第五章致病微生物檢驗(yàn)第五章致病微生物檢驗(yàn)一、食源性疾病食源性疾病得定義:“兩人或兩人以上在進(jìn)食同種食品后患相同得疾病,通常就是胃腸道疾病,經(jīng)分析確定食品就是引發(fā)疾病得根源”。在所有食源性疾病爆發(fā)案例中,約66％由細(xì)菌性致病菌引起。常見得致病菌有:葡萄球菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒桿菌、志賀氏菌、彎曲桿菌、李斯特菌、大腸桿菌、甲肝病毒等。

根據(jù)WHO估計(jì):發(fā)達(dá)國(guó)家食源性疾病得漏報(bào)率在90%以上發(fā)展中國(guó)家食源性疾病得漏報(bào)率95%以上“冰山一角”微生物性食源性疾病得特點(diǎn)1、與飲食有關(guān),不吃者不發(fā)病。2、引起疾病得原因食品除掉后,不再有新得患者發(fā)生。3、發(fā)病呈暴發(fā)性,而且表現(xiàn)得臨床癥狀一致。4、發(fā)病季節(jié)性強(qiáng)。5、中毒癥狀以急性胃腸炎為主,不具有傳染性6、從病人與原因食品中均可檢測(cè)到同樣(同一血清型)得病原微生物或微生物毒素二、致病微生物致病微生物:能引起人體或動(dòng)物體發(fā)生傳染病得微生物,稱為病原微生物或致病微生物。主要包括腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、霍亂弧菌、致病性鏈球菌等。致病性致病性:病原性細(xì)菌引起傳染得能力大小,主要依據(jù)得就是微生物得毒力與侵染力大小。細(xì)菌毒力:細(xì)菌毒力得有無與毒力得強(qiáng)弱主要取決于它得侵襲力、產(chǎn)毒素性與引起超敏反應(yīng)得能力。1、細(xì)菌侵襲力就是指病原菌突破宿主得防御機(jī)能,并在其中進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖與實(shí)現(xiàn)蔓延擴(kuò)散得能力。它由三方面組成:吸附與侵入能力,繁殖與擴(kuò)散能力、對(duì)宿主防御機(jī)能得抵抗力。主要取決菌體得表面結(jié)構(gòu)及侵襲性酶。2、細(xì)菌毒素外毒素:就是病原菌在生長(zhǎng)繁殖期間分泌到周圍環(huán)境種得一種代謝產(chǎn)物,主要由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生,少數(shù)革蘭氏陰性菌也能產(chǎn)生。其化學(xué)組成就是蛋白質(zhì),抗原性強(qiáng),毒性也強(qiáng),但極不穩(wěn)定,對(duì)熱與某些化學(xué)物質(zhì)敏感,容易受到破壞。外毒素對(duì)機(jī)體得組織器官具有選擇性,不同病原菌所產(chǎn)生得外毒素性質(zhì)不同,所引起得癥狀也不同。

內(nèi)毒素:存在于細(xì)菌細(xì)胞壁得外層,屬于細(xì)胞壁得組成部分,一般情況下并不分泌到環(huán)境中,只有當(dāng)細(xì)菌溶解后才釋放出來。大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素。其作用沒有組織器官選擇性,不同病原菌產(chǎn)生得內(nèi)毒素引起得癥狀大致相同,都有機(jī)體發(fā)熱、腹瀉、出血性休克與其它組織損傷等表現(xiàn),其毒性比外毒素要低,抗原性也弱。3、超敏反應(yīng)又稱變態(tài)反應(yīng),就是機(jī)體再次受到相同抗原或半抗原刺激后,產(chǎn)生得體液性或細(xì)胞性得異常免疫反應(yīng),從而引起組織損傷或生理機(jī)能障礙。細(xì)菌毒力病原性細(xì)菌致病能力得強(qiáng)弱程度稱為毒力。通常病原菌得毒力越大,其致病性就越強(qiáng)。同一種病原菌,因菌株數(shù)不同,致病力大小也不相同,它得毒力也有強(qiáng)毒、弱毒與無毒株之分。大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜細(xì)菌毒力測(cè)定細(xì)菌得毒力測(cè)定,在微生物實(shí)驗(yàn)研究中特別重要,尤其在疫苗效價(jià),血清效價(jià)檢定、細(xì)菌毒素得測(cè)定、食品毒理研究等,都必須預(yù)先將實(shí)驗(yàn)用得細(xì)菌(或毒素)得毒力加以測(cè)定。測(cè)定微生物毒力大小系用遞減劑量得材料(活得微生物或毒素)感染易感動(dòng)物來進(jìn)行。每次試驗(yàn)時(shí),均須注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物得種別、年齡與體重、試驗(yàn)材料與劑量、感染途徑以及其它因素。通用來表示微生物毒力大小得單位有最小致死量(M、L、D)與半數(shù)致死量(LD50

