臨床細菌學檢驗

與藥物敏感試驗結果解讀首都醫科大學附屬

北京友誼醫院

蘇建榮講課提綱標本的采集運送、評價和細菌學檢查方法病原體耐藥性檢測藥物敏感試驗耐藥機制常見耐藥菌的耐藥檢測第一部分標本采集方法

①采血時機：發熱初期和高峰期采血②采集部位：肘靜脈或其他部位靜脈③

采血次數：2～3次/24h④

采血量：成人10～20ml,嬰兒和兒童1～5ml（1）Blood

blOOd

bottle

⑤注入血液培養瓶AerobicbottleFungalbottleAnaerobicbottle（2）腦脊液與其他無菌體液嚴格消毒采集部位無菌方法采集標本可直接接種于血培養瓶中增菌懷疑為腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌感染的標本應該保溫運送或床邊接種。③對痰質量的評價

細胞數/低倍視野 級別白細胞扁平上皮細胞 6<25<25粒細胞減少者？

5>25<104>2510~253>25>25210~25>25不合格1<10≥25 合格（4）不適合做厭氧菌培養的標本有正常菌群存在的部位： 鼻咽拭子齒齦拭子會陰部拭子陰道拭子宮頸口拭子

第二部分鑒定方法：

1、全自動微生物系統（AMS--VITEK）鑒定細菌、真菌和細菌藥敏試驗2、病原體抗原檢測用已只抗體檢測未知抗原如：乳膠凝集試驗（latexcoagulationtest）檢測細菌凝集未凝集3、病原體核酸檢測

分子生物學法：

PCR、基因芯片

DNAhybridizition技術（軍團菌、衣原體、支原體、病毒等）測序4、鑒定結果報告及分析1）、細菌、真菌的種名2)、尿細菌培養：細菌計數：100----10000------100000CFU/ml，細菌、真菌的種名3)、分子生物學法：定性，定量4)、臨床意義：結合臨床分析感染？污染？尿細菌計數G-100000CFU/mlG+球菌10000CFU/ml5)臺灣第三部分抗菌藥物敏感性試驗與

病原體耐藥性檢測抗菌藥物敏感性試驗耐藥機制常見耐藥菌的耐藥檢測一、抗菌藥物敏感性試驗（antimicrobialsusceptibilitytest，AST）--簡稱藥敏試驗

藥敏試驗體外檢測抗菌藥物抑制或殺滅細菌的能力，即檢測細菌對抗菌藥物的敏感性。關于CLSI（一）藥敏試驗的目的

1、預測抗菌藥物治療的效果Ｓ／Ｒ？抗菌藥物細菌指導臨床合理選藥2、更換抗菌藥物時,預測擬選藥物的療效

Ｓ／Ｒ？（二）藥敏試驗用藥的選擇

選藥原則：根據美國CLSI（ClinicalandLaboratorystandardsinstitute)抗微生物藥物敏感試驗的執行標準進行（簡稱指南）。指南將抗菌藥物分成A、B、C、U四組。A組：常規藥敏試驗的首選藥物。B組：次首選藥物，對A組同類過敏、耐藥、多細菌感染、多部位感染。流調的需要。C組：補充性抗菌藥物。對數種基本藥物耐藥菌株或對基本藥物過敏者。（氯霉素腸球菌）U組：僅用于泌尿道感染的藥物。（呋喃妥因、某些喹諾酮類）。在非苛氧菌中的藥物分組(A、B、C、U)

在苛氧菌中的藥物分組（A、B、C）由表看出：不同種類的病原菌選擇藥物種類不完全相同(G+、G-菌、非苛氧菌、苛氧菌）選擇有代表性藥物做藥敏試驗，在代表性藥物同類中選擇一、兩種藥物（如何讀取檢驗報告舉例）。不同部位（尿路與其他部位）選擇藥物不完全相同（三）藥敏試驗結果表示及臨床意義1.敏感（susceptible,S）是指當使用常規推薦劑量的抗菌藥物進行治療時，該抗菌藥在患者感染部位通常所能達到的濃度可抑制該感染菌生長。2.耐藥(resistant,R)是指使用常規推薦劑量的抗菌藥物進行治療時，該抗菌藥在患者感染部位達到的濃度不能抑制該感染菌生長；

