1、免疫功能檢查 Laboratory Diagnosis for Immune Function 第二軍醫大學附屬長征醫院全軍醫學免疫中心高春芳,臨床疾病與免疫的關系 免疫系統性疾病 免疫缺陷病、免疫增殖病 免疫相關性疾病 自身免疫性疾病、變態反應性疾病 感染性疾病 應用免疫學技術診斷、治療性疾病,臨床免疫 自身免疫病 內分泌免疫學 變態反應性疾病 皮膚病免疫學 免疫缺陷性疾病 免疫增殖性疾病 心血管病免疫學 呼吸免疫學 移植免疫學 生殖免疫學 腫瘤免疫學 神經免疫學 傳染免疫學 消化免疫學 風濕病學 血液免疫學 創傷免疫學 免疫治療學 腎病免疫學 免疫預防學,免疫學診斷的定義： 用抗原、抗體結

2、合的技術對與免疫有關的疾病，如免疫增殖病、免疫缺陷病、變態反應、自身免疫、傳染病、惡性腫瘤等作出輔助診斷或特異性診斷。 應用意義：1. 直接測定免疫功能 2. 檢查致病因子 3. 參考作用,免疫功能 (immune function) 體液免疫 (humoral immunity) 細胞免疫(cellular immunity) 免疫球蛋白(immunoglobulin) T細胞 (T-cell) 補體(complement) 細胞因子(cytokines),兩種T輔助細胞不同的細胞因子產生譜 及不同效應,體液免疫測定 免疫球蛋白定量 散射及濁度測定技術 原理是根據抗原和抗體形成的復合物粒子對

3、光的散射和吸收度來判斷待測抗原的量。測定散射光強度的方法稱為nephelometry，測定吸收光強度的方法稱turbidimetry。兩種方法均可采用速率法（rate assay）即反應開始第1分鐘內的光散射或吸收度或終點法（end-point assay），即反應終止時（一般為30min）的光散射度或吸收總量。通過微電腦對數據進行處理，即可知道被檢蛋白質（Ig）的含量 參考值： IgG 815 g/L, IgA 0.93 g/L, IgM 0.52.5 g/L,免疫球蛋白測定的臨床意義 免疫球蛋白升高 非特異性多克隆升高 特異性單克隆升高 免疫球蛋白減低 細胞免疫缺陷、體液免疫缺陷、聯合免疫

4、缺陷 免疫球蛋白缺陷?。簾o球蛋白血癥、選擇性IgA 缺陷癥、選擇性IgM或IgE缺陷,Recombination -22;H-14) 輕鏈、重鏈的基因不連續，必須經過基因重排分別連在一起。 同樣按照DNAmRNA蛋白質這一生物合成的中心法則合成。 重鏈、輕鏈分別在不同的核糖體( polysomes)上合成。 合成后的輕鏈和重鏈在光面內質網裝配成完整的Ig分子(H2L2)。 裝配好的Ig分子進入高爾基氏體進行糖基化，通過分泌泡送至細胞膜表面, 在釋放前可在細胞膜表面停留幾個小時。,H鏈和L鏈的氨基酸數量差別很大,合成的速度也不同,一般合成一條重鏈約需18分鐘,而合成一條輕鏈只需10分鐘, 組成一

5、條完整的Ig(兩條重鏈和兩條輕鏈)則有一條以上輕鏈過剩。多余、過剩的輕鏈由細胞膜分泌到胞外, 再轉入腎臟, 約10在腎小管內分解代謝, 80回吸收,由體內巨噬細胞吞噬降解，10從尿排出。因此, 正常人尿中始終有微量輕鏈排出。正常人尿約含510g/ml, 最大20g/ml, 每天約排25mg/d。因為是正常合成, /也是2:1。這個含量用一般方法是無法測出的。,非特異性免疫球蛋白增殖病 肝病 自身免疫病 慢性感染 惡性腫瘤 免疫母細胞淋巴結病 AIDS,免疫指標不是肝功能的直接指標，但由于肝臟承擔了體內蛋白質的及其它物質的合成與代謝，因此能直接或間接地影響與調節機體的免疫狀態，通過對血清Ig及補

6、體的檢測，可在一定程度上反映受檢者肝臟的疾病和損傷。,血清蛋白電泳,肝病是導致外周血免疫球蛋白非特異性升高的六大病種之一。 急性肝炎多以IgM升高（310天）。 慢性肝炎IgG、IgA皆升高，以IgG為主。 肝硬化則IgG、IgA、IgM皆升高，但以 IgA升高為顯著。 肝癌則IgM降低、IgA升高最明顯。 當然以上這些變化是相對而言，并不是絕對的。,肝臟不是免疫球蛋白的合成場所，但對血清中免疫球蛋白含量起重要的調節作用，這種調節作用表現在： 影響腸道內抗原物質的吸收及處理; 通過Kupffer細胞對抗原呈現特殊遞呈作用; 門體靜脈側枝循環可將腸道來源的抗原直接 暴露在全身免疫系統而誘導機體大

