PAGEPAGE33第35講基因工程[考綱明細]1.基因工程的誕生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技術(含PCR技術)(Ⅱ)3.基因工程的應用(Ⅱ)4.蛋白質工程(Ⅰ)試驗：DNA的粗提取與鑒定學問自主梳理一、基因工程的概念及基本工具1．基因工程概念2．DNA重組技術的基本工具(1)限制性核酸內切酶(簡稱：eq\o(□,\s\up3(07))限制酶)①來源：主要是從eq\o(□,\s\up3(08))原核生物中分別純化出來的。②作用：識別雙鏈DNA分子的某種特定的eq\o(□,\s\up3(09))核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的eq\o(□,\s\up3(10))磷酸二酯鍵斷開。③結果：產生eq\o(□,\s\up3(11))黏性末端或eq\o(□,\s\up3(12))平末端。例：如下圖所示，EcoRⅠ限制酶識別的堿基序列是eq\o(□,\s\up3(13))—GAATTC—，切割位點在eq\o(□,\s\up3(14))G和A之間；SmaⅠ限制酶識別的堿基序列是eq\o(□,\s\up3(15))—CCCGGG—，切割位點在eq\o(□,\s\up3(16))C和G之間；說明限制酶具有eq\o(□,\s\up3(17))特異性。④本質：蛋白質。[深化思索]限制酶為何不切割自身DNA?提示限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別一種特定的堿基序列，并在特定的位點上進行切割；限制酶不切割自身DNA的緣由是自身DNA中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。(2)DNA連接酶①作用：將限制酶切割下來的DNA片段eq\o(□,\s\up3(20))拼接成新的DNA分子。復原被限制酶切開的兩個核苷酸之間的eq\o(□,\s\up3(21))磷酸二酯鍵。②類型③DNA連接酶和限制酶的關系(3)載體①載體的作用：攜帶外源DNA片段進入受體細胞。②常用載體：eq\o(□,\s\up3(26))質粒。其他載體：λ噬菌體衍生物、eq\o(□,\s\up3(27))動植物病毒等。③質粒a．概念：質粒是一種袒露的、結構簡潔、獨立于細菌eq\o(□,\s\up3(28))擬核DNA之外，并具有自我復制實力的很小的雙鏈eq\o(□,\s\up3(29))環狀DNA分子。b．特點：能自我復制；有一個至多個eq\o(□,\s\up3(30))限制酶切割位點；有特別eq\o(□,\s\up3(31))標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。二、基因工程的基本操作程序1．目的基因的獲得目的基因：主要指eq\o(□,\s\up3(01))編碼蛋白質的基因，也可以是一些具eq\o(□,\s\up3(02))調控作用的因子。(1)從基因文庫中獲得①前提條件：eq\o(□,\s\up3(06))目的基因序列未知。②基因文庫：將含有某種生物不同基因的很多eq\o(□,\s\up3(07))DNA片段，導入受體菌的群體中eq\o(□,\s\up3(08))儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，可分為eq\o(□,\s\up3(09))基因組文庫和eq\o(□,\s\up3(10))部分基因文庫(如cDNA文庫)。③構建過程(2)利用PCR技術擴增目的基因①PCR含義：是一項在生物體外eq\o(□,\s\up3(18))復制特定DNA片段的核酸合成技術。②PCR原理：DNAeq\o(□,\s\up3(19))雙鏈復制。③前提條件：有一段已知目的基因的eq\o(□,\s\up3(20))核苷酸序列，以便依據這一序列合成eq\o(□,\s\up3(21))引物。④要求模板：eq\o(□,\s\up3(22))目的基因兩條鏈。原料：四種脫氧核苷酸。酶：熱穩定eq\o(□,\s\up3(23))DNA聚合酶(eq\o(□,\s\up3(24))Taq酶)。引物：人工合成的兩條eq\o(□,\s\up3(25))DNA片段(引物1，引物2)。⑤PCR反應過程⑥方式：指數形式擴增(2n，n為擴增循環的次數)。⑦結果：eq\o(□,\s\up3(32))短時間內大量擴增目的基因。(3)人工合成①前提條件：核苷酸序列eq\o(□,\s\up3(33))已知，基因eq\o(□,\s\up3(34))比較小。②方法a．反轉錄法：目的基因的mRNAeq\o(→,\s\up17(反轉錄))eq\o(□,\s\up3(35))單鏈DNAeq\o(→,\s\up17(合成))雙鏈DNA(目的基因)b．化學合成法：蛋白質的氨基酸序列eq\o(→,\s\up17(推想))eq\o(□,\s\up3(36))mRNA的核苷酸序列eq\o(→,\s\up17(推想))eq\o(□,\s\up3(37))目的基因的核苷酸序列eq\o(→,\s\up17(化學),\s\do17(合成))目的基因2．基因表達載體的構建——基因工程的核心(1)操作目的使目的基因在受體細胞中eq\o(□,\s\up3(38))穩定存在，并且可以eq\o(□,\s\up3(39))遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠eq\o(□,\s\up3(40))表達和發揮作用。(2)組成(3)構建過程[深化思索]獲得目的基因與切割載體時只能用同一種限制酶嗎？提示不是只能用一種限制酶，也可以用不同的限制酶，只要切割后目的基因和載體的黏性末端相同即可。3．將目的基因導入受體細胞(1)將目的基因導入植物細胞①eq\o(□,\s\up3(54))農桿菌轉化法：最常用的方法。a．受體細胞：植物eq\o(□,\s\up3(55))體細胞或受精卵。b．操作過程：將目的基因插入eq\o(□,\s\up3(56))Ti質粒的T-DNA上→轉入eq\o(□,\s\up3(57))農桿菌→導入eq\o(□,\s\up3(58))植物細胞→T-DNA上的目的基因整合到eq\o(□,\s\up3(59))受體細胞的染色體DNA上→目的基因表達。