗室診斷及I臨床分析J.吉林醫學，2009，5：855-856 4中華醫學會兒科學分會血液學組，中華兒科雜志編輯委員會.小兒再生障礙性貧血的診療建議J.中華兒科雜志，2001，39：422-423. 5柴憶歡，朱玲?P.再生障礙性貧血與細胞因子J.國外醫學兒科學分冊，1995，22（4）：178-180. 6Hoeve M.A，De Boer T，Langenberg D.M，et al.H. IL-12 receptor deficiency revisited：IL-23-mediated signaling is also impaired in human genetic IL-12 receptor beta1 deficiencyJ.European Journal of Immunology，2003，33：3393?C3397. 7Shinohara K.Increased production of tumor necrosis factor-alpha by peripheral blood mononuclear cells in the patients with aplastic anemiaJ.Am J Hematol，1999，37：75. 8Pcetr C.Effects of recombinant TNF on proliferation and differentiation of leukemic and normal hemopoietic cells in vitroJ.J Clin invest，1986，78：1694. 9Caux C，Sealand S，Favre C，et al.TNF-2 strongly potentiates IL-3 and GM-CSF-Induceel proliferation of human CD HPCJ.Blood，1990，75：2292. 10馮越.再生障礙性貧血患兒血清TNF-、INF-和T細胞亞群檢測的臨床意義.放射免疫學雜志，2008，21（6）：511-512. 11Sabo SJ，Su1livall BM，Peng SL，et al.Moleclllar biomechanism regulat