疫苗研發與制備實驗歡迎參加疫苗研發與制備實驗課程。本課程將帶領學生深入了解疫苗開發的全過程，從基礎理論到實際操作技能。通過系統學習和實驗實踐，你將掌握現代疫苗研發的關鍵技術和方法。在當今全球衛生挑戰日益復雜的背景下，疫苗研發能力對于應對新發和再發傳染病至關重要。本課程旨在培養未來的疫苗研究人才，為保障人類健康貢獻力量。讓我們一同探索疫苗科學的奧秘，掌握這一關鍵生物技術領域的核心知識和技能。課程概述課程目標掌握疫苗研發的基本原理和流程，熟悉主要疫苗類型的制備方法，具備疫苗質量控制與評價的基本能力，能夠獨立完成簡單疫苗的實驗室制備。學習內容課程包括理論講授和實驗操作兩部分，涵蓋疫苗概論、研發流程、生產工藝、質量控制、安全性評價和三個核心實驗課程（滅活疫苗、重組蛋白疫苗制備及質量檢測）?？己朔绞狡谀├碚摽荚嚕?0%）、實驗操作考核（30%）、實驗報告（20%）和課堂表現（10%）。要求掌握理論知識同時具備實際操作能力，強調實驗態度和實驗室安全意識。第一章：疫苗概論疫苗的基本概念了解疫苗的定義、分類及歷史發展，掌握免疫學基礎知識免疫反應機制學習疫苗誘導免疫應答的基本原理，包括體液免疫和細胞免疫疫苗技術基礎掌握疫苗設計和制備的基本技術路線，了解不同類型疫苗的特點疫苗的公共衛生意義認識疫苗在傳染病預防與控制中的重要作用及全球健康貢獻疫苗的定義和分類按制備方法分類滅活疫苗：完全殺死的病原體減毒活疫苗：減弱毒力的活病原體亞單位疫苗：病原體的特定成分毒素類疫苗：滅活的細菌毒素按技術平臺分類重組蛋白疫苗：表達的特定抗原病毒載體疫苗：利用其他病毒攜帶目標抗原核酸疫苗：DNA或RNA編碼抗原病毒樣顆粒：模擬病毒結構但無遺傳物質按免疫機制分類預防性疫苗：預防特定疾病感染治療性疫苗：治療已存在的疾病粘膜免疫疫苗：激活粘膜局部免疫多價/聯合疫苗：預防多種疾病疫苗的發展歷史1古代預防接種公元前1000年，中國和印度等地開始使用人痘接種法預防天花，通過將輕癥患者的痘痂研磨后吸入鼻腔或接種于皮膚，是最早的免疫實踐。2杰納與牛痘1796年，英國醫生愛德華·杰納發明世界上第一種現代疫苗——牛痘接種，通過接種牛痘病毒預防天花，開創了現代疫苗學的先河。3巴斯德時代19世紀后期，路易·巴斯德發明了減毒活疫苗技術，成功研制出狂犬病和炭疽疫苗，建立了減毒疫苗的理論基礎。4分子生物學革命20世紀后期至今，基因工程、分子生物學技術推動疫苗進入新時代，出現了重組蛋白疫苗、核酸疫苗等新型平臺，疫苗設計更加精準和安全。疫苗的作用機制疫苗接種將含有抗原的疫苗制劑通過注射、口服或吸入等方式引入人體抗原遞呈抗原被抗原遞呈細胞(APCs)攝取、加工并呈遞給T細胞免疫識別T細胞被激活并協助B細胞識別抗原產生抗體反應免疫記憶形成記憶性B細胞和T細胞，在再次接觸病原體時能快速響應疫苗的重要性200萬+年均減少死亡全球范圍內，疫苗每年預防約200-300萬人死亡80%麻疹死亡率降低自2000年以來，麻疹疫苗使全球麻疹死亡率下降了80%以上99.9%脊髓灰質炎減少率自1988年以來，全球脊髓灰質炎病例減少了99.9%20:1投資回報比疫苗免疫規劃的經濟回報率約為20:1，是最具成本效益的公共衛生干預措施之一第二章：疫苗研發流程上市與監測疫苗獲批上市后持續進行上市后監測臨床研究I、II、III期臨床試驗評估安全性和有效性臨床前研究在動物模型中進行安全性和免疫原性測試候選疫苗篩選篩選和優化潛在的候選疫苗靶標識別確定病原體上的關鍵抗原和免疫表位疫苗研發的基本步驟基礎研究開展病原體分子生物學和免疫學研究，了解致病機制、免疫逃逸特性，尋找可能的保護性抗原。這一階段通常在大學和研究所的實驗室進行，需要2-5年時間?？乖O計與篩選基于基礎研究結果，設計和篩選能夠引起保護性免疫應答的抗原?？赡懿捎枚喾N技術平臺進行候選疫苗的制備，包括重組蛋白、減毒、滅活、載體等方法。臨床前評價在細胞和動物模型中評估疫苗的安全性、免疫原性和有效性。進行動物毒理學研究，確定首次人體試驗的安全劑量范圍。同時開始研究疫苗的生產工藝和質控方法。臨床試驗按照I、II、III期臨床試驗設計，逐步在人體中評價疫苗的安全性、免疫原性和保護效力。III期試驗通常需要招募數千至上萬志愿者，觀察期可能長達數年。