DB33浙江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。1豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重?zé)晒舛縋CR的GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和Ct值：達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（CyclethreshoDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcPBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSolutiPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactPCV-2：豬圓環(huán)病毒2型（PorcineCircoviruPCV-3：豬圓環(huán)病毒3型（PorcineCircoviru4試劑和材料除非另有說明，所用試劑均為分析純；滅菌水，0.01mol/LPBS和8mmol/LNaO水應(yīng)符合GB/T6682-2008分4.1DNAzolReagent：DNA抽提試劑，2℃~8℃保存。4.48mmol/LNaOH溶液：4.50.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法見附錄A。——PCV-2-F：5’-TCACCTATGACCCCTATG-3’；2——PCV-2-R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAA——PCV-2-P：5’-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-B——PCV-3-F：5’-TGGCTCAACACATATG——PCV-3-R：5’-ACGGACTTGTAACGAA——PCV-3-P：5’-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-B5.2高壓滅菌鍋。5.4冷藏冰箱，超低溫冰箱（-80℃)。5.6組織勻漿器。5.7移液器。增區(qū)。各功能區(qū)有專用的試劑和實(shí)驗(yàn)材料，不可交采樣及樣品前處理過程中應(yīng)注意無菌操作，防止樣本交叉污倍體積加入滅菌的0.01mol/LPBS。運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，再用研缽或組織勻漿器對組織進(jìn)行充分研磨混3采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6h～8h之內(nèi)運(yùn)9.1實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增體系的配制49.2.2在各設(shè)定的熒光PCR管中分別加入本標(biāo)準(zhǔn)8.2.5中制備的r/min離心30s；上機(jī)前應(yīng)檢查各反應(yīng)管是否蓋緊。9.4熒光通道設(shè)定閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過陽性對照被檢樣品FAM通道無Ct值，且無典型的擴(kuò)增曲線，判定為PCV-2核酸陰性；若被檢樣品值＞36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，建議被檢樣品HEX通道無Ct值，且無典型的擴(kuò)增曲線，判定為PCV-3核酸陰性；若被檢樣品H值＞36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，建議5A.18mmol/LNaOH溶液的配制稱量0.32gNaOH，溶解到1000A.20.01mol/LPBS（pH7稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O)3.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，氯化鉀（KCl）0.2g，氯ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGACGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGCCAGAAGAAGACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACTCCTCAGAATAACCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAACGAGTGGGAAACTGCAATTAGCTTTGAATATTATAAGATACTAAAGATGTACACTAAGCCCTGTAATTTCTCCAGCTCAGCAAACAAAAACTATGTTCGGGCACACAGCCATAGATCTAGACGGCGCCTGGACACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTATGCGGAAAGTTCCACTCGTAAAGTTATGACTTCTAAAAAAAAACACAGCCGTTACTTCACCCCGAAACCAATTCTGGCGGGAACTACCAGCGCTCACCCAGGACAAAGCCTCTTCTTTTTCTCCAGACCCACCCCATGGCTCAACACATATGAC