②基因槍法：適用于eq\o(□,\s\up3(60))單子葉植物，成本較高。③花粉管通道法：將目的基因通過eq\o(□,\s\up3(61))花粉管通道導入受體細胞，非常簡便經濟。(2)將目的基因導入動物細胞①方法：eq\o(□,\s\up3(62))顯微注射技術。②受體細胞：動物的eq\o(□,\s\up3(63))受精卵。③操作過程：將含有eq\o(□,\s\up3(64))目的基因的表達載體提純→取卵(eq\o(□,\s\up3(65))受精卵)→eq\o(□,\s\up3(66))顯微注射→受精卵經胚胎早期培育后，eq\o(□,\s\up3(67))移植到雌性動物的eq\o(□,\s\up3(68))輸卵管或子宮內→獲得具有eq\o(□,\s\up3(69))新性狀的動物。[深化思索]獲得轉基因動物時，通常選擇受精卵做受體細胞的緣由？提示受精卵全能性高，可使目的基因在相應的組織細胞內表達。(3)將目的基因導入微生物細胞①轉化方法a．用eq\o(□,\s\up3(70))Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能汲取四周環境中DNA分子的生理狀態(這種細胞稱為eq\o(□,\s\up3(71))感受態細胞)。b．感受態細胞汲取eq\o(□,\s\up3(72))重組表達載體DNA分子。②受體細胞：原核細胞(運用最廣泛的是大腸桿菌)。③原核生物的特點：繁殖快、多為單細胞、eq\o(□,\s\up3(73))遺傳物質相對較少等。4．目的基因的檢測與鑒定(1)不論是復制水平、轉錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在eq\o(□,\s\up3(77))體外進行的。(2)在DNA分子、mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉錄時，用的探針都是用eq\o(□,\s\up3(78))放射性同位素等作標記的含有eq\o(□,\s\up3(79))目的基因的DNA片段。三、基因工程的應用1．轉基因植物植物基因工程技術主要用于提高農作物的抗逆實力(如抗除草劑、抗蟲、抗病、eq\o(□,\s\up3(01))抗干旱和抗鹽堿等)，以及改良eq\o(□,\s\up3(02))農作物的品質和利用植物eq\o(□,\s\up3(03))生產藥物等方面。2．轉基因動物動物基因工程在動物品種改良、建立eq\o(□,\s\up3(04))生物反應器、器官移植等方面顯示了廣袤的應用前景。3．基因工程藥物(1)來源：轉基因的eq\o(□,\s\up3(05))工程菌。(2)成果：細胞因子、抗體、疫苗、激素等。(3)作用：用來預防和治療人類腫瘤、心血管疾病、eq\o(□,\s\up3(06))遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風濕等疾病。4．基因治療(1)方法：把eq\o(□,\s\up3(07))正常基因導入病人體內，使該基因的表達產物發揮功能。(2)效果：治療eq\o(□,\s\up3(08))遺傳病的最有效的手段。(3)分類：eq\o(□,\s\up3(09))體內基因治療和體外基因治療。四、蛋白質工程1．概念：蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過eq\o(□,\s\up3(01))基因修飾或eq\o(□,\s\up3(02))基因合成，對現有蛋白質進行eq\o(□,\s\up3(03))改造，或制造一種eq\o(□,\s\up3(04))新的蛋白質，以滿意人類生產和生活的需求。2．基本途徑：預期蛋白質功能→設計預期蛋白質結構→推想應有的eq\o(□,\s\up3(05))氨基酸序列→找到對應的eq\o(□,\s\up3(06))脫氧核苷酸序列(基因)。

考點題型突破考點1基因工程的操作工具題型一限制性核酸內切酶及DNA連接酶等酶的作用1．(2024·全國卷Ⅲ)圖a中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，圖b為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。依據基因工程的有關學問，回答下列問題：(1)經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產物連接，理由是__________________________________________________________________________________。(2)若某人利用圖b所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖c所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有________，不能表達的緣由是____________________________________________________________________。(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有____________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是________________。答案(1)Sau3AⅠ兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄(其他合理答案也可)(3)E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶(其他合理答案也可)解析(1)分析圖a可知，限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故經這兩種酶切割得到的產物可以用DNA連接酶進行連接。