注冊審批與上市向藥品監管機構提交完整的研發數據，申請疫苗注冊上市。批準后建立上市后監測系統，持續收集疫苗在大規模人群中使用的安全性和有效性數據。靶標選擇與抗原設計靶標選擇原則針對病原體保守區域具有良好免疫原性能誘導中和抗體或保護性T細胞應答結構穩定易于制備在病原體生命周期中具有關鍵功能抗原設計策略結構生物學指導：利用冷凍電鏡、X射線晶體學等技術解析抗原三維結構，精確設計表位反向疫苗學：從康復者血清中分離高效中和抗體，逆向推導理想抗原計算生物學：通過生物信息學預測抗原表位，優化抗原序列和結構多表位抗原：整合多個保守表位增強保護廣譜性候選疫苗篩選體外評價細胞水平評估抗原表達、構象完整性和穩定性初步動物免疫小鼠等小型動物模型中評估免疫原性非人靈長類動物試驗評價保護效力與安全性候選疫苗篩選是研發過程中的關鍵環節，通常需要對多個候選物進行平行評估。體外評價包括抗原純度測定、抗原-抗體結合力測定和穩定性分析。動物模型中主要檢測抗體滴度、中和活性、T細胞應答及攻毒后的保護效力。篩選過程使用的評價指標包括：血清學指標（抗體滴度、中和活性）、細胞免疫指標（T細胞增殖、細胞因子分泌）、保護效力指標（攻毒后的發病率、死亡率）和安全性指標（局部反應、系統反應）。最終，綜合考慮有效性、安全性和可生產性，選擇最佳候選疫苗進入后續研發階段。臨床前研究安全性評價一般毒性試驗：評估疫苗在動物體內的急性、亞急性和慢性毒性特殊毒性試驗：生殖毒性、致癌性、免疫毒性等局部耐受性：研究注射部位的組織反應藥效學研究免疫原性：評價疫苗誘導抗體和T細胞免疫應答的能力保護效力：動物攻毒試驗評估疫苗的保護效力免疫機制：探究疫苗產生保護作用的分子免疫學機制藥代動力學疫苗成分在體內的分布、代謝和排泄特性佐劑的體內分布和清除規律抗原在接種部位的滯留時間和淋巴結運輸情況臨床試驗階段試驗階段研究目的樣本量持續時間I期臨床試驗初步評價安全性和耐受性，確定適宜劑量20-100人數月II期臨床試驗進一步評價安全性，初步評價免疫原性和保護效力數百人6-12個月III期臨床試驗大規模評價疫苗有效性和安全性數千至數萬人1-4年IV期臨床試驗上市后監測，評價真實世界效果和長期安全性數十萬至數百萬人多年疫苗注冊與上市申報資料準備完整的臨床前和臨床研究資料生產工藝和質量控制體系文件穩定性研究數據技術審評藥監部門對研發和生產數據進行全面審評必要時現場核查和樣品檢驗批準上市獲得生物制品批準證明文件生產許可和上市銷售批文上市后監測不良反應監測系統有效性和安全性持續評估第三章：疫苗生產工藝上游工藝包括細胞培養、病毒培養或發酵等過程，是抗原的生產階段。此階段需要嚴格控制培養條件，以獲得高產量和穩定質量的抗原。下游工藝包括收獲、純化、滅活等步驟，目的是獲得高純度的抗原組分。采用層析、過濾、沉淀等方法去除雜質，同時保持抗原的完整性和活性。制劑工藝將純化的抗原與佐劑、穩定劑等輔料混合，制備成最終劑型。此階段關鍵是保證均質性、無菌性和穩定性，通常包括配制、灌裝、凍干等工藝步驟。細胞培養技術貼壁細胞培養適用于原代細胞和某些連續傳代細胞系靜態培養：T瓶、細胞工廠、多層細胞培養瓶微載體培養：細胞附著在微球表面生長中空纖維反應器：細胞附著在半透膜表面優點：模擬體內環境，細胞形態和功能保持良好缺點：放大難度大，單位體積產量低懸浮細胞培養適用于某些工程化細胞系和昆蟲細胞搖瓶培養：實驗室小規模培養攪拌罐生物反應器：大規模工業化生產氣升式生物反應器：無機械攪拌，減小剪切力優點：易于大規模放大，過程控制簡便缺點：剪切力可能損傷某些敏感細胞病毒培養與收獲宿主細胞準備培養適合的宿主細胞至適當密度和狀態病毒接種以適當的感染復數(MOI)接種病毒病毒增殖控制培養條件使病毒高效復制病毒收獲最佳時間收獲含病毒的培養基或細胞抗原純化技術初步處理離心：去除細胞碎片和大顆粒雜質過濾：使用深層過濾或切向流過濾去除顆粒沉淀：用硫酸銨或PEG沉淀目標抗原中間純化離子交換層析：基于分子表面電荷分離疏水相互作用層析：基于分子表面疏水性分離分子篩層析：基于分子大小分離精細純化親和層析：利用特異性結合實現高純度分離超濾/透析：去除小分子雜質和溶劑交換多模式層析：結合多種分離機制提高純度滅活與減毒技術化學滅活法甲醛滅活：經典方法，用于百白破、脊灰等疫苗β-丙內酯滅活：反應快，殘留少，用于狂犬病疫苗二乙基吡碳酸酯：適用于某些熱敏感病毒過氧化氫：氧化作用滅活，殘留物為水和氧物理滅活法紫外線照射：表面滅活，穿透力有限γ射線照射：穿透力強，可用于最終產品滅菌熱處理：對某些病毒有效，但可能影響抗原性高壓處理：保持抗原結構完整性減毒技術傳代減毒：在非自然宿主細胞中連續傳代冷適應：在低溫下培養產生溫度敏感突變株基因重配：重組病毒基因組產生減毒株定向基因突變：定點修改毒力基因佐劑選擇與配制鋁佐劑包括氫氧化鋁凝膠和磷酸鋁，是最常用的佐劑。