第第頁專題22基因工程考點1重組DNA技術的基本工具(2024湖南，5，2分)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是()A.限制酶失活，更換新的限制酶B.酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等C.質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNAD.酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶【答案】B限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，此時應有部分DNA被酶切，B錯誤；質粒DNA突變導致限制酶識別位點缺失，會造成限制酶無法進行切割，因此應更換為正常質粒DNA，C正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。(2023重慶，12，3分)某小組通過PCR[假設引物長度為8個堿基(短于實際長度)]獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切(如圖)，再用所得片段成功構建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是()A.其中一個引物序列為5'-TGCGCAGT-3'B.步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段D.酶切片段和載體連接時，可使用E.coli連接酶或T4連接酶【答案】B由于引物只能引導子鏈從5'到3'合成，分析圖中擴增獲得的DNA片段可知，其中一個引物序列為5'-TGCGCAGT-3'，A正確；根據三種限制酶的識別序列和酶切后的DNA片段左右側的黏性末端可知，步驟①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ，B錯誤；用步驟①的兩種酶對載體進行酶切，至少切斷2處，切割之后至少獲得了2個片段，C正確；圖中形成的是黏性末端，E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶對平末端和黏性末端均可連接，D正確。(2023新課標，6，6分)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是 ()A.質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接【答案】C酶4切割位點位于抗生素抗性基因(標記基因)內部，酶切后會破壞標記基因，D不符合題意；酶3切割后產生平末端，E.coliDNA連接酶僅能連接黏性末端，故E.coliDNA連接酶無法連接酶3切割產生的平末端，A不符合題意；若用酶3切割質粒、酶1切割目的基因，兩者產生的末端無法連接在一起，B不符合題意；酶1和酶2切割后產生不同的黏性末端，T4DNA連接酶既可連接黏性末端，也可連接平末端，若用酶1和酶2同時切割質粒和目的基因，并用T4DNA連接酶連接，則既可避免質粒和目的基因的自身環化，又能保證目的基因正確插入質粒，C符合題意。(2022遼寧，12，2分)抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5是我國自主研發的轉基因品種。為給監管轉基因生物安全提供依據，采用PCR方法進行目的基因監測，反應程序如圖所示。下列敘述正確的是()A.預變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復制B.后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分C.延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制D.轉基因品種經檢測含有目的基因后即可上市【答案】B94℃預變性可使模板DNA解旋為單鏈，72℃延伸過程中才會使4種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的催化作用下合成子鏈，A錯誤；72℃，1min的后延伸過程可使目的基因的擴增更充分，B正確；由于TaqDNA聚合酶只能催化單個的脫氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端，不能從頭合成DNA，故延伸過程中需要引物參與，C錯誤；為防基因污染，確保安全，我國制定了相關法規和政策進行依法監管，轉基因品種需經國家農業轉基因生物安全委員會(評價機構)評價安全后才可推廣上市，D錯誤。(2021浙江6月選考，20，2分)采用CRISPR/Cas9基因編輯技術可將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因定點插入受精卵的Y染色體上，獲得轉基因雄性小鼠。