(2)構建基因表達載體時，為保證目的基因能在宿主細胞中勝利表達，目的基因應插入在啟動子和終止子之間，據此可推斷甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被轉錄。(3)常見的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。學問拓展與DNA相關的六種酶的比較題型二載體的作用及特點2．(2024·全國卷Ⅰ)某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物干脆轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題：(1)質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有______________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿意上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。(2)假如用含有氨芐青霉素的培育基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的，其緣由是________________________________________________；并且____________和____________________________________________的細胞也是不能區分的，其緣由是_______________________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需運用含有________________的固體培育基。(3)基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于______________。答案(1)能自我復制、具有標記基因(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培育基上均不生長含有質粒載體含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培育基上均能生長四環素(3)受體細胞解析(1)質粒作為載體應具備的基本條件有：能自我復制、具有標記基因、含有一至多個限制酶切割位點等。(2)由題意可知，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞中均不含有氨芐青霉素抗性基因，所以在含有氨芐青霉素的培育基上均不能生長。質粒載體上含有氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因，插入了目的基因的重組質粒中僅含有氨芐青霉素抗性基因(四環素抗性基因被破壞)，所以含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的細胞均能在含有氨芐青霉素的培育基上生長，但前者可以在含有四環素的培育基上生長而后者不能，所以可用含有四環素的培育基，篩選出含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落。(3)噬菌體屬于病毒，病毒增殖過程中所需的原料、酶等均來自于受體細胞。考點2基因工程的基本操作程序題型一目的基因的獲得1．基因工程又稱為DNA重組技術，回答相關問題：Ⅰ.(1)在基因工程中，獲得目的基因主要有兩大途徑，即________和從________中分別。(2)利用某植物的成熟葉片為材料，同時構建cDNA文庫和基因組文庫，兩個文庫相比，cDNA文庫中含有的基因數目比基因組文庫中的少，其緣由是________________________。(3)在基因表達載體中，啟動子是________聚合酶識別并結合的部位。若采納原核生物作為基因表達載體的受體細胞，最常用的原核生物是________。Ⅱ.將外源生長激素基因導入綿羊體內，轉基因綿羊的生長速度比一般綿羊提高30%，體型增大50%。外源生長激素基因除可以從基因組文庫中獲得外，還可通過以下途徑合成：一是利用從供體動物的________細胞中提取的mRNA，在________酶催化下合成；二是通過分析生長激素的________序列推想基因的結構，進而人工合成。這兩種途徑合成的生長激素基因________(填“相同”或“不同”)，緣由是_____________________________________________________。答案Ⅰ.(1)人工合成已有物種(2)cDNA文庫中只含有葉片細胞已轉錄(或已表達)的基因，而基因組文庫中含有該植物的全部基因(3)RNA大腸桿菌Ⅱ.垂體逆轉錄氨基酸不同一種氨基酸可能不只由一種密碼子確定(密碼子的簡并性)解析Ⅰ.(1)獲得目的基因的途徑，一是人工合成，二是從自然界已有物種中分別。(2)基因組文庫中含有該植物的全部基因，而cDNA文庫中只含有已經轉錄的基因。(3)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位；最常用的原核生物受體細胞是大腸桿菌。Ⅱ.生長激素是垂體合成分泌的，故只有在垂體細胞中才能提取到生長激素基因轉錄形成的mRNA，再在逆轉錄酶的催化作用下合成生長激素基因；也可以通過分析生長激素的氨基酸序列，推想出其mRNA中的堿基序列，進而推想誕生長激素基因中的堿基序列，最終用化學方法人工合成。因為確定氨基酸的密碼子具有簡并性，因而這兩種方法合成的生長激素基因結構可能不同。技法提升獲得目的基因的方法選擇(1)假如不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構建基因文庫的方法，即通過受體菌儲存并擴增目的基因后，從基因文庫中獲得目的基因。(2)假如知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過DNA合成儀利用化學方法干脆人工合成。(3)假如知道要擴增的目的基因及兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，可以通過PCR技術擴增目的基因。