7、量抗體的產 生等。,特異性免疫球蛋白增殖癥 (單克隆增殖和惡性Ig增殖癥) 單克隆增殖是一個細胞在某一分裂階段發生突變, 然后急劇分化、增殖, 并大量表達某種單一的Ig, 這種惡性增殖具有如下特點: 均一型 含量大(達到數克也可高達10余克) 正常成分減少(正常值以下) 比例失調(/或2:1) 出現相關臨床表現(骨骼、腎臟、血液等系統),當Ig異常表達時, 可出現以下三個現象: 被激活、突變的B細胞轉化為前B細胞或漿細胞活性極高,可快速合成Ig, 合成一條H鏈大約需要2.5分鐘, 合成一條L鏈則只需1分鐘。如此, 每合成一分子Ig則會剩余3條輕鏈,多余的輕鏈由尿中排出, 可達1mg/ml以上。

8、 由于突變和激活的細胞是單一克隆, 按一個細胞一種抗體的原則, 所表達的Ig均為單一產物, 亦即一個型、一個亞型、一個基因型。因此, 尿中出現的過剩輕鏈均屬一個型。同樣, 血中增殖的Ig, 多屬一個型。血和尿中/決不是2:1或大于此或小于此。 由于同種抑制和反饋抑制, 當某一克隆細胞大量、快速增殖時, 其他克隆細胞則會被抑制, 大量的均一產物(Ig)也會反饋地抑制正?？寺〉脑鲋澈捅磉_。因此, 除單一克隆產物大量增殖外, 正常Ig則會明顯減少。,多發性骨髓瘤: 發病機率和Ig含量一樣, IgG型最多, IgA型次之, IgM型少見(7S),IgD更少, IgE型罕見(至今發現不過20例)。 巨球

9、蛋白血癥: 屬于IgM型, 由于大量增殖, IgM可發生各種聚合, 正常為19S, 患者可出現24S, 32S等多鐘聚合體。 淋巴瘤: 有時慢性淋巴細胞惡性病變, 也可出現多克隆增殖。,輕鏈病 可分型和型, 亦有雙克隆型。由于尿中出現輕鏈可分多克隆型、單克隆型, 并隨型在診斷中要分析清楚。輕鏈病的診斷必須符合以下三條才能作出決定: 各種Ig正?；驕p少; 血中和尿中出現一條輕鏈帶(電泳后) 臨床上符合一個多發性骨髓瘤的診斷 重鏈病: Ig有5種重鏈則應有5種重鏈病, 但目前只發現了4種, 最多的是重鏈病, 已發現200余例, 重鏈病已報告, 重鏈病只有19例, 重鏈病只有一例報告,重鏈病至今未見

10、報告。,7S IgM病: IgM是19S, 7S是小分子IgM報告不 多, 我國尚未發現。 半分子病: 按機率5種Ig皆可出現半分子病, 但至 今只發現IgG(3例)和IgA(5例)半分子病。除了免疫分析有特點之外, 其他基本上如MM 選擇性或鏈缺乏癥: 本病報告極少, BMG(良性M蛋白血癥)或MGUS(不明意義的M蛋白癥): 屬于一種良性異常增殖、性質不良、/值輕度變化, M蛋白3g/dL, 骨髓漿細胞10等。,Four- M character Monoclonal Multiple Myeloma Malignant,Distribution of serum monoclonal p

11、roteins in 922 cases at the Mayo Clinic in 1992,Epidemiology of MM lAnnual incidence: 4 per 100,000, related to the availability of medical facilities; in the elderly and the improvement of diagnostic techniques. l 1% in all malignant diseases, slight more than 10% in hematologic malignancies. lRaci

12、al difference for incidence rate, lower in Asian. l In persons younger than 50yr: 18% l Median age at diagnosis: 63 yr,Multiple Myeloma ( MM) The annual incidence of MM is 4/100,000 per year Il-6 is a major growth factor in MM 99% of patients have a monoclonal protein in the serum or urine during th

13、e course of their disease The most important prognostic factors are plasma cell labeling index and 2 microglobulin level,Biologic Aspects lSurface markers of malignant plasma cells suggests its origin from a pluripotent stem cell. l CD4 T cells: decreased. l IL-1 and TNF devoted to the bone lesions

14、in myeloma. lIL-6: important myeloma cell growth factor for the progression. lOncogenes related: Ras mutation 47%/33 cases; P53 point mutation l Cytogeneic studies: chromosome abnormalities 50%,Clinical manifestations l Bone pain: 2/3 l Height reduce because of vertebral collapse l Weakness and fati

15、gue because of anemia l Fever because of infectious process l Pallor, most frequent physical finding l Liver palpable in 15% patients, spleen rarely enlarged lExtramedullary plasmacytomas: large, purplish, subcutaneous masses observed late in the course of the disease,Laboratory findings L Normocyti

16、c, normochromic anemia 2/3 L Hypercalcemia L Elevation of serum creatinine level L SPE: M-spike 80% L M-protein: 92% IgG 50%; IgA 20%; free monoclonal light chain 20% L Serum or Urine M protein: 99% L Plasma cells: 10% (5100%), more focal than diffuse, repeated bone marrow examination necessary,Help