該轉基因小鼠與野生型雌性小鼠交配，通過觀察熒光可確定早期胚胎的性別。下列操作錯誤的是()A.基因編輯處理的受精卵在體外培養時，不同發育階段的胚胎需用不同成分的培養液B.基因編輯處理的受精卵經體外培養至2細胞期，須將其植入同期發情小鼠的子宮，才可獲得表達EGFP的小鼠C.分離能表達EGFP的胚胎干細胞，通過核移植等技術可獲得大量的轉基因小鼠D.通過觀察早期胚胎的熒光，能表達EGFP的即為雄性小鼠胚胎【答案】B受精卵在體外培養時，由于不同發育階段的胚胎細胞所需的環境有所不同，因此需要更換不同成分的培養液，A正確；進行胚胎移植的早期胚胎通常為發育到8細胞以上的胚胎，如早期囊胚，B錯誤；利用胚胎干細胞通過核移植等技術來獲得轉基因小鼠時，可在短時間內獲得大量的轉基因小鼠胚胎，再通過胚胎移植技術大量培養轉基因小鼠，C正確；根據題干信息可知，EGFP基因被定點插入Y染色體上，而Y染色體只有雄性才具有，因而觀察早期胚胎的熒光，能表達EGFP的即為雄性小鼠胚胎，D正確。(2021遼寧，14，2分)腈水合酶(N0)廣泛應用于環境保護和醫藥原料生產等領域，但不耐高溫，利用蛋白質工程技術在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1)。下列有關敘述錯誤的是()A.N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩定性的原因之一B.加入連接肽需要通過改造基因實現C.獲得N1的過程需要進行轉錄和翻譯D.檢測N1的活性時先將N1與底物充分混合，再置于高溫環境【答案】D根據題意可知，與N0相比，N1多了一段連接肽，二者氨基酸序列的差異是影響其熱穩定性的原因之一，A正確；利用蛋白質工程改造蛋白質時需對相關基因進行修飾或合成，在N0的結構中加入連接肽需要通過改造相關基因來實現，B正確；獲得N1的過程需要進行轉錄和翻譯，C正確；檢測N1的活性時，需要先將N1與底物置于高溫環境下，再將N1與底物充分混合，D錯誤。(2021湖北，7，2分)限制性內切酶EcoRⅠ識別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為()A.6B.250C.4000D.24000【答案】C根據題干信息可知，限制性內切酶EcoRⅠ的識別位點是由6個堿基對構成的，若用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，則理論上得到DNA的的平均長度(堿基對)約為46堿基對，即約為4000堿基對。故選C。(2021湖北，16，2分)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應中非特異條帶的產生，以下措施中有效的是()A.增加模板DNA的量B.延長熱變性的時間C.延長延伸的時間D.提高復性的溫度【答案】DPCR反應中出現非特異性條帶的主要原因是引物與模板DNA出現了非特異性結合，模板DNA不純或過多易出現非特異性結合，A錯誤；延長熱變性時間與非特異性條帶無直接關系，B錯誤；延長延伸時間易出現非特異性結合，C錯誤；復性溫度偏低易出現非特異性結合，故提高復性溫度可減少反應中非特異條帶的產生，D正確。(2021山東，4，2分)我國考古學家利用現代人的DNA序列設計并合成了一種類似磁鐵的“引子”，成功將極其微量的古人類DNA從提取自土壤沉積物的多種生物的DNA中識別并分離出來，用于研究人類起源及進化。下列說法正確的是()A.“引子”的徹底水解產物有兩種B.設計“引子”的DNA序列信息只能來自核DNAC.設計“引子”前不需要知道古人類的DNA序列D.土壤沉積物中的古人類雙鏈DNA可直接與“引子”結合從而被識別【答案】C根據題意，“引子”是利用現代人的DNA序列設計并合成的，其本質是DNA或RNA，DNA的徹底水解產物有磷酸基團、脫氧核糖、四種堿基，RNA的徹底水解產物有磷酸基因、核糖、四種堿基，A錯誤；人的細胞核、線粒體中均有DNA，故設計“引子”的DNA序列信息可以來自核DNA和線粒體DNA，B錯誤；設計“引子”前不需要知道古人類的DNA序列，“引子”是利用現代人的DNA序列設計的，C正確；雙鏈DNA解旋成單鏈后才能與“引子”序列發生堿基互補配對，從而被識別，D錯誤。(2020山東，15，2分)新型冠狀病毒的檢測方法目前主要有核酸檢測法和抗體檢測法。下列說法錯誤的是()A.抗體檢測法利用了抗原與抗體特異性結合的原理B.感染早期，會出現能檢測出核酸而檢測不出抗體的情況C.患者康復后，會出現能檢測出抗體而檢測不出核酸的情況D.感染該病毒但無癥狀者，因其體內不能產生抗體不適用抗體檢測法檢測【答案】D抗體檢測法利用了抗原與抗體特異性結合的原理，A正確；感染早期，新冠病毒的核酸已進入機體，但機體可能尚未進行體液免疫產生抗體，會出現能檢測出核酸而檢測不出抗體的情況，B正確；患者康復后，體內留有記憶細胞和抗體，而新冠病毒已被機體清除，會出現能檢測出抗體而檢測不出核酸的情況，C正確；感染該病毒但無癥狀者，其體內會發生體液免疫產生抗體，適用抗體檢測法檢測，D錯誤。(2020浙江7月選考，24，2分)下列關于基因工程的敘述，正確的是()A.