題型二PCR技術原理及應用2．多聚酶鏈式反應(PCR技術)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延長等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以快速擴增，其簡要過程如圖所示。下列關于PCR技術敘述不正確的是()A．PCR技術是在試驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術B．反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板C．PCR技術中以核糖核苷酸為原料，以指數方式擴增D．應用PCR技術與探針雜交技術可以檢測基因突變答案C解析PCR技術是體外大量擴增DNA的技術，即以少量DNA制備大量DNA的技術，A正確；PCR技術的原理是DNA雙鏈復制，反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板，所需原料是脫氧核苷酸，并以指數方式擴增，B正確，C錯誤。3．(2024·江蘇高考)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結合蛋白，某探討小組安排通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得目的基因，構建轉基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題：(1)從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過________獲得________用于PCR擴增。(2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為便利構建重組質粒，在引物中須要增加適當的____________________位點。設計引物時須要避開引物之間形成________，而造成引物自連。(3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延長，這三個步驟組成一輪循環。(4)PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。退火溫度過高會破壞________的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但________的引物須要設定更高的退火溫度。(5)假如PCR反應得不到任何擴增產物，則可以實行的改進措施有________(填序號：①上升退火溫度②降低退火溫度③重新設計引物)。答案(1)逆轉錄cDNA(2)限制性核酸內切酶堿基互補配對(3)變性(4)引物與模板GC含量高(5)②③解析(1)目的基因的獲得：從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉錄獲得cDNA用于PCR的擴增。(2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為便利基因與載體相連構建重組質粒，在引物中須要增加適當的限制性核酸內切酶位點。為了避開引物自連，設計引物時須要避開引物之間形成堿基互補配對。(3)依據PCR的過程可知，圖中步驟1為變性，步驟2為退火，步驟3為延長，這三個步驟構成一輪循環。(4)退火溫度過高，會破壞引物與模板的堿基配對。因A、T之間形成兩個氫鍵，G、C之間形成三個氫鍵，形成G、C堿基對須要更多的能量，故須要更高的溫度。(5)假如PCR反應得不到任何擴增產物，可能的緣由是退火溫度過高，或者設計的引物不合適，不能與模板結合。因此可實行的改進措施有降低退火溫度、重新設計引物等。學問拓展PCR技術與體內DNA復制的異同點題型三基因表達載體的構建4．在基因表達載體的構建中，下列說法不正確的是()①一個表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子②有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA③終止子的作用是使轉錄在所須要的地方停止④全部基因表達載體的構建是完全相同的A．②③B．①②C．①④D．③④答案C解析一個表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等，①錯誤；啟動子能啟動轉錄過程，即有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA，②正確；終止子的作用是使轉錄在所須要的地方停止，③正確；不同的基因表達載體構建方法不同，④錯誤。綜上所述，C符合題意。5．(2024·江蘇高考)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題：(1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入處于________態的大腸桿菌中。(2)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培育基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________________________。(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。(4)若用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。答案(1)BclⅠ和HindⅢDNA連接感受(2)四環素引物甲和引物丙(3)eq\a\vs4\al(TGATCC,ACTAGG)eq\a\vs4\al(\b\lc\(\rc\)(\a\vs4\al\co1(GGATCA,CCTAGT)))都不能(4)7解析(1)由題圖可知，質粒的兩個標記基因中都含有BamHⅠ的切點，因此不能用BamHⅠ進行切割，結合題干及表中信息可知質粒中不含Sau3AⅠ的切點，因此也不能用Sau3AⅠ進行切割，所以只能用質粒中和目的基因兩端都含有切點的BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶來切割目的基因和質粒。