通過形成沉淀物延長抗原釋放，并促進抗原被抗原呈遞細胞攝取。主要增強體液免疫反應，安全性好但免疫增強作用有限。乳劑佐劑包括油包水(w/o)和水包油(o/w)乳劑。MF59和AS03是應用較廣的o/w乳劑佐劑，能顯著增強抗體反應和T細胞應答。油相組分一般采用角鯊烯等生物相容性好的油脂。免疫刺激劑利用病原體相關分子模式(PAMPs)激活模式識別受體，包括CpG寡核苷酸(TLR9激動劑)、單磷酰脂質A(TLR4激動劑)等。能夠模擬自然感染過程，誘導更強的先天和適應性免疫反應。納米載體包括脂質體、聚合物微粒等，能夠保護抗原、靶向遞送和控制釋放。新型脂質納米顆粒在mRNA疫苗中發揮關鍵作用，提高了mRNA的穩定性和細胞攝取效率。制劑工藝配方設計根據抗原特性和免疫需求選擇合適的輔料配制與過濾將抗原與輔料混合并進行無菌過濾灌裝與凍干精確灌裝到最終容器并進行凍干(如需)疫苗制劑工藝是確保最終產品質量的關鍵環節。配方設計需考慮抗原穩定性、免疫效果和使用便利性。常用輔料包括穩定劑(蔗糖、海藻糖)、緩沖劑(磷酸鹽緩沖液)、保護劑(明膠、人血白蛋白)和防腐劑(硫柳汞或酚)。灌裝過程在潔凈環境中進行，需嚴格控制微粒和微生物污染。對熱敏感抗原，凍干工藝可提高產品穩定性和貨架期。凍干周期包括凍結、一次干燥和二次干燥，每個階段的參數設置對產品質量至關重要。最后進行包裝和批號管理，確保產品可追溯性。第四章：疫苗質量控制最終放行完整批次審核后獲批放行2成品檢測安全性、效力、純度、穩定性等全面評價過程控制關鍵工藝參數監測和中間品檢測原材料控制確保所有起始物料符合質量標準原材料質量控制材料類型關鍵質量屬性檢測方法細胞基質無菌性、支原體、細胞特性、基因穩定性微生物檢測、細胞鑒定、核型分析培養基和血清無菌性、生物活性、內毒素、病毒污染微生物培養、LAL試驗、病毒檢測種子批純度、效價、遺傳穩定性、鑒別PCR、測序、效價測定輔料純度、無菌性、理化特性化學分析、微生物限度試驗包裝材料完整性、相容性、保護性物理測試、提取物試驗、密封性測試生產過程質量控制上游工藝控制細胞培養參數：pH值、溶氧、溫度、攪拌速度細胞生長指標：細胞密度、活率、代謝物分析感染效率：CPE觀察、病毒滴度測定工藝一致性：批次間變異控制下游工藝控制純化效率：雜質去除率、產品回收率純度檢測：蛋白純度、宿主細胞蛋白含量病毒滅活/去除驗證：殘留活病毒檢測產品特性：分子量、蛋白構象、抗原性制劑工藝控制配方均質性：成分分布均勻性無菌過濾：完整性測試、生物負載灌裝精度：裝量差異控制凍干參數：凍干曲線、殘留水分成品質量控制鑒別試驗確認產品的特異性和真實性，通常采用免疫學方法（ELISA、免疫擴散）或分子生物學方法（PCR、測序）進行。這一測試可以區分不同的疫苗產品，防止混淆。無菌與純度試驗包括無菌檢查、支原體檢測、細菌內毒素試驗、殘留宿主細胞蛋白檢測、殘留DNA檢測、異常毒性試驗等。這些測試確保產品不含有害雜質和污染物。效力檢測評估疫苗的生物學活性，通常包括體外抗原含量測定和體內效力測定兩種方法。體內效力測定可通過動物攻毒保護試驗或免疫原性指標（如抗體滴度）進行評價。物理化學檢查包括外觀、可見異物、pH值、滲透壓、裝量、鋁含量、蛋白含量、殘留試劑、水分等指標。這些指標反映了產品的物理化學穩定性和制劑質量。