若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性核酸內切酶，則一定有利于該重組質粒進入受體并保持結構穩定B.抗除草劑基因轉入某抗鹽植物獲得2個穩定遺傳轉基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉入無關C.抗除草劑基因轉入某植物獲得轉基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達了抗性蛋白而后者只表達抗性基因RNAD.已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶。用某種限制性核酸內切酶完全酶切環狀質粒后，出現3條帶。表明該質粒上一定至少有3個被該酶切開的位置【答案】D若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制酶，該酶會破壞重組質粒的結構，不利于重組質粒在受體中保持結構穩定，A錯誤；抗除草劑基因轉入某抗鹽植物獲得的2個穩定遺傳品系中有抗除草劑不抗鹽的品系，抗鹽性的改變可能與抗除草劑基因的轉入有關，B錯誤；在DNA檢測均含目的基因的條件下，抗性鑒定為抗除草劑說明目的基因完成了表達，抗性鑒定為不抗除草劑說明目的基因可能完成了轉錄而沒有翻譯成蛋白質，還有可能是目的基因沒有轉錄，C錯誤；因為質粒為環形，用某限制酶完全酶切后出現3條帶，說明酶切后的產物中有3種不同分子量的DNA，可以推測出質粒上至少有3個位置被該酶切開，D正確。(2018北京理綜，5，6分)用XhoⅠ和SalⅠ兩種限制性核酸內切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產物分離結果如圖。以下敘述不正確的是()圖1酶切位點圖圖2電泳結果示意圖A.圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同B.圖2中酶切產物可用于構建重組DNAC.泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產物D.圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA【答案】D本題通過對酶切位點圖和電泳結果示意圖的分析，考查基因工程工具酶的相關知識，以及觀察圖示、分析推理的能力，試題通過兩種圖示的分析體現了對科學思維素養中的演繹與推理要素的考查。圖1中，兩種限制性核酸內切酶的酶切位點不同，說明兩種限制性核酸內切酶識別的核苷酸序列不同，A正確。圖2中，兩種酶的酶切產物都為DNA片段，都可用于構建重組DNA，B正確。結合圖1的酶切位點圖，判斷兩種酶切DNA后得到的DNA片段數；再結合泳道①②電泳結果知，泳道①是用SalⅠ處理得到的酶切產物，C正確。能被限制性核酸內切酶酶切的DNA片段仍為雙鏈DNA，D錯誤。(2017北京理綜，5，6分)為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質粒(圖2)重組，再借助農桿菌導入菊花中。下列操作與實驗目的不符的是()A.用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和連接酶構建重組質粒B.用含C基因的農桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因導入細胞C.在培養基中添加卡那霉素，篩選被轉化的菊花細胞D.用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上【答案】C本題主要考查基因工程的相關知識。由于C基因兩端及質粒上均存在限制酶EcoRⅠ的酶切位點，因此，可采用限制酶EcoRⅠ和DNA連接酶構建重組質粒；用含C基因的農桿菌侵染菊花愈傷組織(即農桿菌轉化法)，可以將C基因導入細胞；由于質粒上存在潮霉素抗性基因(標記基因)，因此，可以在培養基中添加潮霉素，篩選被轉化的菊花細胞，C符合題意；可用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上。[2022福建，21(一)]美西螈具有很強的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬細胞在斷肢再生的早期起重要作用。為研究巨噬細胞的作用機制，科研人員制備了抗巨噬細胞表面標志蛋白CD14的單克隆抗體，具體方法如下。回答下列問題:(一)基因工程抗原的制備(1)根據美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR擴增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'-OH與加入的脫氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯鍵，則新合成鏈的延伸方向是(填“5'→3'”或“3'→5'”)。