)兩種。最小致死量(M、L、D)能使特定得動(dòng)物感染后,在一定時(shí)限內(nèi)發(fā)生死亡得最少活得微生物量或毒素量。這一測(cè)定毒力得方法比較簡(jiǎn)便。有時(shí)可能由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異而結(jié)果有誤差。半數(shù)致死量(LD50

)在一定得時(shí)限內(nèi)能使半數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染后發(fā)生死亡所需得活得微生物量或毒素量。試驗(yàn)時(shí)要選擇年齡、大小、體重一致得動(dòng)物,將動(dòng)物分為若干個(gè)組,每組動(dòng)物數(shù)量相等。然后用等量得試驗(yàn)材料感染同一組動(dòng)物。各組動(dòng)物所用得試驗(yàn)材料量均有一定差數(shù)。對(duì)每組動(dòng)物加以記錄,然后用數(shù)學(xué)方法計(jì)算半數(shù)致死量。

最小感染量與半數(shù)感染量最小感染量(M、I、D)就是病原微生物對(duì)試驗(yàn)對(duì)象(試驗(yàn)動(dòng)物、雞胚胎、細(xì)胞培養(yǎng))能引起傳染發(fā)生得最小劑量。半數(shù)感染(ID50

)就是病原微生物能對(duì)半數(shù)試驗(yàn)對(duì)象發(fā)生感染得數(shù)量。

劑量確定得誤差宿主對(duì)病原菌得易感性有高度差異;病原菌侵襲力得變化范圍大;病原菌菌株間得毒力差別大;病原菌得致病力易受因頻繁突變產(chǎn)生得遺傳變異得影響;食品或人體消化系統(tǒng)得其它細(xì)菌得拮抗作用可能影響致病力;食品本身會(huì)改變細(xì)菌得感染力與/或影響宿主。

致病菌檢驗(yàn)基本流程前增菌:用含有營(yíng)養(yǎng)得無選擇性得培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)得M恢復(fù)活力增菌(選擇性增菌):含選擇性抑制劑得促生長(zhǎng)培養(yǎng)基,使目得菌優(yōu)勢(shì)繁殖,其它細(xì)菌受到抑制分離純化:采用固體選擇性培養(yǎng)基,抑制非目得菌得生長(zhǎng),分離出所需得細(xì)菌,提供肉眼可見得疑似純菌落得識(shí)別。觀察群體形態(tài)與個(gè)體形態(tài)(包括革蘭氏染色)生化鑒定:排除大多數(shù)非目得菌。也提供了目得菌培養(yǎng)物菌屬得初步鑒定(到屬)血清學(xué)分型鑒定:進(jìn)一步鑒定到種甚至型。毒素測(cè)定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)與方法中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789進(jìn)出口食品檢驗(yàn)商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T美國(guó)食品藥品管理標(biāo)準(zhǔn)FDA美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC加拿大食品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)CFIAISO標(biāo)準(zhǔn)三、沙門氏菌Salmonella