或者該藥對該感染菌臨床療效尚未在以往治療研究中可靠；

或抑菌圈直徑落在特定細菌發揮耐藥機制的合適范圍。3.中介（intermediate,I)中度敏感（moderatelysusceptible)，對于毒性低的藥物可加大劑量（高于正常治療濃度）給藥，但是對毒性大的不能用。或者用于藥物生理性濃集的感染部位如尿。緩沖區（bufferzone),防止因實驗室技術因素造成的誤差，特別是對安全范圍窄的藥物（治療濃度接近中毒濃度）。重復試驗。4.劑量依賴敏感（susceptible-dosedependent,SDD)是指抗菌藥對感染菌MIC接近該藥在血液和組織中濃度，感染菌臨床應答率可能低于敏感菌；若某藥在高劑量使用時安全，則中介意味高劑量給藥可能有效。主要用于真菌藥敏試驗。5.不敏感新藥問世，無耐藥株，只有敏感折點，當MIC值高于敏感折點時，報告不敏感。

血藥濃度與MIC之間的關系（四）常用藥敏試驗方法

及其臨床應用

常用藥敏試驗紙片擴散法最小抑菌濃度的測定法E-試驗法抗菌藥物聯合藥敏試驗

1.紙片擴散法(Diskdifusionmethod)（定性）（1）方法：

（2）結果報告：敏感（S）或中介（I）、耐藥（R）根據：參照美國CLSI/NCCLS制定的標準讀取結果。敏感限=breakpoints（分界點）抑菌圈直徑≥敏感限S≤耐藥限R敏感限與耐藥限之間I腸桿菌科的抑菌圈直徑解釋標準和相對應的最低抑菌濃度（ＭＩＣ）值（3）臨床意義根據患者病情選擇“S”藥物的種類不能選用“R”藥物“I”某些藥物如β-內酰胺類，加大藥物劑量能達到治療目的，或該藥在感染部位濃度很高（尿液中喹諾酮類）。2.最小抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）的測定（定量）（1）方法：肉湯稀釋法瓊脂稀釋法抗菌藥物倍比稀釋

瓊脂平板????????????2μg/ml4μg/ml8μg/ml2481632（2）結果報告：MIC值根據：CLSI指南判斷結果例如：苯唑西林（MICμg/ml）SR金黃色葡萄球菌≤2

≥4凝固酶陰性葡萄球菌≤0.25≥0.5（3）臨床意義根據病情選用不同種類MIC值小的“S”藥物不能選用“R”藥物“I”對某些藥物如β-內酰胺類，當加大藥物劑量能達到治療目的，或該藥在感染部位濃度很高（尿液中喹諾酮類）時可選。3.E-test法（1）E-test法是濃度梯度紙條擴散法,MIC測定（2）方法：操作按紙片擴散法

（3）結果報告：同稀釋法，MIC值（4）臨床意義“S”、“R”、“I”藥物的應用同前述優點：各種細菌（苛養、非苛養、生長快的、慢的細菌）及厭氧菌、真菌的MIC測定。對重癥感染病人選藥治療極為重要。4.抗菌藥物聯合藥敏試驗（1）目的：是測定兩種抗菌藥物聯合應用時的抗菌效果（2）方法：紙片擴散法和稀釋法藥物B稀釋藥物A稀釋（3）計算FIC指數：部分抑菌濃度指數(fractionalinhibitoryconcentration,FIC)FIC指數=A藥聯合MIC/A藥單測MIC+B藥聯合MIC/B藥單測MIC結果：FIC指數<0.5協同FIC指數0.5~1相加FIC指數1~2無關FIC指數>2拮抗抗菌藥物的PK/PD理論抗菌藥藥效動力學參數最小抑菌濃度(minimuminhibitoryconcentration,MIC最小殺菌濃度(minimumbactericidalconcentration,MBC)抗生素后效應(postantibioticeffect，PAE)亞抑菌濃度下的抗生素后效應(PASME)抗菌素后白細胞活性增強效應(PostantibioticLeukocyteenhancement,PALE)