(2)載體和CD14片段的酶切位點及相應的酶切序列如圖1所示。用XhoⅠ和SalⅠ分別酶切CD14和載體后連接，CD14接入載體時會形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA。可進一步用這兩種限制酶對CD14的連接方向進行鑒定，理由是。

(3)培養能表達CD14蛋白的大腸桿菌，分離純化目的蛋白。

【答案】(一)(1)5'→3'(2)正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點(限制酶的識別序列)；而反向連接的重組DNA會形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點(沒有限制酶的識別序列)解析(一)(1)PCR擴增過程中，引物鏈的延伸方向為5'→3'。(2)兩種酶雖然能切出相同的黏性末端，但正向連接的重組DNA，限制酶的識別序列沒有變，仍能用原來的兩種酶進行酶切；反向連接的重組DNA，不存在XhoⅠ和SalⅠ兩種限制酶的識別序列，無法再進行酶切。(2021全國乙，38，15分)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內切酶的切割位點如圖所示。回答下列問題:(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。

(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是。

(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能；質粒DNA分子上有，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是。

(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指。

【答案】(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復制限制酶切割位點將待篩選的宿主細胞接種到含該抗生素的培養基中，能夠生長的是含有質粒載體的宿主細胞(4)RNA聚合酶識別、結合并啟動轉錄的DNA片段解析(1)E.coliDNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來。T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。(2)DNA連接酶是通過催化兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，將雙鏈DNA片段“縫合”起來的。(3)作為載體，質粒DNA分子上必須有復制原點，才能使質粒在受體細胞中能進行自我復制；且質粒DNA分子上應具有一個至多個限制酶切割位點，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因，可以用添加特定抗生素的選擇培養基培養經轉化處理的宿主細胞，以達到篩選目的。(4)啟動子是指RNA聚合酶識別、結合并啟動轉錄的DNA片段。(2021全國甲，38，15分)PCR技術可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫生進行了相關操作:①分析PCR擴增結果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題:(1)若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是(用數字序號表示)。

(2)操作③中使用的酶是。PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、三步，其中復性的結果是

。

(3)為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能與特異性結合。

(4)PCR(多聚酶鏈式反應)技術是指。該技術目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。

【答案】(1)④②③①(2)DNA聚合酶延伸引物通過堿基互補配對與單鏈DNA結合(3)病原菌DNA(4)在生物體外大量快速擴增特定DNA片段的技術解析(1)根據題干中給出的信息分析，若要檢測病人是否感染了某種病原菌，需要從病人體內獲取組織樣本，提取樣本中的DNA，進行PCR擴增，再分析PCR擴增的結果。由此可知若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是④②③①。(2)操作③利用PCR擴增DNA片段時需要使用的酶是(耐高溫的)DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶。PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、延伸三步，其中復性是指溫度下降到55~60℃，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。(3)為了做出正確的診斷，應檢測病原菌的遺傳物質，所以PCR反應所用的引物應該能與病原菌DNA特異性結合。(4)PCR(多聚酶鏈式反應)技術是指在生物體外大量快速擴增特定DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。(2021山東，25，12分)人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有BCL11A蛋白結合位點，該位點結合BCL11A蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。(1)為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知，在F1~F7末端添加的序列所對應的限制酶是，在R末端添加的序列所對應的限制酶是。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要種酶。

(2)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉化后，含F1~F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光。含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光的原因是。

(3)向培養液中添加適量的雌激素，含F1~F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光，而含F5~F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有BCL11A蛋白的結合位點序列，據此結果可推測，BCL11A蛋白結合位點位于，理由是

