第1節(jié)

重組DNA技術的基本工具第3章基因工程樹：不能發(fā)光螢火蟲：能發(fā)光愿望發(fā)光樹如果能得到這種到了晚上自己能發(fā)光的樹該多好啊！思考：如何獲得發(fā)光樹？雜交育種？同種生物之間進行誘變育種？在原有基因上發(fā)生基因突變，產生新基因——等位基因不定向1944年艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個體間轉移。1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。截至19666年，64個密碼子均被破譯成功。1970年科學家在細菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限制性內切核酸酶（簡稱限制酶）1972年，伯格首先在體外進行了DNA的改造，成功構建了第一個體外重組DNA分子。1982年，第一個基因工程藥物-重組人胰島素被批準上市。基因工程藥物成為世界各國研究和投資開發(fā)的熱點。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結構模型并提出了遺傳物質自我復制的假說。1967年，科學家發(fā)現(xiàn)，在細菌擬核DNA之外的質粒有自我復制能力，并可以在細菌細胞間轉移。20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。1973年，科學家證明了質粒可以作為基因工程的載體，并實現(xiàn)了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。1985年，穆里斯等人發(fā)明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。

基因工程的發(fā)展歷程一、基因工程的概述項目S型細菌R型細菌菌落菌體有無毒性表面光滑

表面粗糙

有無多糖類的莢膜肺炎鏈球菌一、基因工程的概述第一組有R型細菌的培養(yǎng)基S型細菌的細胞提取物+第二至四組有R型細菌的培養(yǎng)液S型細菌的細胞提取物+混合混合第五組有R型細菌的培養(yǎng)液S型細菌的細胞提取物+混合DNA酶蛋白酶（或RNA酶、酯酶）S型細菌R型細菌S型細菌R型細菌只長R型細菌實驗結論（1）DNA才是使R型細菌產生穩(wěn)定遺傳變化的物質。（2）蛋白質等其他物質不是遺傳物質。一、基因工程的概述基因重組R型細菌轉化為S型細菌的實質：S型細菌莢膜控制莢膜形成的X基因加熱殺死被破壞的S型細菌X基因吸附在R型細菌表面X基因進入R型細菌重組R型細菌轉化成S型細菌DNA具有熱穩(wěn)定性。加熱使蛋白質變性失去活性，DNA的結構也會被破壞，但當溫度降低到55℃左右時，DNA的結構會恢復，但蛋白質卻不能恢復。

一、基因工程的概述1.基因工程概念：指按照人們的愿望,進行嚴格的設計并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作DNA重組技術。操作對象：操作水平：原理：結果：意義：基因（DNA）DNA分子水平基因重組創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產品定向改造生物遺傳特性；克服遠緣雜交不親和障礙水母的綠色熒光蛋白基因一、基因工程的概述2.圖解“基因工程實質”轉移A生物B生物螢火蟲普通動植物發(fā)光基因探究一基因工程的理論基礎和工具酶「問題情境」資料1:生長激素釋放抑制激素可用于治療肢端肥大癥,最初只能從動物下丘腦提取,50萬個羊腦才能提取5mg。科學家以質粒為載體,將相關基因轉入大腸桿菌。利用改造后的工程菌生產的該激素價格降為原來的幾百分之一。(1)為什么不同生物的DNA分子能拼接起來?提示:①DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。②DNA分子都遵循堿基互補配對原則。③雙鏈DNA分子的空間結構都是規(guī)則的雙螺旋結構。(2)為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞中表達?提示:①基因是控制生物性狀的遺傳物質的結構和功能單位。②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。③生物界共用一套遺傳密碼。(3)基因工程操作導致的基因重組與有性生殖中的基因重組的主要區(qū)別是什么?提示:①有性生殖中的基因重組是隨機的,并且只能在同一物種間進行。②利用基因工程可以在不同物種間進行基因重組,并且方向性強,可以定向地改變生物的性狀。一、基因工程的概述思考：

DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。“分子手術刀”準確切割DNA分子“分子縫合針”“分子運輸車”將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導入受體細胞二、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”

能識別

的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。切割DNA分子的工具是限制性內切核酸酶，又稱

。限制酶1.來源：2.種類：主要來自原核生物數(shù)千種限制酶不是一種酶，而是一類酶。3.作用特點：專一性作用部位一般為4~8個或其他數(shù)量的核苷酸，最常見的為6個核苷酸。雙鏈DNA分子二、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”【問題3】

你能根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？含某種限制酶的細菌的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。二、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”1’2’3’4’5’

G限制酶1’2’3’4’5’

A磷酸二酯鍵TGCCGTAA5'3'5'3'二、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”4.識別序列EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’限制酶所識別的序列的特點是：

呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。二、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”（1）實例1——EcoRⅠ限制酶切割

