蝦類黑變機理 多酚氧化酶 一 引言1多酚氧化酶的性質2酶促褐變的生理作用二 酚氧化酶的生物化學和分子生物學性質三 褐變控制1物理處理2抑制劑 食品的外觀 風味 質地和營養價值是消費者選擇食品時的四個因素 重要的是顏色 也是消費者評價食品質量的首要因素之一 通過酶促反應或非酶促反應形成的顏色 影響著許多水果 蔬菜和海洋食品 尤其是甲殼類食品的最重要的顏色反應之一酶促褐變反應 是多酚氧化酶引起的 這種酶曾經被稱為酚氧化酶 酚酶 一元酚和二元酚氧化酶和酪氨酸酶 1問題1 1黑變病酚氧化酶能導致甲殼類 如龍蝦和蟹變黑 被稱為黑變病 1 2多酚氧化酶的性質多酚氧化酶能催化兩種基本的反應 用苯酚和氧氣作底物 該反應能在與羥基相連的位置催化羥基化反應 第二步反應是二元酚被氧化為鄰位苯醌 苯醌常通過非酶反應機理進一步氧化成黑色素 褐色產物 1 2O2 O2 2H2O 一元酚氧化酶一元酚氧化酶催化一元酚羥基化成為二元酚 種酶被稱為酪氨酸酶 因為L 酪氨酸是主要的一元酚底物 二元酚氧化酶第二步反應即二元酚被氧化成醌 被稱為二元酚氧化酶活力或兒茶酚氧化酶活力 進一步反應是兒茶酚被氧化成為鄰位 苯醌 蟲漆酶蟲漆酶 對 二元酚氧化酶 E C 1 10 3 2 DPO 是另外一種類型的含銅的多元酚氧化酶 對于其酚底物具有明顯的非特異性 底物被蟲漆酶氧化是由于單一電子反應生成自由基 氧氣被還原成水的同時酚類底物也被氧化 1 2酶促褐變的生理作用 抗病能力被認為是多酚氧化酶在動物體內的功能之一 主要存在于昆蟲和甲殼類動物中 該酶在動物體內常以酶原或多酚氧化酶前體形式存在 它對甲殼類動物中的骨化過程起到重要的作用 黑色素和部分聚合酚醛塑料具有抗微生物的性質 據說特殊的微生物能誘導產生能激活多酚氧化酶的蛋白酶 微生物次級代謝產物例如 葡聚糖 糖蛋白 脂多糖 海帶多糖和其它一些產物也能誘導產生能激活多酚氧化酶的蛋白酶 2 酚氧化酶的生物化學和分子生物學性質 PPOs是含銅的蛋白質 在所有PPO順序中最顯著的特征是兩個銅結合位點 被稱為CuA和CuB PPO的活性位點由兩個銅離子構成 每個銅離子與三個保守的組氨酸殘基結合 這一對銅離子是PPO與氧氣和酚類底物相互作用的位點 在甲殼類中 PPO體系以無活性的酚氧化酶原 proPO 形式存在于血淋巴中 因此 PPO來源于血藍蛋白 血藍蛋白是在甲殼類血淋巴的血漿中發現的氧氣運輸蛋白 血藍蛋白和PPOs存在由兩個銅離子直接與蛋白質結合而形成的氧結合位點 但是 血藍蛋白不起催化作用 純的proPO的分子量為76kDa 它是一種等電點在5 4左右的糖蛋白PPO活性的最適pH值在pH6 0和pH8 0之間 溫度對甲殼類PPO的穩定性影響表明這些酶在20 50 范圍內具有相似的穩定性 PPOs的穩定性是非常不同的 它依賴于許多因素 如溫度 pH 底物濃度 離子強度 緩沖體系等 3 褐變控制 多酚氧化酶 PPO 催化酚氧化生成鄰位 醌 鄰位 醌是活性很強的化合物 它們自發聚合形成高分子量化合物或黑色素 或與氨基酸和蛋白質反應而加深顏色 阻止酶促褐變可以通過多種途徑來實現 方法論上是除去一種或多種反應必需的成分 氧氣 酶 銅或底物 3 1物理處理加熱冷藏冷凍干燥輻射高壓和超臨界CO2 3 2抑制劑 褐變抑制劑在食品加工中的應用受毒性 對味道 風味 質地和價值的影響因素的制約 用于防止酶促褐變的抑制劑有5類 1 還原劑 2 螯合劑 3 酸化劑 4 酶抑制劑 5 絡合劑 3 2 1還原劑 抗氧化劑 亞硫酸鹽試劑硫酸鹽是PPO的一種競爭性抑制劑 能使PPO活性位點的巰基結合 L 抗壞血酸抗壞血酸抑制的機理基本上被歸結為還原 酶促形成鄰位 醌成原來的二元酚 從而阻止色素的形成 異抗壞血酸異抗壞血酸和它的鹽異抗壞血酸鈉都是很強的還原劑 它們是氧惰性劑 因此能抵抗還原分子中的氧 酚類抗氧化劑抗氧化劑通過抑制生成自由基的氧化反應過程 螯合金屬和惰性單線態氧來延緩酸敗或變色 從而保藏食品 半胱氨酸半胱氨酸能抑制黑變病被推測是形成了無色的硫醇 鄰位 醌 它甚至直接與PPO上的銅生成穩定的復合物而抑制酶活 3 2 2酸化劑 酸化劑的作用是將pH控制在PPO最佳催化活性所要求的pH之下 酸化劑如 檸檬酸 蘋果酸 磷酸能將pH降到3以下 在這個pH下PPO是無活性的 酸化劑經常與其他抗褐變劑結合使用 檸檬酸和抗壞血酸一種是食品工業中使用的最廣泛的酸之一 3 2 3 螯合劑 在它們的活性位點有金屬離子 因此通過螯合劑除去它們的金屬離子將使酶失去活性 