酶切后的載體和目的基因片段，通過DNA連接酶作用后獲得重組質粒。要將重組質粒轉入大腸桿菌，要先用CaCl2處理大腸桿菌，使其處于感受態。(2)重組質粒中只含有四環素抗性基因這一個標記基因，所以為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培育基中添加四環素，含有重組質粒的大腸桿菌能在該平板上長出菌落。要用PCR擴增目的基因，所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙，因為從圖2中可以看出，引物甲與引物丙與模板鏈結合后能完成目的基因的復制。(3)BamHⅠ酶切的DNA末端是eq\a\vs4\al(G,CCTAG)，BclⅠ酶切的DNA末端是eq\a\vs4\al(T,ACTAG)，這兩個末端連接后的連接部位的6個堿基對序列為eq\a\vs4\al(TGATCC,ACTAGG)eq\a\vs4\al(\b\lc\(\rc\)(\a\vs4\al\co1(GGATCA,CCTAGT)))，由于連接后的6個堿基對序列中沒有BamHⅠ和BclⅠ能識別的酶切位點，故對于該部位BamHⅠ和BclⅠ都不能將其切開。(4)因為質粒的BamHⅠ和BclⅠ識別序列中都有Sau3AⅠ的識別序列和切割位點，所以用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ切點及得到的7種大小不同的DNA片段狀況如下：①切點在1或2或3的位置可以分別得到1種DNA分子，但其大小相同；②切點在1和2的位置可以得到2種DNA分子；③切點在1和3的位置可以得到2種DNA分子；④切點在2和3的位置可以得到2種DNA分子，故最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。技法提升1.基因表達載體構建時限制酶的選擇(1)依據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避開目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可運用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。(2)依據質粒的特點確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一樣(也可以是能形成相同黏性末端的不同限制酶)，以確保具有相同的黏性末端。②質粒作為載體必需具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因；假如所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復制起點區，則切割重組后的片段進入受體細胞后將不能自主復制。2.基因表達載體中啟動子、終止子的來源(1)假如目的基因是從自然界中已有的物種中分別出來的，目的基因中已含有啟動子、終止子，在構建基因表達載體時，不須要在質粒上接上特定的啟動子、終止子。(2)假如目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。因此，在構建基因表達載體時，須要在與質粒結合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。題型四目的基因的導入與檢測6．下面為利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是()A．②的構建須要限制性核酸內切酶和DNA聚合酶參加B．③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現出抗蟲性狀D．⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了可遺傳變異答案D解析構建重組質粒須要用到限制性核酸內切酶和DNA連接酶，不須要DNA聚合酶，A錯誤；含重組Ti質粒的農桿菌侵染植物細胞后，重組Ti質粒的T-DNA整合到受體細胞的染色體上，而不是重組Ti質粒整合到受體細胞的染色體上，B錯誤；導入受體細胞的目的基因表達后，轉基因植株方能表現出相應性狀，若目的基因在受體細胞中不表達，轉基因植株不能表現出相應性狀，C錯誤；⑤表現出抗蟲性狀則表明該植株細胞發生了基因重組，基因重組是可遺傳變異，D正確。7．(2024·威海模擬)科學家將人的生長激素基因與某種細菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子進行重組，并勝利地在該細菌中得以表達(如下圖)。請據圖分析回答：(1)細菌是志向的受體細胞，這是因為它__________________。(2)質粒A與目的基因結合時，首先須要用________酶將質粒切開“缺口”，然后用________酶將質粒與目的基因“縫合”起來。(3)若將細菌B先接種在含有________的培育基上能生長，說明該細菌中已經導入外源質粒，但不能說明外源質粒是否勝利插入目的基因；若將細菌B再重新接種在含有________的培育基上不能生長，則說明細菌B中已經導入了插入目的基因的重組質粒。答案(1)繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少(2)限制性核酸內切DNA連接(3)氨芐青霉素四環素解析(1)細菌具有繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少等優點，因此是基因工程中的志向的受體細胞。(2)構建基因表達載體時，需先用限制酶分別切割目的基因和載體，再用DNA連接酶將兩者連接起來。