殺菌曲線(time-killcurves)（4）臨床意義（β-內酰胺類+氨基糖苷類====協同）提高療效減少藥物毒性減少耐藥菌發生。二、細菌耐藥主要機制細菌水平和垂直傳播耐藥基因的整合子系統產生滅活抗菌藥物的水解酶和鈍化酶細菌的抗菌藥物作用靶位的改變細菌膜外排泵系統細菌生物膜的形成l.抑制細胞壁合成：環絲氨酸、萬古霉素等；2.DNA促旋酶抑制劑：喹諾酮類；3.RNA聚合酶抑制劑：利福平；4.50S蛋白質合成抑制劑：大環內酯類、氯霉素、林可霉素類；5.30S蛋白質合成抑制劑：四環類、大觀霉素、氨基糖苷類；6.tRNA合成抑制劑：Mupirocin；7.氯霉素酰基轉移酶；8.抑制細胞膜合成：多粘菌素類；9.細胞周質空間：β—內酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶；10.抑制葉酸代謝：磺胺類。THFA：四氫葉酸；DHFA：二氫葉酸。

細菌耐藥性的機制抗菌藥物的作用靶位多重耐藥主動外排泵

三、常見耐藥菌的耐藥檢測

耐藥菌增加的原因耐藥菌產生增加（抗生素選擇性壓力）：由于醫生過多地使用抗生素，造成對基因突變及耐藥基因轉移的耐藥菌進行了篩選耐藥菌傳播增加：通過醫護人員尤其手的接觸，細菌在病人間交叉寄生造成耐藥菌株在醫院內的傳播，以及隨后通過宿主病人的轉移，耐藥菌在醫院間甚至社區進行傳播超級細菌？多重耐藥菌MRSA--耐甲氧西林金黃色葡萄球菌VRE---耐萬古霉素的腸球菌ESBLs--產超廣譜β內酰胺酶MDR-AB—多重耐藥鮑曼不動桿菌MDR-PA--多重耐藥銅綠假單胞菌產NDM-1細菌——耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌WHO對NDM-1的評估與建議強化醫務工作者和公眾合理使用抗生素的相關政策加強細菌耐藥性監測嚴格執行預防和控制措施，實施醫院感染控制措施，控制多重耐藥菌株的傳播;（二）細菌的耐藥性監測方法常見耐藥細菌的

英文簡稱的含義：MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRCoNSVRSA（耐萬古霉素金黃色葡萄球菌）

ESBLs(超廣譜

－內酰胺酶)SSBLs（超超廣譜

－內酰胺酶）=ESBLs+AmpC腸球菌低耐慶大霉素菌株，可－內酰胺類聯合氨基糖甙類治療；高耐慶大霉素菌株，可用萬古霉素一）細菌耐藥表型的檢測

1.β-內酰胺酶的檢測①β-內酰胺酶試驗采用色原法，挑取菌落涂在含有色原頭孢菌素頭孢硝噻吩的試紙片上，若試驗菌產β-內酰胺酶，則頭孢硝噻吩被水解，紙片有黃色變成紅色。β-內酰胺酶試驗陽性提示對青霉素酶不穩定的青霉素（如青霉素、氨芐西林等）耐藥。常規需做β-內酰胺酶試驗菌株有葡萄球菌屬、腸球菌屬、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌以及其他革蘭陰性厭氧菌。②超廣譜β-內酰胺酶的檢測（ESBLs)由革蘭陰性桿菌產生，質粒編碼，其活性可被β-內酰胺酶抑制劑（如克拉維酸）抑制。ESBLs檢測包括篩查試驗和確證試驗。

ESBLs陽性提示該菌對青霉素類、頭孢類和單環類抗生素耐藥。常規檢測ESBLs的細菌包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和奇異變形菌。③頭孢菌素酶檢測可水解青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類和單氨類，不能水解碳青霉烯類和四代頭孢。④金屬酶檢測可水解單氨類抗生素和碳青霉烯類等各種β-內酰胺類抗生素⑤KPC型酶檢測能水解除頭霉素以外的所有β-內酰胺類抗生素，對美羅培南的水解能力最強。金葡菌對萬古霉素耐藥的機制：