螯合劑通過它們能起到絡合或螯合的作用的分子結構中的不共用電子對與強氧化劑如銅鐵離子絡合 由于PPO是含銅的金屬蛋白像輔基一樣 它將被金屬螯合劑抑制 在食品中應用的最好的GRAS螯合劑是檸檬酸和乙二胺環己酸 EDTA EDTAEDTA與鐵 銅 鈣通過螯合反應生成非常穩定的絡合物 在羧基完全解離的高pH下 EDTA的螯合效果最好 在阻止酶促褐變中 EDTA通常與其他化合試劑合用 磷酸鹽多磷酸鹽 焦磷酸鈉 金屬磷酸鹽都是螯合劑 由于它們在冷水中是微溶的 因而用在食品中作為抗褐變試劑時的濃度為0 5 2 麥芽酚麥芽酚 3 羥基 2 甲基 4氫 吡喃 4 one 一種 吡喃酮的衍生物 麥芽酚不能直接抑制PPO 但它能通過與鄰位 醌的結合使其重新生成鄰位 二羥基醌或使PPO不可逆滅活來抑制褐變 曲酸曲酸 5 羥基 2 羥甲基 4H 吡喃 4 one 是一種 吡喃酮衍生物 是許多曲霉菌和青霉菌的代謝產物 酪氨酸酶被曲酸的抑制可能是由于它能和酶活性位點的銅結合 因為曲酸是非常好的過渡金屬如鐵 和銅 的螯合劑 3 2 4 絡合劑 甲殼胺甲殼胺來源于有殼的水生動物 甲殼質為 1 4 D 胺基葡萄糖的多聚體 甲殼胺無毒 生物可降解 有抗微生物作用 作用機理還不清楚 可能是帶正電荷的多聚體能吸收懸浮的PPO的底物或產物的原故 環狀糊精環狀糊精是一類由液化淀粉在葡聚糖轉移酶作用下經環狀麥芽糊精而生成的環狀寡糖 CD抑制褐變的機理主要是它們能與PPO的底物結合 CD的中央空穴有較弱的非極性與PPOs酚類形成包含絡合物 因而能阻止醌的氧化和隨后的聚合 從而阻止黑色素的生成 3 2 5 酶抑制劑 4 已基間苯二酚被取代的間苯二酚 它們的結構與酚類底物相關 被認為是PPO的抑制劑 間苯二酚衍生物與酚類底物的結構相類似 通過對PPO的競爭性抑制來阻止褐變反應 4 已基間苯二酚 4 HR 能抑制酪氨酸的一元酚氧化酶和二元酚氧化酶活性 鹵化鹽無機鹵化鹽是很有名的PPO抑制劑 NaF是最強的PPO抑制劑 其他依次是NaCl NaBr 和NaI 蜂蜜蜂蜜可以抑制酶促褐變 蜂蜜對PPO起抑制作用的化合物是分子量為600的小肽 因為蛋白質 肽和氨基酸通過螯合PPO活性中心的Cu2 形成穩定絡合物來抑制PPO的活性 這可能就是蜂蜜肽的抑制機理 氨基酸 肽和蛋白質氨基酸 肽和蛋白質通過直接抑制酶或通過與PPO催化產物醌反應來抑制PPO催化的褐變 它們也能通過與催化各酚底物螯合PPO的活性位點的銅來抑制PPO活性 蛋白質 肽和 氨基酸能和銅離子形成穩定的絡合物 組氨酸和半胱氨酸對銅離子有特別高的親和力 因為組氨酸有咪唑環 半胱氨酸有巰基 二者都能連接金屬離子 芳香族羧酸苯甲酸和肉桂系列的芳香族羧酸是PPO的抑制劑 同時它們的結構與底物的結構相類似 肉桂酸和它的類似物 對位 對羥基桂皮酸 阿魏酸和芥子酸被發現是植物PPO的強烈抑制劑 對蝦黑變的新機理 我國海捕蝦產量 海水養殖蝦產量 南美白對蝦 P vannamei 南美白對蝦原分布在中 南美洲太平洋沿岸水域 外形似中國對蝦 正常體色為淺灰色 殼薄體肥 肉質鮮嫩 出肉率高達65 以上 營養豐富 深受國內外市場歡迎 生長速度快 養殖60天即可上市 為當前世界上養殖最普遍的品種 我國南方沿海可以養兩茬 該蝦生長快 適應性強 食性雜 巳可耐受較長時間的干露 故易干活運銷 該蝦是對蝦中個體最大的一種 發現的最大個體長達33厘米 體重500 600克 斑節對蝦P monodon 日本對蝦Penaeusjaponicus 日本對蝦是日本最重要的對蝦養殖品種 在日本養到25克左右出售價格最高 鷹爪蝦 對蝦科 Trachypenaeuscurvirostris 中國水產品的進出口貿易情況 中國2002年出口量排列前五位的依次是凍魚及魚片 占46 1 頭足類 占18 1 各種加工魚類及罐頭 5 8 養殖蝦 5 2 和烤鰻 3 2 出口額排在前五位的是凍魚及魚片 30 0 頭足類 16 4 烤鰻 12 6 養殖蝦 12 2 加工魚類及罐頭 6 0 1 引起蝦類黑變真正原因是什么 2 血藍蛋白是怎樣被激活的 3 血藍蛋白在對蝦中的存在位置 4 血藍蛋白僅僅氧化酪氨酸嗎 5 是否還有其它因素能引起蝦類的黑變 1 引起蝦類黑變真正原因是什么 DOPA Melanin DOPAquinone 5 6 dihydroxyindole DHI DOPAchrome Phenoloxidase PO Tyrosine 蝦類黑色素的形成 目前普遍被接受的形成機理 多酚氧化酶酶原的激活機理 