(3)質粒A和重組質粒中都有完整的氨芐青霉素抗性基因，因此細菌有氨芐青霉素抗性說明該細菌中已經導入外源質粒，但不能說明外源質粒是否勝利插入目的基因；重組質粒中四環素抗性基因內插入了目的基因，不能表達，因此若細菌再對四環素無抗性，則說明細菌B中已經導入了插入目的基因的重組質粒。技法提升如何篩選出含有目的基因的受體細胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，假如插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。(2)被轉化的細菌有三種：含環狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含質粒的細菌。(3)篩選方法：將含有重組質粒的細菌先放在含氨芐青霉素的培育基上培育，能生長的是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環素的培育基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培育基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最終，可在含氨芐青霉素的培育基上挑取1、5菌落進行培育。考點3基因工程的應用及蛋白質工程題型一基因工程的應用1．(2024·山東聊城二模)一般番茄細胞中含有PG基因，其能限制合成多聚半乳糖醛酸酶(簡稱PG)，PG能破壞細胞壁使番茄軟化不耐貯藏。科學家將抗PG基因導入番茄細胞，培育出了抗軟化、保鮮時間長的轉基因番茄。如圖表示抗PG基因的作用原理，回答下列問題：(1)據圖回答該轉基因番茄具有抗軟化、保鮮時間長的原理是______________________________。(2)為培育抗軟化番茄，應采納________技術將抗PG基因進行體外擴增。在該技術的反應體系中除模板、引物、原料外，還須要加入________，這個基因的表達須要________等不行缺少的調控組件。(3)將抗PG基因插入Ti質粒的________上構建基因表達載體，通過農桿菌轉化法將抗PG基因導入番茄細胞，為檢驗抗PG基因是否勝利表達，在個體生物學水平上應檢測______________________。(4)為避開抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導致“基因污染”，應將抗PG基因導入________(填“細胞核”或“細胞質”)。答案(1)抗PG基因能阻擋PG基因表達的翻譯過程，使細胞不能合成PG(2)PCR(多聚酶鏈式反應)熱穩定DNA聚合酶(Taq酶)啟動子、終止子(3)T－DNA轉基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短(4)細胞質解析(1)據題圖可知，抗PG基因轉錄成的mRNA能夠與PG基因轉錄成的mRNA結合，阻擋了PG基因表達的翻譯過程，使細胞不能合成PG，不能破壞細胞壁而使轉基因番茄抗軟化且保鮮時間延長。(2)采納PCR技術將抗PG基因進行體外擴增；PCR過程所須要的條件有：模板(抗PG基因)、引物、原料(四種游離的脫氧核糖核苷酸)、熱穩定DNA聚合酶；啟動子、終止子等是基因表達不行缺少的調控組件。(3)將抗PG基因插入Ti質粒的T－DNA上構建基因表達載體，通過農桿菌轉化法將抗PG基因導入番茄細胞，為檢驗抗PG基因是否勝利表達，在個體生物學水平上應檢測轉基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短。(4)花粉中的雄配子幾乎不含質基因，所以為避開抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導致“基因污染”，應將抗PG基因導入細胞質。題后歸納有關基因工程應用的四個易錯點(1)動物基因工程主要是為了改善畜產品的品質，而不是為了產生體型巨大的個體。(2)Bt毒蛋白基因限制合成的Bt毒蛋白并無毒性，進入昆蟲消化道被分解成多肽后產生毒性。(3)青霉素是青霉菌產生的，不是通過基因工程產生的。(4)并非全部個體都可作為乳腺生物反應器。操作勝利的應當是雌性個體，個體本身的繁殖速度較高，泌乳量、蛋白含量等都是應當考慮的因素。題型二蛋白質工程2．(2015·全國卷Ⅱ)已知生物體內有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。假如將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，變更后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列問題：(1)從上述資料可知，若要變更蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的________進行改造。(2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內容包括________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流淌，即：________________________________。(3)蛋白質工程也被稱為其次代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質功能動身，通過__________________和__________________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據此獲得基因，再經表達、純化獲得蛋白質，之后還須要對蛋白質的生物________進行鑒定。答案(1)氨基酸序列(或結構)(2)PP1DNA和RNA(或遺傳物質)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(或轉錄、逆轉錄、翻譯)(3)設計蛋白質的結構推想氨基酸序列功能解析(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質的功能發生了變更，此過程是通過對構成蛋白質的氨基酸序列進行改造，進而變更了蛋白質的結構，從而變更了蛋白質的功能。