*EcoRⅠ識別序列為GAATTC*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端（2）實例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ識別序列為CCCGGG*SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端5.切割結果:DNA兩條單鏈的切口處，伸出幾個核苷酸，剛好能互補配對，這樣的切口叫黏性末端。切口處是平整的，這樣的切口叫平末端。課堂練習1.寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________

GATCAATTAGCTGATC思考：同種限制酶切割的黏性末端一定相同嗎？不同種限制酶切出的黏性末端一定不同嗎？①不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同。【解析：酶具有專一性，識別的序列相同】②不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端。（比如BamHⅠ、BglⅡ）二、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”2.結合右圖，推斷限制酶切一次可斷開

個磷酸二酯鍵，產生

個游離的磷酸基團，消耗

分子水。

兩2兩3.下圖甲是一個DNA片段，箭頭處代表不同限制酶的切點，據(jù)圖回答：(1)用EcoRⅠ酶切，能得到

種DNA片段；(2)用PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；23(3)要想獲得抗病基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？要切兩個切口，產生四個黏性末端。用同種限制酶切割(EcoRⅠ)TGAATTCGACTTAAGCAGAATTCTTCTTAAGA缺口怎么辦只能用同種酶切割嗎？完全互補的黏性末端能通過氫鍵暫時連接在一起，但并不穩(wěn)定。DNA連接酶—“分子縫合針”恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵3.把兩種來源不同的DNA分子進行拼接，應該怎樣處理呢？課堂練習三、DNA連接酶——“分子縫合針”2.作用：將兩個DNA片段連接起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。5′3′TACGTACTGAAT5′3′5′3′CGCGCG5′3′CGCGCG切口切口切口CT5′3′5′3′TAGCAGATTA5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG將兩個雙鏈DNA片段“連接”起來的酶1.概念：三、DNA連接酶——“分子縫合針”5′5′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′5′5′5′5′T4DNA連接酶T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶3.種類：⑴E.coliDNA連接酶：⑵T4DNA連接酶連接平末端的效率遠遠低于T4DNA連接酶三、DNA連接酶——“分子縫合針”3.種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶類型E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶來源功能縫合

和

；

縫合__________和______________結果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端(效率低)磷酸二酯鍵★DNA連接酶沒有識別特異性(相同或互補的黏性末端以及平末端都能連接)平末端（連接平末端效率遠低于T4DNA連接酶）三、DNA連接酶——“分子縫合針”旁欄思考（P72）：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？DNA聚合酶相同點：不同點：都是催化磷酸二酯鍵形成的酶。DNA聚合酶連接的是游離的脫氧核苷酸，需要模板；DNA連接酶連接的是DNA片段，不需要模板。三、DNA連接酶——“分子縫合針”項目DNA連接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用對象作用結果磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵DNA片段DNA單個的脫氧核苷酸DNADNA將兩個DNA片段連接成完整的DNA分子切割雙鏈DNA分子將單個的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈DNA連接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比較三、DNA連接酶——“分子縫合針”思考：根據(jù)所

學知識，完成以下填空：①限制酶

②解旋酶

③DNA連接酶

④DNA聚合酶

⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵資料2:如圖為不同的限制酶識別序列和切割位點。(4)限制酶的全稱是

,作用是

。(5)限制酶存在于原核生物中的作用是

。(6)若某鏈狀DNA分子中含有兩個HindⅢ的識別序列,該DNA分子將被切成

個片段,斷裂

個磷酸二酯鍵。限制性內切核酸酶能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開原核生物容易受到外源DNA的入侵,原核生物中的限制酶能夠切割入侵的外源DNA而保護自身34(7)畫出SpeⅠ、EcoRⅤ切割后產生的末端圖。-A

CTAGT--TGATC

A-

SpeⅠ-GAT

ATC--CTA

TAG-

EcoRⅤ(8)哪兩個限制酶切割形成的黏性末端互補?可以用哪種DNA連接酶連接?畫出連接后的DNA分子片段。提示:SpeⅠ、XbaⅠ。T4DNA連接酶、E.coliDNA連接酶。2.下表為常用的限制酶及其識別序列和切割位點,由此推斷以下說法正確的是(

)限制酶名稱識別序列和切割位點限制酶名稱識別序列和切割位點BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠG↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHincⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGG注:Y=C或T,R=A或G。A.一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B.若兩種限制酶的識別序列相同,則形成的末端一定能通過DNA連接酶相互連接C.不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端D.限制酶EcoRⅠ進行一次切割,會切斷2個磷酸二酯鍵,形成1個游離的5′末端C四、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”質粒將外源基因送入受體細胞,

在受體細胞內對目的基因進行大量復制.