穩定性研究穩定性研究類型實時穩定性研究：在推薦儲存條件下進行，通常持續至超過預期有效期加速穩定性研究：在高于推薦條件下進行，加速降解過程壓力試驗：在極端條件下評估產品敏感性凍融循環研究：評估凍融對穩定性的影響光照穩定性：評估光照對產品質量的影響關鍵穩定性指標物理指標：外觀、顆粒大小、pH值、滲透壓、可復溶性化學指標：含量、雜質、降解產物、佐劑吸附率生物學指標：效力、抗原性、免疫原性微生物學指標：無菌性、保存劑效力影響因素溫度、光照、濕度、氧氣、包裝材料相容性、凍融循環第五章：疫苗安全性評價體外安全性評價利用細胞培養系統評估產品的細胞毒性、細胞功能影響和基因毒性等，減少動物使用的替代方法。常用技術包括細胞活力檢測、染色體畸變分析和微核試驗等。動物安全性評價在實驗動物模型中評價產品的急性毒性、重復給藥毒性、生殖發育毒性以及局部耐受性等。通過觀察動物的生理、行為和病理變化，確定產品的安全劑量范圍。臨床安全性評價在嚴格設計的臨床試驗中，通過評估不良事件的發生率和嚴重程度，確定產品在人體使用的安全性特征。臨床試驗后還需進行長期的上市后安全性監測。毒性試驗1急性毒性試驗評估單次大劑量給藥后的毒性反應。通常使用兩種哺乳動物（如小鼠和大鼠），給藥量為臨床劑量的多倍，觀察2周內的死亡率、行為變化和體重變化等指標。2重復給藥毒性試驗模擬臨床多次給藥方案，評估長期接種的安全性。實驗周期根據臨床方案而定，通常4-6周，觀察動物的臨床癥狀、血液學、生化、免疫學和病理學指標變化。3特殊毒性試驗包括生殖發育毒性（評估對生殖能力和后代發育的影響）、免疫毒性（評估對免疫系統功能的影響）、神經毒性（評估對神經系統的影響）等針對特定器官或系統的專項毒性研究。4局部耐受性試驗評估疫苗在接種部位的局部反應，包括疼痛、紅腫、硬結等。觀察接種部位的組織病理學變化，確定局部反應的嚴重程度和持續時間。過敏原性試驗全身性過敏反應試驗使用豚鼠或小鼠進行主動全身過敏反應試驗，首先用疫苗免疫動物，然后給予激發劑量，觀察是否出現過敏反應癥狀。指標包括體溫變化、呼吸困難、循環系統變化、死亡率等，評估疫苗誘導即時型超敏反應的風險。被動皮膚過敏反應試驗將免疫動物的血清注射到另一只動物的皮膚內，24小時后靜脈注射抗原和伊文思藍，觀察注射部位是否出現藍色斑點（皮膚過敏反應）。此方法可檢測疫苗誘導的IgE型抗體產生。局部淋巴結試驗評價疫苗成分的遲發型過敏潛力，測量疫苗局部接種后引起的淋巴結細胞增殖反應。技術操作較簡單，可減少動物使用，是評價過敏原潛力的替代方法?？乖禺愋訧gE檢測通過ELISA或流式細胞術等技術檢測免疫動物血清中抗原特異性IgE抗體水平，直接評價疫苗誘導過敏反應的可能性。此方法更加精確，可與傳統方法互為補充。免疫原性試驗體液免疫評價抗體滴度檢測：使用ELISA、血凝抑制試驗、中和試驗等方法測定特異性抗體水平抗體功能檢測：中和抗體活性、黏附抑制能力等抗體亞型分析：評估不同IgG亞型的比例，反映免疫反應的類型B細胞應答：通過ELISPOT檢測抗原特異性B細胞數量免疫記憶：評估長期抗體水平和記憶B細胞應答細胞免疫評價T細胞增殖：通過MTT或CFSE染色檢測抗原刺激下的T細胞增殖反應細胞因子檢測：使用ELISA、流式細胞術或qPCR測定細胞因子表達譜CTL活性：細胞毒性T淋巴細胞殺傷活性測定T細胞表型分析：CD4+/CD8+比例和記憶T細胞標記物檢測ELISPOT：檢測分泌特定細胞因子的細胞數量效力評價試驗免疫接種按臨床方案給動物接種疫苗攻毒挑戰用致病性病原體感染免疫動物指標觀察臨床癥狀、病毒載量、器官病理等保護評價計算保護率和相對效力指數第六章：實驗室安全與管理生物安全管理體系全面的安全管理制度與責任落實人員安全防護培訓、個人防護裝備和安全操作規程設施工程控制物理隔離和環境控制系統風險識別與評估明確危害因素與防控策略生物安全等級與防護安全等級適用微生物主要防護要求BSL-1對健康成人無致病性微生物基本實驗室操作和洗手盆BSL-2對人有中等危害的微生物限制進入，生物安全柜，個人防護裝備BSL-3可能經空氣傳播的致病微生物受控進入，負壓環境，雙層門，HEPA過濾BSL-4致命且無有效治療手段的微生物氣密門，專用供氣系統，正壓防護服，化學淋浴實驗室設施與設備要求基礎設施要求實驗區與辦公區嚴格分離，不同安全等級區域物理隔離。根據BSL等級配備相應的通風系統、氣閘門和壓力梯度控制系統。地面和墻面應防滲透、易清潔、耐腐蝕。配備應急淋浴設施、洗眼器和防火設備。