(2)在蛋白質工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎，對生物體內原有P基因進行修飾，也可以通過人工合成法合成新的P1基因。所獲得的基因表達遵循中心法則時，中心法則的全部內容包括DNA和RNA復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流淌，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白質。(3)蛋白質工程的基本途徑是預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推想應有的氨基酸序列→合成DNA→表達出蛋白質，經過該過程得到的蛋白質，須要對其生物功能進行鑒定，以保證其發揮正常作用。學問拓展蛋白質工程與基因工程的比較試驗16DNA的粗提取與鑒定1．DNA粗提取和鑒定的原理(1)提取思路：利用DNA和其他物質在理化性質方面的差異，提取DNA。(2)DNA的理化性質(提取和鑒定原理)：①DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同②DNA不溶于酒精；③對酶、高溫柔洗滌劑的耐受性強；④DNA＋二苯胺試劑eq\o(→,\s\up17(沸水浴))藍色。2．DNA粗提取和鑒定的操作流程1．(2024·揚州江都中學段考)下列有關“DNA的粗提取與鑒定”試驗的敘述，錯誤的是()A．DNA既溶于2mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水B．向雞血細胞液中加蒸餾水是為了釋放出DNAC．向濃鹽溶液中加蒸餾水是為了析出DNAD．用菜花替代雞血做試驗，其試驗操作步驟相同答案D解析DNA既溶于2mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水，A正確；向雞血細胞液中加蒸餾水是為了讓雞血細胞吸水漲破，從而釋放出DNA，B正確；向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸餾水是為了降低DNA的溶解度，進而析出DNA，C正確；用菜花替代雞血作為試驗材料，其試驗操作步驟不完全相同，如植物細胞有細胞壁，破裂細胞時須要充分攪拌和研磨并加入食鹽和洗滌劑，D錯誤。2．下列關于“DNA的粗提取和鑒定”試驗依據原理的敘述，錯誤的是()A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白質能溶于酒精溶液，可將DNA與蛋白質分別B．利用高溫能使蛋白質變性，卻對DNA沒有影響的特性，可將DNA與蛋白質分別C．利用二苯胺與DNA沸水浴呈現藍色可用于DNA的鑒定D．在DNA濾液中加入嫩肉粉，通過木瓜蛋白酶的作用，可將DNA與蛋白質分別答案B解析高溫能使蛋白質、DNA變性，蛋白質在60～80℃發生變性，而DNA在80℃以上才變性，不能將DNA與蛋白質分別。3．下列關于“DNA粗提取與鑒定”試驗的敘述，正確的是()答案A解析蒸餾水與雞血細胞混合的目的是使紅細胞吸水漲破，釋放出核物質，B錯誤；將蒸餾水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C錯誤；加入冷卻酒精的目的是進一步析出DNA，D錯誤。題后歸納DNA的粗提取與鑒定試驗中的“2、4、4”方向真題體驗1．(2024·全國卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同。回答下列問題：(1)據圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，運用了兩種限制酶，這兩種酶是____________。運用這兩種酶進行酶切是為了保證______________，也是為了保證__________________。(2)將P1轉入體外培育的牛皮膚細胞后，若在該細胞中視察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了________和________過程。(3)為了獲得含有甲的牛，該團隊須要做的工作包括：將能夠產生綠色熒光細胞的________移入牛的________________________中、體外培育、胚胎移植等。(4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的________(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。答案(1)E1和E4甲的完整甲與載體正確連接(2)轉錄翻譯(3)細胞核去核卵母細胞(4)核DNA解析(1)甲是將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端而獲得的L1－GFP融合基因，據此結合題意并分析圖示可知：該團隊在將甲插入質粒P0時，假如用E2或E3，則目的基因不完整，而運用E1和E4這兩種限制酶進行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，運用的兩種限制酶是E1和E4。(2)構建的真核表達載體P1中含有GFP基因，而GFP基因的表達產物“某種熒光蛋白(GFP)”在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光。若在導入P1的牛皮膚細胞中視察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了表達。基因的表達過程包括轉錄和翻譯。(3)若要獲得含有甲的牛，可采納核移植技術，即將能夠產生綠色熒光細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，并將該重組細胞在體外培育成重組胚胎，再經過胚胎移植等獲得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，是一種在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板。