17、ful laboratory items for differential diagnosis: The size of the serum M-protein; The amount of urine M-protein; The number of bone marrow plasma cells; The hemoglobin, calcium, and creatinin levels and levels of uninvolved serum Igs;,Prognostic factors l Duration of survival: few months many years,

18、 median 2.53 year. l Uncorrected 2 microglobulin level is one of the most powerful prognostic factors l CRP, which correlated with the serum IL-6 level maybe helpful for determining prognosis l LDH, if elevated indicates poor prognosis,單克隆性免疫球蛋白增殖癥的實驗室診斷要點,免疫球蛋白及輕鏈定量 血清蛋白電泳 免疫固定電泳 尿蛋白電泳及本周氏蛋白定性,補體檢查

19、和有關疾病 總補體活性測定 CH50 單個補體成分定量 C4經典途徑 B因子旁路途徑 C3經典和旁路途徑 臨床意義： 補體減少：腎病、自身免疫性疾病、腫瘤、 補體缺陷病。 補體增加：少見，如腫瘤。,Two Typical Pathway for Complement Activation,Common Pathway for complement activation,補體與肝臟的關系較免疫球蛋白更為密切，部分補體及其抑制因子由肝臟合成，肝臟的感染和炎癥反應可刺激機體免疫系統，導致血清總補體活性及其它補體成分的含量增加，這種現象可見于預后較好的急性病毒性肝炎早期。 當肝實質受到嚴重損傷時，補體

20、成分的合成相應減少，這種減少往往在肝病的晚期，同時伴有顯著的肝功能受損。 此外任何造成肝實質損傷與肝臟流動力學變化均可導致循環免疫復合物在外周血中的積聚，其結果導致對補體的過量激活，使血清中補體含量消耗性降低，急性降低多見于急性重癥肝炎，慢性消耗性減低主要發生在多種補體成分自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、肝硬化及其它原因導致的肝病晚期。,細胞免疫功能測定,抗原特異T細胞檢測,細胞毒性T細胞檢測,流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是八十年代發展起來的一項利用流式細胞儀進行分析的新技術。流式細胞術集激光術、微電腦、單克隆抗體技術、細胞色素化學于一體，形成了快速、準確的分析和細胞分

21、選技術方法。FCM在臨床和基礎研究中的價值主要體現于免疫表型分析、DNA含量分析和細胞分選三個方面。其中免疫表型分析在細胞免疫功能測定中起著重要作用。,FCM原理 用細胞表面特異性單克隆抗體與細胞作用，再利用熒光結合的第二抗體與之作用。通過抗原抗體反應，使陽性細胞標上熒光，此為間接標記法或將特異性單抗先標記上熒光再直接與細胞結合發光，此為直接標記法，當細胞流經流式細胞儀，激光束（488nm）對高速通過的細胞流照射，使熒光染料產生不同波長的散射光，光信號收集后經由PMT（光電倍增管）放大并加以分析處理，在短時可獲取細胞大小、核質比、熒光強度和陽性百分比等數據。,流式細胞術的幾個重要特點 標本只要

22、是單細胞即可用于分析 極短時間內可分析大量細胞 可同時分析單個細胞的多種特征 定性或定量分析,FCM對細胞免疫功能的檢測主要用于 1、細胞分群和細胞亞群的分析 利用CD45/CD14可以分出外周血中的白細胞和單核細胞，在白細胞內利用CD3、CD19、CD20、CD3/(CD16+56)+ 等標記進一步可分出T、B淋巴細胞和NK細胞等。在T細胞內又有CD4/CD8標志的T輔助/誘導和T抑制/殺傷亞群利用CD4/CD29、CD8/CD28標志可以將T4、T8進一步分出各亞群。 2、檢測淋巴細胞的活化 CD3/HLA-DR、CD3/CD25、CD69等都是活化T淋巴細胞的特異性標記，另有C17單抗是

23、活化的細胞毒T淋巴細胞的標志物。其比值的改變對病情監測，療效判斷有重要的指導意義。 3、一些特殊的標志如CD4/CD8比值是AIDS、自身免疫性疾病病程監測的重要指標。,當前流式細胞分析的發展趨勢(1) 從相對細胞計數到絕對細胞計數 淋巴細胞亞群、造血干細胞、網織紅細胞、血小板等 從相對定量到絕對定量 定量抗體微球法 定量熒光素分子微球法 從單色到多色熒光分析 特別適用于淋巴細胞亞群分析、白血病免疫表型分析、 細胞功能評價,當前流式細胞分析的發展趨勢(2) 從細胞膜成分到細胞內成分分析 胞漿酶、細胞因子等多種成分分析 液體中可溶性成分的流式細胞術分析 流式微球分析 流式分子表型分析 Molecular phenotyping 用流式細胞計數檢測細胞中特異性核酸序列或 特異性基因異常。分析表型與免疫表型分析技術相結合，對于分析特定細胞群的功能和特性提供廣闊應用前景。,常用外周血表型分析值* CD分類 意 義 正常值（）X2S CD3 總T淋巴細胞 65.869.60 CD2 花環形成細胞 77.469.27 CD4 T輔助/T誘導亞群 37.538.