1.青霉素結合蛋白的改變：PBP4減少；2.細胞壁通透性下降：肽聚糖合成過量。

2.重要耐藥菌的檢測金黃色葡萄球菌1).－內酰胺類：產生低親和力PBP4、5、6，其次為產酶。2).萬古霉素：細胞壁粘肽鏈末端成分改變，萬古霉素不能與之結合.根據耐藥基因分類：VANA型：染色體上，對萬古霉素高度耐藥，對替考拉寧低度耐藥。VANB型：質粒介導，對萬古霉素高度或低度耐藥，對替考拉寧敏感。VANC型：質粒介導，對萬古霉素低度耐藥，對替考拉寧敏感。腸球菌：耐藥機制：耐萬古霉素腸球菌的vanA基因轉移的

金黃色葡萄球菌菌體內Ferber,D.2003.Science302:1488.vanA二）檢驗報告單的正確讀取

與抗菌藥物的合理使用？拿到一張典型耐藥菌株的藥敏試驗報告單時，怎樣用？青霉素苯唑西林紅霉素萬古霉素利奈唑烷氧氟沙星唑呋喃妥因……第一步判斷病原種類第二部看清細菌種類臨床細菌抗菌藥物敏感試驗結果的含義和應用方法：藥敏試驗檢驗報告單列出了抗菌藥物敏感性（耐藥性）結果。一般認為，這張報告單中列出的藥物敏感性結果就是可供選擇的藥物，而報告單中未出現的藥物沒有選用的依據，這種觀點是不全面的。葡萄球菌用藥原則A組（首選藥物）初級試驗的抗菌藥物和常規報告的抗菌藥物

青霉素、苯唑西林（頭孢西丁結果）、阿奇霉素或紅霉素、克拉霉素或紅霉素

B組（選擇性地報告）初級試驗的抗菌藥物和選擇報告的抗菌藥物克林霉素、萬古霉素、達托霉素、利奈唑烷、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、環丙沙星或左氧氟沙星或氧氟沙星

C組（替代性或補充性）補充試驗和選擇菌藥物報告的抗菌藥物加替沙星或阿莫西林、氯霉素、慶大霉素、利福平、四環素、達福普汀、奎奴普丁/U組（泌尿道感染用）補充試泌尿道的抗菌藥物洛美沙星或諾氟沙星、磺胺異噁唑呋喃妥因、甲氧芐啶MRSA對所有β－內酰胺類，包括酶抑制劑復合物藥和碳青酶烯類均耐藥；……藥敏試驗中常用的試驗藥物可以代表其他某種或某類藥物的結果：

1.MRSA與MRCoNS感染流行的預防：一旦成為流行菌株則很難根除（Boyee報道根除率為13/104）；

注意消毒和無菌操作；MRSA病例應予以隔離；

MRSA與MRCoNS的治療：1.糖肽類首選；2.莫匹羅星、褐霉素、磷霉素、利福平、SMZCO、米諾環素等，耐藥率在5-40％不等，單獨用藥療效不確切，必要時可以聯合用藥。?–內酰胺類抗菌藥物--R

1.青霉素類(penicillins)：天然青霉素、耐青霉素酶青霉素、廣譜青霉素2.頭孢菌素類(cephaolosporin)

一代頭孢菌素：對革蘭陽性菌有較強作用二代頭孢菌素：對產?–內酰胺革蘭陰性菌有作用三代頭孢菌素：注射:頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他定、頭孢哌酮