Prophenoloxidase ProPO Phenoloxidase PO ProPOSystem Beta 1 3glucan LPS Peptidoglycan prophenoloxidaseactivatingfactor p APMSF 1 3葡聚糖 脂多糖 肽聚糖 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 0 Storagetime week POactivityduringstorageat 20 Residualactivity 多酚氧化酶原的cDNA序列及由cDNA序列推導出的氨基酸序列 Pacifastacusleniusculusprophenoloxidase Bombyxmoriprophenoloxidase Drosophilamelanogasterprophenoloxidase Homosapienstyrosinase Oryziaslatipestyrosinase Neurosporacrassatyrosinase Sinorhizobiummelilotityrosinase Proteins identity 57 35 38 15 13 11 14 PanulirusinterruptushemocyaninsubunitA Penaeusvannameihemocyanin Eurypelmacalifornicumhemocyaninsubunita 29 30 38 不同來源的多酚氧化酶原氨基酸序列的同源性比較 pjppo 0 1 lycopoA sopo mdpo papo 1000 889 1000 olty rnty ggty hsty mmty 1000 999 994 1000 bdhex mdhex aghex amhex 1000 886 1000 pihca pihcb 1000 pihcc pvhc1 pvhc2 1000 998 1000 agppo1 bmppo1 1000 bmppo2 msppo 1000 723 dmppo gam2 agppo3 agppo6 1000 987 agppo4 agppo5 1000 962 1000 1000 plppo 1000 825 echcb echcc 1000 echca echcf echce echcg 441 520 echcd 977 504 1000 1000 853 1000 417 973 973 Plantphenoloxidase Vertebratetyrosinase Crustaceanhemocyanin Insectphenoloxidase Cheliceratehemocyanin Crustaceanprophenoloxidase nsty smty Microbialtyrosinase Insecthexamerin DendrogramofPOs 2 血藍蛋白是怎樣被激活的 血藍蛋白 Hc 由肝胰腺分泌在血清中作為氧的運輸載體可作為滲透壓調節劑 蛻皮激素載體 抗菌肽前體從基因序列看 與多酚氧化酶有較大的同源性被激活后 具有多酚氧化酶活性 血細胞組分在激活血藍蛋白的過程中起重要作用 血藍蛋白的激活 Hc HemocyaninHLS HemocyteLysateSupernatant AandC ActivatedHemocyaninBandD NativeHemocyanin NativeHc ActivatedHc 血藍蛋白的激活機理 S Sbond 3 血藍蛋白在對蝦中的存在部位 血藍蛋白存在于蝦類的表皮 在蝦的表皮會發生明顯的黑變 表皮中的血藍蛋白 100mm Stainedwith A Antibody B Toluidineblue C NegativeControl D Secondaryantibody Dorsal Ventral Epicuticle Endocuticle Exocuticle A B C D 4 血藍蛋白僅僅氧化酪氨酸嗎 DOPA Melanin DOPAquinone 5 6 dihydroxyindole DHI DOPAchrome Hemocyanin Tyrosine 血藍蛋白引起的蝦類黑色素的形成過程 DHIandDHICA 5 6 Dihydroxyindole 2 carboxylicacid DHICA 5 6 Dihydroxy