關鍵設備配置生物安全柜：根據操作微生物種類選擇I級、II級A2/B2型或III級。高壓滅菌器：用于實驗廢棄物處理，最好采用雙門通道式。冷凍設備：-80℃超低溫冰箱保存菌毒種和樣本。離心機：帶密閉轉子或氣溶膠密封裝置的高速離心機。設備驗證與維護新設備必須進行安裝確認(IQ)和運行確認(OQ)，定期進行性能確認(PQ)。生物安全柜需每年進行HEPA過濾器完整性測試和氣流測試。高壓滅菌器需定期進行溫度分布驗證和生物指示劑驗證。維護記錄和校準證書必須完整存檔。實驗操作規范通用安全操作規程實驗室門應保持關閉，未經授權人員禁止入內。實驗區禁止飲食、吸煙和化妝。所有操作應避免產生氣溶膠。離開實驗區前必須洗手。使用機械吸管，禁止口吸。工作臺面在工作前后應當消毒。個人防護要求進入實驗室必須穿著專用實驗服，不得穿著實驗服離開實驗區。根據風險評估佩戴適當的手套、護目鏡、口罩或呼吸防護裝置。長發應束起，避免佩戴首飾。離開實驗室前更換個人防護裝備。高風險操作防護所有可能產生氣溶膠的操作（如離心、混勻、超聲處理）必須在生物安全柜內進行。使用尖銳物品時應格外小心，避免針刺傷。活病毒操作必須在適當安全等級實驗室進行，并遵循具體標準操作程序。意外事件處理針對溢灑、設備故障、人員暴露等情況制定應急預案。每個實驗室必須配備溢灑處理工具包和相應消毒劑。發生意外暴露后的醫療處置流程應明確，并定期進行應急演練。所有事故需詳細記錄并報告。廢棄物處理廢棄物分類感染性廢棄物：含有活微生物的材料銳器廢棄物：針頭、刀片、碎玻璃化學廢棄物：有毒、腐蝕性化學品一般實驗室垃圾：無特殊危害的廢棄物收集與存放使用專用容器分類收集，明確標識生物危險廢物使用防泄漏、防穿刺容器銳器必須放入防穿刺容器化學廢液分類收集，避免混合處理與滅活生物廢棄物高壓滅菌(121℃,30分鐘)部分廢棄物可用化學消毒劑處理化學廢棄物按環保要求特殊處理放射性廢棄物遵循放射防護規定最終處置與有資質的專業機構簽訂處置合同建立完整的廢棄物轉移記錄確保處置過程可追溯定期審核處置機構資質第七章：實驗內容（一）：滅活疫苗制備實驗內容概述病毒種子擴增與培養病毒收獲與純化方法β-丙內酯滅活工藝滅活效果驗證佐劑配制與乳化疫苗制劑配制技術要點無血清培養基優化最佳病毒收獲時間確定滅活劑濃度與時間控制抗原純度與含量測定佐劑乳化均勻性評價疫苗穩定性檢測關鍵設備生物反應器切向流過濾系統高速離心機色譜純化系統高壓均質機病毒效價測定儀器實驗目的與原理實驗目的掌握滅活疫苗制備的基本流程和關鍵技術。了解病毒培養、收獲、純化、滅活及制劑的全過程。培養無菌操作技能和生物安全意識。學習疫苗質量檢測的基本方法。滅活疫苗原理滅活疫苗是通過化學或物理方法使病原體失去感染力但保留免疫原性的疫苗。滅活過程必須完全殺滅病原體，同時盡可能保留其抗原結構完整性。常用滅活劑包括甲醛、β-丙內酯等。免疫保護機制滅活疫苗主要通過誘導體液免疫（抗體反應）產生保護效力。由于缺乏活病原體復制過程，通常需要多次免疫和添加佐劑增強免疫反應。添加的佐劑可刺激先天免疫系統，增強后續適應性免疫反應。實驗材料與儀器實驗材料細胞系：Vero細胞（非洲綠猴腎細胞）病毒種子：減毒流感病毒株培養基：DMEM/F12，補充2%胎牛血清滅活劑：0.05%β-丙內酯(BPL)純化試劑：蔗糖梯度液，PBS緩沖液佐劑系統：氫氧化鋁凝膠滅菌耗材：移液器吸頭，離心管，無菌燒瓶檢測試劑：TCID50測定試劑盒，蛋白質定量試劑實驗儀器生物安全柜（II級）：用于所有涉及活病毒的操作CO2培養箱：維持37℃,5%CO2條件離心機：配備生物安全轉子切向流過濾系統：濃縮和脫鹽超速離心機：病毒純化高效液相色譜儀：蛋白純度分析酶標儀：ELISA測定細胞計數器：細胞密度和活率測定高壓滅菌器：材料滅菌和廢棄物處理冷凍干燥機：樣品凍干（可選）實驗步驟：病毒培養細胞準備從液氮中復蘇Vero細胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養。使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，擴增至足夠數量。接種細胞密度控制在2-3×10^6/ml，培養至80-90%匯合度。