1.作用：動植物病毒噬菌體2.種類：質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。四、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”3.運載體需具備的條件：條件①：具有一個或多個限制酶切割位點；條件②：能在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制；條件③：具有標記基因，便于重組DNA分子的篩選。條件④：對受體細胞無害。問題3：我們用肉眼看不到載體是否進入受體細胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？問題2：要使攜帶的外源基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？問題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？供外源基因插入其中使外源基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并復制，以擴增外源基因的數(shù)量如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等四、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”有標記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。不能被酶切破壞便于重組DNA篩選與鑒定DNA復制的起始位點，并帶著插入的目的基因一起復制有切割位點（酶切位點）4.最常用的載體——質粒：真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過

改造的。人工終止子:

轉錄的終點，在轉錄過程中起調控作用。啟動子:

轉錄的起點，在RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因的轉錄。質粒DNA分子質量一般為擬核的0.5%~3%四、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”

載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，導入了載體并成功表達了的受體細胞才能夠生存。如圖所示：拓展延伸：標記基因的篩選原理課堂練習1.圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因導入受體細胞的質粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉基因抗病植株，回答下列問題。（1）在基因工程的操作中，不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞_________和_______________________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。目的基因質粒上的抗生素抗性基因目的基因只有一側含有黏性末端，不能插入到質粒中課堂練習（3）由于反應體系中含有大量的外源DNA片段和質粒，加入PstI一種限制酶后，會得到大量的目的基因片段和質粒片段，再加入DNA連接酶后，除了會形成目的基因與質粒連接的環(huán)狀產物外，還會形成______________________連接的環(huán)狀產物以及_____________________連接的環(huán)狀產物。此外，目的基因與質粒的連接既可以是正向連接，也可以是____________，后者可能會導致目的基因無法正常表達。目的基因與目的基因質粒片段與質粒片段反向連接課堂小結限制酶作用部位：種類E.coliDNA連接酶運載工具條件③

有一個至多個限制酶切割位點質粒、噬菌體、動植物病毒DNA連接酶作用部位：切開DNA分子的磷酸二酯鍵來源：主要存在于原核生物中特點：具有專一性（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA連接酶①

對受體細胞無害②

能自我復制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的標記基因種類：磷酸二酯鍵作用結果：產生黏性末端或平末端探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定一、實驗原理00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度

利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精DNA能溶于物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下，DNA被二苯胺試劑染成藍色初步分離DNA和蛋白質溶解DNA鑒定DNA探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。1.選材：豬血（哺乳動物的成熟紅細胞）無細胞核和線粒體，幾乎不含DNA，不適合；雞血中紅細胞有核DNA，且核DNA的量較多，適合。含DNA的生物材料都可以，選取DNA含量相對較高的生物組織，成功率更大。雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。二、材料用具

（1）選什么樣的材料實驗更易成功？（2）豬血和雞血，哪個適合用作提取DNA的材料？操作時如何防止血液凝固？探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定2.試劑：試劑研磨液體積分數(shù)為95%的酒精二苯胺2mol/L的NaCl溶液

蒸餾水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用研磨液成分作用SDS使蛋白質變性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNA二、材料用具探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定三、實驗步驟探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定1.破碎細胞——稱取

，切碎，放入研缽，倒入

，

研磨。洋蔥研磨液充分三、實驗步驟目的：裂解細胞，釋放DNA2.過濾——在漏斗中墊上

過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取

；或將研磨液倒入塑料離心管中離心，取

。紗布上清液上清液思考:過濾能否用濾紙代替紗布？

不可以。因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。思考:此步驟獲得的上清液中可能含有哪些細胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白質、脂質、糖類等。探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定三、實驗步驟3.DNA的粗提取——在上清液中加入體積相等的

溶液,靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的

就是粗提取的DNA。預冷的酒精白色絲狀物思考:此步驟的目的是？使蛋白質等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。預冷的酒精的優(yōu)點①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。思考：酒精預冷的作用？用冷卻的酒精析出DNA探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定用玻璃棒沿

攪拌，卷起

，并用濾紙吸去上面的水分：或將溶液倒入塑料離心管中離心，取

晾干。一個方向沉淀物絲狀物三、實驗步驟3.DNA的粗提取——思考：攪拌時應輕緩、并沿一個方向目的？減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子析出DNA探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定三、實驗步驟4.DNA的鑒定——實驗組對照組水浴加熱將絲狀物或沉淀物溶于

溶液中，加入

試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min二苯胺2mol/L的NaCl空白對照：

在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。評價結果：（1）DNA純度看提取物顏色（2）DNA的量看與二苯胺反應顏色的深淺現(xiàn)配現(xiàn)用！探究?實踐：DNA的粗提取與鑒定四、結果分析與評價

二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍色說明實驗基本成功