。

【答案】(1)SalⅠEcoRⅠ6(2)F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達(3)引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上根據有無熒光情況判斷，F1~F4與R擴增產物上均有結合位點，因此結合位點位于F4所對應調控序列的下游(右側)；F5~F6與R擴增產物上均無結合位點，可知結合位點位于F5所對應調控序列的上游(左側)，所以結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上解析(1)觀察圖示可知，熒光蛋白基因的左側為終止子，為了將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，擴增后的產物的插入點應在熒光蛋白基因的右側，而熒光蛋白基因的右側有三個限制酶切割位點，分別是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ的切割位點，但因為用EcoRⅠ會破壞熒光蛋白基因，所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割載體，切割后載體的部分序列如圖所示:擴增后的產物的兩端添加限制酶后得到的DNA片段能夠替換上圖載體中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位點之間的片段，并能與左側的熒光蛋白基因片段及右側的片段連接起來。由題圖中終止子及基因的位置可知，F1~F7末端添加序列后應與XhoⅠ切割的末端相連，R末端添加序列后應與MunⅠ切割的末端相連。由于調控序列及啟動子中有XhoⅠ限制酶切割位點，所以需尋找切割后的末端能與XhoⅠ限制酶切割后的末端連接且調控序列及啟動子中無其切割位點的限制酶，SalⅠ符合這一要求，所以在F1~F7末端添加的序列所對應的限制酶是SalⅠ；由于調控序列及啟動子中含有MunⅠ的切割位點，所以需尋找切割后的末端能與MunⅠ限制酶切割后的末端連接且調控序列及啟動子中無其切割位點的限制酶，EcoRⅠ符合這一要求，所以在R末端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅠ。擴增后的產物的兩端添加的限制酶識別序列如圖所示:本實驗中，用EcoRⅠ和SalⅠ切割擴增產物，用MunⅠ和XhoⅠ切割載體，故從產物擴增到載體構建完成的整個過程需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA連接酶共6種酶。(2)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉化后，含F1~F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，說明F1~F6與R擴增產物含完整的啟動子，熒光蛋白基因表達；含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光，說明F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達。(3)向培養液中添加適量的雌激素，雌激素能誘導P發揮作用，使BCL11A基因表達。構建的載體含有BCL11A基因，導入構建載體的受體細胞能合成BCL11A蛋白。含F1~F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光，說明F1~F4與R擴增產物上均有BCL11A蛋白的結合位點(調控啟動子，熒光蛋白基因不表達)，因此結合位點位于F4所對應調控序列的下游(右側)；而含F5~F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光，說明F5~F6與R擴增產物上均無BCL11A蛋白的結合位點(熒光蛋白基因能表達)，由此可知結合位點位于F5所對應調控序列的上游(左側)，所以結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上。(2019課標全國Ⅰ，38，15分)基因工程中可以通過PCR技術擴增目的基因。回答下列問題。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得。基因文庫包括和。

(2)生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的。

(3)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是。

【答案】(1)基因組文庫cDNA文庫(2)解旋酶加熱至90~95℃氫鍵(3)Taq酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活解析本題借助目的基因的獲取考查基因工程中的PCR技術以及考生對生物學問題進行科學解釋的能力；試題通過PCR技術與體內DNA復制的比較，體現了對科學思維中歸納與概括要素的考查。(1)基因文庫包括基因組文庫和cDNA文庫。(2)體內DNA復制時，需用解旋酶打開氫鍵使雙鏈DNA解旋，而PCR擴增目的基因時，是借助高溫加熱至90~95℃使DNA變性解旋。(3)PCR反應體系中進行互補鏈的合成時，溫度需控制在70~75℃，則應使用耐高溫的DNA聚合酶，即Taq酶，而不能使用大腸桿菌DNA聚合酶(高溫下會失活)。(2018課標全國Ⅰ，38，15分)回答下列問題:(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達。該研究除證明了質粒可以作為載體外，還證明了

(答出兩點即可)。

(2)體外重組的質粒可通過Ca2+參與的方法導入大腸桿菌細胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是。

(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解。為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加的抑制劑。

【答案】(1)體外重組的質粒可以進入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達(2)轉化外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)細菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶解析本題主要考查基因工程的相關知識，試題通過三問并列的命題方式考查基因工程的原理與操作程序，考查考生的識記、理解能力，涉及科學思維素養中歸納與概括、演繹與推理等思維過程。本題主要考查基因工程的相關知識。(1)體外重組的質粒可以進入受體細胞，且重組質粒在不同細胞中能正常表達，說明目的基因在不同細胞中的表達機制相同，生物界共用一套遺傳密碼。(2)基因工程中，受體細胞為大腸桿菌細胞時，常用Ca2+處理大腸桿菌，使之處于感受態，即Ca2+參與的轉化法。噬菌體DNA與外殼蛋白組裝成完整噬菌體。因噬菌體的宿主是細菌，故只有細菌可作為重組噬菌體的宿主細胞。(3)為防止目的基因表達的蛋白質被破壞，可選用不能合成蛋白酶的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化過程中加入蛋白酶的抑制劑可以保護蛋白質不被水解。[2018浙江4月選考，32(二)，7分]回答與基因工程和植物克隆有關的問題:(1)將含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體pBI121均用限制性核酸內切酶EcoRⅠ酶切，在切口處形成。選取含抗蟲基因的DNA片段與切割后的pBI121用DNA連接酶連接，在兩個片段相鄰處形成，獲得重組質粒。