實驗前24小時將培養基更換為無血清培養基，降低后續純化難度。病毒接種在生物安全柜中操作，將工作種子病毒按照0.01-0.1的感染復數(MOI)接種到準備好的細胞培養瓶中。輕輕搖勻，確保病毒均勻分布。37℃吸附1-2小時，期間每15-20分鐘輕輕搖動培養瓶，促進病毒吸附。病毒培養吸附結束后，加入無血清維持培養基。維持培養基中添加適量胰蛋白酶(2-5μg/ml)，促進病毒釋放。將培養瓶置于37℃,5%CO2培養箱中培養。每天觀察細胞病變效應(CPE)，記錄CPE發展情況。培養參數監測定期取樣檢測pH值、葡萄糖消耗、乳酸生成和氨基酸利用情況。使用血凝試驗或RT-PCR法監測病毒滴度變化。當CPE達到75-80%時（通常培養48-72小時），收獲病毒液。如有必要，在收獲前補充營養物質，提高病毒產量。實驗步驟：病毒收獲與純化病毒收獲CPE達75-80%時收獲病毒液低溫條件下操作(4℃)加入蛋白酶抑制劑保護病毒抗原澄清與過濾低速離心(2000×g,20分鐘)去除細胞碎片0.45μm濾膜過濾除去大顆粒記錄病毒液體積和性狀濃縮與脫鹽切向流過濾(TFF)濃縮10-20倍使用100kDa截留分子量膜緩沖液置換5-7次脫鹽密度梯度純化制備10-50%蔗糖梯度超速離心(28000rpm,3小時)收集含病毒的條帶PBS透析去除蔗糖實驗步驟：病毒滅活滅活前準備測定病毒濃度，調整至適宜濃度1滅活劑添加加入0.05%β-丙內酯，慢速攪拌2滅活反應4℃孵育24小時，后37℃水浴2小時滅活驗證細胞培養法驗證滅活完全性實驗步驟：佐劑添加與制劑1抗原含量測定使用BCA法或紫外吸收法測定蛋白含量。用ELISA或SRID方法測定特異性抗原含量。根據測定結果計算所需抗原量，疫苗中抗原含量通常為15-45μg/劑。2佐劑準備準備2%氫氧化鋁凝膠懸浮液，滅菌過濾備用。配制含0.01MPBS(pH7.2)的稀釋緩沖液。根據抗原理化性質決定是否需要調整凝膠pH值。3抗原吸附將抗原溶液緩慢滴加到攪拌中的佐劑懸浮液中，控制滴加速率。室溫下攪拌2小時完成吸附過程。吸附后4℃靜置過夜，增加吸附效率。4制劑配制加入適量保護劑(如0.5%人血白蛋白)。添加防腐劑(如0.01%硫柳汞)。調整等滲性和pH值。無菌條件下分裝于滅菌西林瓶中，每瓶0.5ml。貼標簽注明批號、劑量和失效日期。實驗數據記錄與分析記錄項目記錄內容分析方法細胞培養數據細胞密度、活率、形態、傳代次數增長曲線分析，細胞生長參數計算病毒培養數據CPE進展，病毒滴度，收獲時間最佳收獲時間分析，病毒產量計算純化過程數據回收率，純度，濃度變化純化效率評價，損失原因分析滅活效果數據滅活前后病毒活性，安全性驗證結果滅活動力學分析，滅活完全性評價制劑特性數據抗原含量，吸附率，pH值，外觀產品質量一致性評價，佐劑效應分析第八章：實驗內容（二）：重組蛋白疫苗制備基因工程技術重組蛋白疫苗制備基于DNA重組技術，將目標抗原基因克隆到表達載體中，通過宿主細胞表達系統生產抗原蛋白。這種方法可以精確控制抗原設計，避免使用活病原體，顯著提高安全性。表達系統選擇根據目標蛋白特性選擇適當的表達系統，常用的包括大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。每種系統有其優缺點，影響蛋白折疊、翻譯后修飾和產量。本實驗將使用大腸桿菌系統表達相對簡單的病毒抗原蛋白。生產工藝重組蛋白疫苗的生產工藝包括基因克隆與表達、蛋白純化、蛋白特性分析和制劑配方研究。與傳統疫苗相比，重組技術可以實現大規模、標準化生產，具有良好的批次一致性和可控性。實驗目的與原理實驗目的掌握重組蛋白疫苗制備的基本流程和關鍵技術。學習基因克隆、蛋白表達、純化和鑒定的實驗方法。了解疫苗抗原的分子設計原則和質量控制要點。培養分子生物學和蛋白質工程的實驗技能?；蛑亟M原理利用分子克隆技術，將編碼目標抗原的基因序列插入到表達載體中，構建重組表達質粒。表達載體通常含有強啟動子、多克隆位點、選擇標記和標簽序列等功能元件。通過轉化將重組質粒導入宿主細胞，利用宿主細胞的轉錄翻譯系統表達目標蛋白。蛋白表達與純化原理通過誘導條件激活表達載體上的啟動子，使目標基因大量轉錄翻譯。表達的重組蛋白可能以可溶形式存在于胞質或培養基中，也可能形成包涵體。