四代頭孢菌素：頭孢匹羅、頭孢吡肟

3.其他?–內酰胺類抗生素與?–內酰胺酶抑制劑(1)單環?–內酰胺類(monobactans):氨曲南和卡蘆莫南。(2)頭霉素類:①頭霉素(cephamycins)抗生素:有頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑.對革蘭陽性菌有較好的抗菌活性,對厭氧菌有高度抗菌活性,但對銅綠假單胞菌耐藥。②氧頭孢烯類(oxacephems):具有三代頭孢菌素的特點,抗菌譜廣,對產?–內酰胺酶陰性菌有很強的抗菌作用,對產酶的金黃色葡萄球菌也具有一定的抗菌活性。(3)碳青霉烯類抗生素:碳青霉烯類(carbapenems):亞胺培南、美洛培南、比阿培南、帕尼培南。(4)?–內酰胺酶抑制劑:①克拉維酸②舒巴坦③三唑巴坦首都醫科大學附屬北京友誼醫院檢驗報告單

姓名ⅹⅹ

性別ⅹ

病歷號ⅹⅹ

臨床診斷ⅹ……標本來源：？泌尿道標本致病菌：MRSA藥敏試驗結果：抗菌藥物的PK/PD理論抗菌藥臨床藥理學的研究范疇藥代動力學(Pharmacokinetics,PK)研究抗菌藥的吸收、分布和清除，這三個方面結合在一起決定著藥物在血清、體液和組織中濃度的時間過程，這一過程與藥物的劑量有一定的關系。藥效動力學(Pharmacodynamics,PD)研究藥物的作用機制以及藥物濃度與藥物效果、藥物毒性的關系。恰當的給藥劑量、給藥間隔和療程

（rightdosage,rightinterval，righttimeoftherapy）感染控制后需繼續給藥數天（通常3天左右），防止處于突變選擇窗的細菌殺滅不徹底而耐藥突變，但也要防止感染完全治愈后的無限制超長時間給藥藥物的穿透性:%組織/血清61%15~40%10~20%7腹透液94%12~40%11~30%6肌肉

104%1477%10炎性滲出

450%1311%–17%4,5ELF（肺組織上皮細胞內液）

70%13~10%90%–18%2,3腦脊液

60%12~50%–60%87%–13%1骨

利奈唑酮

替考拉寧

萬古霉素

組織

1.Graziani1988;2.Matzke1986;3.Albanese2000;4.Georges1997;5.Lamer1993;6.Daschner1987;7.Blevins1984;8.Wilson2000;9.Stahl1987;10.Wise1986;11.Frank1997;12.Lovering2002;13.SmPC;14.Gee2001;15.Gendjar2001.

七種抗生素肺組織穿透性比較肺濃度/血漿濃度?(%)Lung/SerumratioMicekST,etal.Pharmacotherapy2006;26:204-13

肺濃度取樣于肺實質(Parenchyma)及肺上皮細胞內液ELF比較--ESBLs

克雷伯菌屬、大腸埃希菌和奇異變型桿菌中的產ESBLs菌株應報告:對所有青霉素類及氨曲南耐藥。……

比較--ESBLs

?–內酰胺類抗菌藥物—部分R部分S1.青霉素類(penicillins)：天然青霉素、耐青霉素酶青霉素、廣譜青霉素

2.頭孢菌素類(cephaolosporin)

一代頭孢菌素：對革蘭陽性菌有較強作用二代頭孢菌素：對產?–內酰胺革蘭陰性菌有作用三代頭孢菌素：注射:頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他定、頭孢哌酮

四代頭孢菌素：頭孢匹羅、頭孢吡肟

3.其他?–內酰胺類抗生素與?–內酰胺酶抑制劑(1)單環?–內酰胺類(monobactans):氨曲南和卡蘆莫南。(2)頭霉素類:①頭霉素(cephamycins)抗生素:有頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑.對革蘭陽性菌有較好的抗菌活性,對厭氧菌有高度抗菌活性,但對銅綠假單胞菌耐藥。②氧頭孢烯類(oxacephems):具有三代頭孢菌素的特點,抗菌譜廣,對產?–內酰胺酶陰性菌有很強的抗菌作用,對產酶的金黃色葡萄球菌也具有一定的抗菌活性。(3)碳青霉烯類抗生素:碳青霉烯類(carbapenems):亞胺培南、美洛培南、比阿培南、帕尼培南。(4)?–內酰胺酶抑制劑:①克拉維酸②舒巴坦③三唑巴坦三)細菌耐藥基