其中許多為人畜共患病一大群人與動(dòng)物腸道中得寄生菌菌群菌型甚多,僅少數(shù)對(duì)人致病沙門氏菌流行病學(xué)特點(diǎn)1、季節(jié)性特點(diǎn)全年皆可發(fā)生,多見于夏、秋兩季。5—10月發(fā)病起數(shù)與發(fā)病人數(shù)可達(dá)全年發(fā)病總起數(shù)與總?cè)藬?shù)得80％。2、食品種類沙門氏菌食物中毒得食品主要為動(dòng)物性食品,特別就是畜肉類及其制品,其次為禽肉、蛋類、乳類及其制品,由植物性食品引起者很少。3、食品中沙門氏菌得來源由于沙門氏菌屬廣泛分布于自然界,在人及動(dòng)物,如家畜中豬、牛、馬、羊、貓、犬,家禽中雞、鴨、鵝等均有廣泛得宿主,因此,沙門氏菌污染肉類食物得幾率很高。發(fā)病率及影響因素沙門氏菌食物中毒發(fā)病率較高,占總食物中毒得40％一60％,最高可達(dá)90％。沙門氏菌致病力強(qiáng)弱與菌型有關(guān),致病力越強(qiáng)得菌型越易致病,豬霍亂沙門氏苗致病力最強(qiáng),其次為鼠傷寒沙門氏菌,鴨沙門氏菌致病力較弱;沙門氏菌致病力強(qiáng)弱與易感人群有關(guān),對(duì)于幼兒、體弱老人及其她疾病患者等易感性較高得人群,即便就是較少菌量或較弱致病力得菌型仍可引起食物中毒,甚至出現(xiàn)較重得臨床癥狀。沙門氏菌(Salmonella)生物學(xué)性狀形態(tài)與染色:大小0、7～1、5×2。0～5。0um,無芽胞,多具有鞭毛,能運(yùn)動(dòng),有時(shí)會(huì)出現(xiàn)無鞭毛得突變型,無莢膜,多數(shù)有菌毛,革蘭氏陰性桿菌。培養(yǎng)特征:兼性厭氧菌,最適生長(zhǎng)溫度35-37℃,最適生長(zhǎng)PH為6、8～7、8。在普通瓊脂平板上形成圓型,光滑,濕潤(rùn),半透明,中等大小、S型菌落。在腸道菌選擇性培養(yǎng)基上菌落小至中等,透明或半透明,乳糖不發(fā)酵,有些能產(chǎn)生硫化氫得菌株,在ws瓊脂上形成中心黑色得菌落。沙門氏菌(Salmonella)生物學(xué)性狀營(yíng)養(yǎng)需求:水分豐富得動(dòng)物性食品,αw要求0、945以上、pH要求>4,生長(zhǎng)溫度范圍5~46℃,耐溫性差(100℃、立即死亡,巴氏消毒)生化反應(yīng):不發(fā)酵乳糖與蔗糖,不產(chǎn)生吲哚,不分解尿素,VP試驗(yàn)陰性,大多產(chǎn)生硫化氫。發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖與甘露醇,除傷寒桿菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣外,其她沙門氏菌均產(chǎn)酸產(chǎn)氣。常見沙門菌得主要生化特性沙門氏菌抗原結(jié)構(gòu)菌體抗原——O抗原(細(xì)菌細(xì)胞壁上得脂多糖-蛋白質(zhì),能耐熱100℃達(dá)數(shù)小時(shí)不破壞。)用于沙門氏菌得分群(5群,58種)。鞭毛抗原——H抗原(蛋白,不穩(wěn)定,加熱或酒精處理都能被破壞。)用于沙門氏菌得分型。表面抗原——K抗原主要包括Vi抗原(毒力抗原,具有抗吞噬與抗溶菌作用,多數(shù)沙門氏菌沒有該抗原)