利用親和層析、離子交換、分子篩等技術分離純化目標蛋白。通過標簽技術(如His標簽)簡化純化過程。實驗材料與儀器生物材料目標基因：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因載體：pET28a表達載體(含His標簽)菌株：大腸桿菌BL21(DE3)限制性內切酶：BamHI和XhoIT4DNA連接酶PCR擴增試劑盒質粒提取試劑盒蛋白純化樹脂：Ni-NTA瓊脂糖抗體：抗HBsAg單克隆抗體主要儀器設備PCR儀：基因擴增電泳系統：DNA和蛋白分析凝膠成像系統：電泳結果分析恒溫搖床：菌種培養超聲破碎儀：細胞破碎高速冷凍離心機：樣品分離蛋白純化系統：?KTA純化系統超濾離心管：蛋白濃縮分光光度計：蛋白濃度測定Westernblot系統：蛋白鑒定實驗步驟：基因克隆與表達1目標基因擴增設計含有BamHI和XhoI限制性酶切位點的引物。以乙肝病毒基因組為模板，PCR擴增HBsAg基因片段。反應條件：預變性94℃5分鐘，30個循環(94℃30秒，58℃30秒，72℃1分鐘)，終延伸72℃10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，切膠回收目標條帶。2載體構建PCR產物和pET28a載體分別用BamHI和XhoI雙酶切，37℃4小時。酶切產物凝膠電泳純化。以1:3的摩爾比(載體:插入片段)設置連接反應，16℃過夜。連接產物轉化至DH5α感受態細胞，在含卡那霉素的LB平板上篩選陽性克隆。提取質粒進行PCR和酶切驗證，測序確認。3重組蛋白表達將正確的重組質粒轉化至BL21(DE3)表達菌株。挑取單菌落接種到5mlLB培養基(含卡那霉素50μg/ml)，37℃培養過夜。按1:100比例接種至500ml培養基中，37℃振蕩培養至OD600約0.6。加入IPTG至終濃度1mM誘導表達，16℃繼續培養16-18小時。收集菌體，-80℃保存。4表達驗證取少量菌液進行SDS分析，比較誘導前后的蛋白表達譜變化。根據目標蛋白的理論分子量(約24kDa加上His標簽)確認表達條帶。采用Westernblot進一步驗證，使用抗His標簽抗體和抗HBsAg抗體進行免疫檢測，確認目標蛋白的表達。實驗步驟：蛋白純化細胞破碎與包涵體處理凍存菌體在裂解緩沖液(50mMTris-HClpH8.0,300mMNaCl,10mM咪唑)中重懸。超聲破碎(功率300W，工作10秒，間隔10秒，共30分鐘)，冰浴條件下操作。12,000×g離心20分鐘分離上清和沉淀。如果目標蛋白以包涵體形式存在，需要用含8M尿素的變性緩沖液溶解包涵體，之后進行復性處理。親和層析純化平衡Ni-NTA瓊脂糖柱(10ml)，用5倍柱體積的裂解緩沖液。將細胞裂解上清或變性復性的包涵體溶液上樣至柱子，流速控制在1ml/分鐘。用含20mM咪唑的洗脫緩沖液洗滌(10倍柱體積)，去除非特異結合蛋白。用含250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目標蛋白，收集洗脫峰。離子交換和分子篩純化將親和層析得到的洗脫液透析至低鹽緩沖液(20mMTris-HClpH8.0)。上樣至預平衡的QSepharose陰離子交換柱，使用NaCl梯度(0-1M)洗脫。收集含目標蛋白的洗脫峰，濃縮至2-5ml。將濃縮樣品上樣至Superdex200分子篩柱，用PBS緩沖液洗脫，收集目標蛋白單體峰。蛋白濃縮與緩沖液置換將純化的蛋白溶液使用分子量截留值為10kDa的超濾離心管濃縮至目標濃度(通常1-5mg/ml)。同時更換為最終儲存緩沖液(PBSpH7.4)。無菌過濾，分裝到無菌離心管中。測定蛋白濃度(BCA法)，-80℃保存或直接用于下一步制劑配制。實驗步驟：蛋白定量與鑒定蛋白質定量與鑒定是確保重組疫苗抗原質量的關鍵步驟。我們采用多種互補技術對純化的HBsAg蛋白進行全面分析。首先使用BCA法和紫外分光光度法測定蛋白濃度，隨后通過SDS評估純度，使用Westernblot和ELISA確認抗原特異性，并利用質譜技術驗證蛋白序列。最后，通過圓二色譜和動態光散射分析蛋白的二級結構和均一性，確保其具有正確的構象。