2．(2024·江蘇高考)為生產具有特定性能的α－淀粉酶，探討人員從某種海洋細菌中克隆了α－淀粉酶基因(1656個堿基對)，利用基因工程大量制備α－淀粉酶，試驗流程如圖。請回答下列問題：(1)利用PCR技術擴增α－淀粉酶基因前，需先獲得細菌的________。(2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是________________________________________________。(3)進行擴增時，反應的溫度和時間需依據詳細狀況進行設定，下列選項中________的設定與引物有關，________的設定與擴增片段的長度有關。(填序號)①變性溫度②退火溫度③延長溫度④變性時間⑤退火時間⑥延長時間(4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α－淀粉酶的mRNA的部分堿基序列：5′－eq\x(AUGCCAUCAACAAAUACUAACACU)U……－3′圖中虛線框內mRNA片段包含________個密碼子，如虛線框后的序列未知，預料虛線框后的第一個密碼子最多有________種。(5)獲得工程菌表達的α－淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結果如下：依據上述試驗結果，初步推斷該α－淀粉酶活性最高的條件為____________________________________________________。答案(1)基因組DNA(2)5′使DNA片段能定向插入表達載體，削減自連(3)②⑥(4)813(5)pH為8.5，緩沖液為50mmol/LTirs－HCl解析(1)由題干信息可知某種海洋細菌含有α－淀粉酶基因，因此在擴增α－淀粉酶基因前需先從細菌中提取細菌的基因組DNA。(2)由于引物的作用是引導子鏈的延長，將脫氧核苷酸連接到引物上時，是與引物的3′端相連的，由此確定需在引物的5′端加上限制性酶切位點。常在兩條引物上加入不同的限制酶切位點的主要目的是使DNA片段能定向插入表達載體，防止自身相連。(3)進行PCR擴增時，退火的溫度與引物長短和堿基種類有關。延長時間長短的設定與擴增片段的長度有關。(4)密碼子是指mRNA上確定一個氨基酸的三個相鄰的堿基，該mRNA上5′端為AUG(起始密碼子)，因此可依據三個堿基是一個密碼子來分析圖中虛線框中的堿基，可得出共有8個密碼子。由于虛線框后的第一個密碼子的第一個堿基已經固定為U，因此還有2個堿基未知，共可能有的種數為4×4＝16，又因為UAG、UGA、UAA為終止密碼子，因此確定氨基酸的密碼子最多有13種。(5)據表格數據可知：α－淀粉酶在pH為8.5、緩沖液為50mmol/LTris－HCl的條件下相對活性為99.5%，初步推斷此條件下酶活性最高。3．(2024·天津高考)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規模流行。我國科學家在2024年獨創了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環節如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細胞內的增殖實力。以病毒RNA為模板，逆轉錄成對應DNA后，利用________技術擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不能合成完整長度的________，因此不能產生子代病毒。將該改造基因、表面抗原基因等其他基因分別構建重組質粒，并保存。(2)構建適合改造病毒增殖的轉基因宿主細胞。設計合成一種特別tRNA的基因，其產物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結合，并可攜帶一個非自然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的________進行分子雜交鑒定，篩選獲得勝利表達上述tRNA的轉基因宿主細胞。(3)利用轉基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質粒導入(2)中的轉基因宿主細胞，并在補加________的培育基中進行培育，則該宿主細胞能利用上述特別tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產生大量子代病毒，用于制備疫苗。特別tRNA基因轉錄時，識別其啟動子的酶是________(單選)。A．病毒的DNA聚合酶B．宿主的DNA聚合酶C．病毒的RNA聚合酶D．宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖，沒有致病性，因此不經滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優勢之一是可引起________免疫，增加免疫愛護效果。答案(1)PCR多肽(或蛋白質)(2)載體總RNA(3)非自然氨基酸(Uaa)D(4)細胞解析(1)利用PCR技術體外擴增DNA。若將基因中個別編碼氨基酸的序列替換為編碼終止密碼子的序列，則改造后的基因轉錄合成的mRNA中，終止密碼子提前出現，將不能限制合成完整長度的多肽(或蛋白質)。(2)目的基因只有與載體連接后才能導入宿主細胞。可提取宿主細胞的總RNA進行分子雜交鑒定，以篩選獲得勝利表達題述tRNA的轉基因宿主細胞。(3)由(2)知，轉基因宿主細胞含有的特別tRNA基因轉錄的tRNA，該tRNA的反密碼子可與終止密碼子配對，并可攜帶非自然氨基酸(Uaa)，所以培育基中需補加非自然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因進行轉錄時，識別其啟動子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因該病毒疫苗具有侵染性