(2)已知用CaCl2處理細菌，會改變其某些生理狀態。取CaCl2處理過的農桿菌與重組質粒在離心管內進行混合等操作，使重組質粒進入農桿菌，完成實驗。在離心管中加入液體培養基，置于搖床慢速培養一段時間，其目的是，從而表達卡那霉素抗性基因，并大量增殖。

(3)取田間不同品種水稻的幼胚，先進行，然后接種到培養基中培養，幼胚發生形成愈傷組織，并進行繼代培養。用含重組質粒的農桿菌侵染愈傷組織，再培養愈傷組織，以便獲得抗蟲的轉基因水稻。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有:培養條件如光溫、培養基配方如植物激素配比以及。(答出2點即可)。

【答案】(1)粘性末端磷酸二酯鍵(2)轉化使CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態(3)消毒脫分化水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數解析(1)用限制性核酸內切酶EcoRⅠ酶切含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體PBⅠ121，可在切口處形成粘(黏)性末端，通過DNA連接酶連接，在兩個片段相鄰處形成磷酸二酯鍵，從而獲得重組質粒。(2)經CaCl2處理過的農桿菌，成為感受態細胞，與重組質粒混合，使重組質粒進入細胞，從而完成轉化實驗。將其置于搖床慢速培養一段時間，目的是使經CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態，從而表達卡那霉素抗性基因，并大量增殖。(3)田間獲取的水稻幼胚，需要先進行消毒處理，后接種培養，經脫分化形成愈傷組織，并進行繼代培養。影響愈傷組織能否再生出植株的因素，除了培養條件，還有水稻本身的基因型這一內因，也跟繼代培養次數有關。易錯警示影響愈傷組織再生出植株的因素，題干中給出了外界培養條件，所以應從內因考慮。同時，一些植物在多次繼代培養后也會喪失細胞全能性的表達能力，所以也跟繼代培養次數有關。(2017課標全國Ⅰ，38，15分)真核生物基因中通常有內含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內含子對應的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)。回答下列問題:(1)某同學從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A，其原因是。

(2)若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用作為載體，其原因是。

(3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶相比，大腸桿菌具有(答出兩點即可)等優點。

(4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質是(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。

(5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗為證明DNA是遺傳物質做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是。

【答案】(1)基因A有內含子，在大腸桿菌中，其初始轉錄產物中與內含子對應的RNA序列不能被切除，無法表達出蛋白A(2)噬菌體噬菌體的宿主是細菌，而不是家蠶(3)繁殖快、容易培養(4)蛋白A的抗體(5)DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體解析本題主要涉及基因文庫與cDNA文庫的差異、基因工程的步驟、基因工程產物的檢測方法等知識，意在考查考生提取知識、分析和歸納知識的能力。(1)真核生物和原核生物的基因結構不同，真核生物的基因中存在內含子等不能編碼蛋白質的序列，原核生物的基因中不存在內含子。真核生物在基因表達時，轉錄出的RNA需要將內含子對應的RNA序列切除后才可進行翻譯。從人的基因組文庫中獲得的基因A中含有內含子，而作為原核生物的大腸桿菌不能切除內含子對應的RNA序列，故基因A在大腸桿菌中無法表達出蛋白A。(2)病毒對宿主細胞的侵染具有特異性，噬菌體是專門侵染細菌的病毒，不能侵染家蠶細胞，故可選用可感染家蠶的昆蟲病毒作為載體。(3)與真核生物相比，大腸桿菌等原核生物具有繁殖快、容易培養、遺傳物質相對較少等優點，因此在基因工程中常用原核生物作為受體細胞。(4)檢測基因A是否翻譯出蛋白A，一般用抗原—抗體雜交的方法，即用蛋白A的抗體與從細胞中提取的蛋白質進行雜交，觀察是否出現雜交帶。(5)肺炎雙球菌轉化實驗的實質是S型菌的DNA進入R型菌體內，并可在R型菌體內完成表達，這證明了DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體，為基因工程奠定了理論基礎。(2017課標全國Ⅱ，38，15分)幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內，可增強其抗真菌病的能力。回答下列問題:(1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA，常選