實驗步驟：佐劑添加與制劑抗原準備調整純化蛋白濃度至0.5-1mg/ml1佐劑選擇與制備準備氫氧化鋁或MF59乳劑佐劑抗原-佐劑混合控制適當比例和溫度進行混合吸附3輔料添加與配方優化加入穩定劑、防腐劑等輔料灌裝與包裝無菌條件下進行分裝與標簽5實驗數據記錄與分析蛋白表達量(mg/L)純度(%)抗原活性(%)上圖展示的實驗數據表明，蛋白表達量在誘導后16小時達到峰值，約為120mg/L，此時純度和抗原活性也達到最佳狀態。繼續延長培養時間至24小時，雖然蛋白產量略有增加，但純度和抗原活性開始下降，可能是由于蛋白降解或錯誤折疊增加。因此，確定最佳誘導表達時間為16小時。在純化過程中，親和層析步驟回收率約為80%，離子交換和分子篩步驟分別為85%和90%。最終產品的總回收率約為61%，純度達到95%以上，符合疫苗原料的質量要求?？乖钚詼y定顯示，純化后的HBsAg蛋白與參考標準品的結合活性相當，證明純化過程保持了抗原表位完整性。第九章：實驗內容（三）：疫苗質量檢測物理化學檢測外觀：目視檢查懸浮液均一性、顏色pH值：pH計測定蛋白含量：BCA法、紫外吸收法鋁含量：原子吸收光譜法佐劑吸附率：上清分析法生物學檢測無菌檢查：直接接種法內毒素：鱟試驗法異常毒性：動物注射觀察法效價測定：ELISA或動物免疫法殘留病毒：細胞培養法分子生物學檢測鑒別試驗：PCR或免疫印跡殘留DNA：qPCR法宿主細胞蛋白：ELISA法分子完整性：質譜分析蛋白構象：圓二色譜實驗目的與原理實驗目的掌握疫苗質量檢測的基本方法和技術要點。了解無菌檢查、效價測定和安全性檢測的操作流程。培養疫苗質量控制的實驗技能和規范意識。學習實驗數據的記錄、分析和結果判定方法。質量檢測的意義疫苗質量檢測是確保疫苗安全性和有效性的關鍵環節。完善的質量控制體系是疫苗從實驗室到臨床應用的必要保障。監管部門要求每批疫苗必須通過一系列標準化檢測后才能上市。質量檢測貫穿疫苗開發和生產的全過程，是保障公眾健康的重要屏障。檢測原理無菌檢查：通過接種培養基檢測疫苗中是否存在活的微生物污染。根據《中國藥典》要求，采用直接接種法或薄膜過濾法，分別使用流體硫乙醇酸鹽培養基(FTM)和胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)檢測需氧和厭氧微生物。效價測定：根據疫苗類型采用適當方法評價其生物學活性。對于蛋白疫苗，通常通過ELISA測定抗原含量；對于滅活疫苗，可能需要動物免疫后測定中和抗體滴度；對于減毒活疫苗，則需要測定病毒感染性滴度。安全性檢查：包括異常毒性試驗、特異性毒性試驗和接種部位反應檢查等。異常毒性通過小鼠和豚鼠體重變化及臨床癥狀評價；特異性毒性針對特定疫苗可能的特殊毒性；接種部位反應評價局部耐受性。實驗材料與儀器無菌檢查材料與儀器流體硫乙醇酸鹽培養基(FTM)和胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、無菌操作臺、恒溫培養箱(20-25℃和30-35℃)、無菌采樣器具、薄膜過濾裝置(0.45μm)、無菌接種環和針效價測定材料與儀器ELISA試劑盒(包括包被抗體、標準品、酶標二抗、底物)、微孔板、酶標儀、洗板機、孵育箱、精密移液器、實驗動物(小鼠或豚鼠)、血清收集材料安全性檢查材料與儀器SPF級小鼠和豚鼠、無菌注射器、電子天平、體溫計、解剖工具、組織固定液、組織切片設備、顯微鏡檢測樣品實驗制備的滅活疫苗和重組蛋白疫苗樣品、陽性對照疫苗(已知效價和安全性的參考品)、陰性對照樣品(僅含佐劑的制劑)實驗步驟：無菌檢查實驗準備提前48小時檢查培養基的無菌性準備無菌操作環境(層流柜)準備樣品和陰陽性對照培養基預熱至室溫直接接種法取樣品1ml分別加入10mlFTM和TSB中含油佐劑的疫苗需加入適量聚山梨酯設置無接種陰性對照和陽性菌種對照混勻后避光培養薄膜過濾法使用0.45μm濾膜過濾樣品無菌PBS沖洗濾膜3次將濾膜剪成兩半，分別置于FTM和TSB中混勻后避光培養結果觀察與判定FTM在30-35℃培養14天TSB在20-25℃培養14天每天觀察培養基澄清度變化有渾濁則可能存在微生物污染實驗步驟：效價測定1滅活疫苗效