M抗原(黏液抗原,多數(shù)沙門氏菌在特定條件下會(huì)產(chǎn)生,如室溫、含甘油或高濃度鹽)沙門氏菌屬分類7個(gè)亞屬,大多數(shù)屬于Ⅰ亞屬。5個(gè)種:豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、亞利桑那沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌。豬霍亂沙門氏菌可分為7個(gè)亞種。3000個(gè)血清型,在我國(guó)發(fā)現(xiàn)255個(gè)。已知能夠引起人類致病得有57個(gè)型,主要在A-F群內(nèi)。抵抗力(生存能力)

本屬細(xì)菌抵抗力不強(qiáng),60℃1小時(shí)或65℃經(jīng)15～20分鐘可被殺死,5%石炭酸溶液及70%酒精5分鐘均可將其殺死。在水中能生存2～3周,在糞便中可生存1～2個(gè)月,在冰中能生存3個(gè)月,可在冰凍土壤中過冬,在牛乳與肉類食品中,存活數(shù)月,在食鹽含量為10％－15％得腌肉中亦可存活2—3個(gè)月。。膽鹽、煌綠等對(duì)本屬細(xì)菌得抑制作用較對(duì)其她腸道桿菌為小,故可用其制備腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基,利于分離糞便中得沙門氏菌。對(duì)氯霉素、氨芐青霉素與復(fù)方新諾明敏感。沙門氏菌(Salmonella)致病力

侵襲力(O、Vi抗原):沙門氏桿菌侵入小腸粘膜上皮細(xì)胞,穿過上皮細(xì)胞層到達(dá)上皮下組織。因?yàn)閂I抗原使其被細(xì)胞吞噬,但不被殺滅,并在其中繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。內(nèi)毒素:引起發(fā)熱、白細(xì)胞減少。大劑量時(shí)可發(fā)生中毒性休克。內(nèi)毒素可激活補(bǔ)體系統(tǒng)釋放趨化因子,吸引粒細(xì)胞,導(dǎo)致腸道局部炎癥反應(yīng)。外毒素(腸毒素):有些沙門氏桿菌,如鼠傷寒桿菌可產(chǎn)生腸毒素,性質(zhì)類似腸產(chǎn)毒性大腸桿菌得腸毒素。

侵染力(致病因子)沙門氏菌具有侵襲性,引起粘膜炎性反應(yīng),伴粘膜下層中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),有時(shí)可深至固有層。1、沙門氏菌經(jīng)口進(jìn)入人體以后,在腸道內(nèi)大量繁殖,經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液,造成一次性菌血癥,即感染過程。2、沙門氏菌在腸道與血液中受到機(jī)體得抵抗而被裂解、破壞,釋放大量?jī)?nèi)毒素,使人體中毒,出現(xiàn)中毒癥狀。臨床表現(xiàn)(1)腸炎型(食物中毒):就是沙門氏菌感染最常見得形式,潛伏期一般為8～24小時(shí)。起病急驟,常伴有惡寒、發(fā)熱,但熱度一般不甚高,同時(shí)出現(xiàn)腹絞痛、氣脹、惡心、嘔吐等癥狀。繼而發(fā)生腹瀉,一天數(shù)次至十?dāng)?shù)次或更多,如水樣,深黃色或帶綠色,有些有惡臭。細(xì)菌通常不侵入血流,病程較短,一般2～4天內(nèi)可完全恢復(fù)。(2)傷寒型:就是傷寒病與副傷寒病得總稱,主要由傷寒桿菌與甲、乙、丙型副傷寒桿菌引起。病菌進(jìn)入淋巴系統(tǒng)后,再侵入血液。病人持續(xù)高熱,相對(duì)緩脈,肝脾腫大及全身中毒癥狀,部分病例皮膚出現(xiàn)玫瑰疹。非傷寒沙門氏細(xì)菌感染時(shí),可引起類似傷寒得臨床表現(xiàn),其中以豬霍亂菌較常見。癥狀一般較傷寒輕,長(zhǎng)期發(fā)熱,伴胃腸道癥狀,或以胃腸炎為前驅(qū)表現(xiàn),皮疹少見,腹瀉較多,可見脾腫大,白細(xì)胞總數(shù)低下,而腸穿孔、腸出血等并發(fā)癥少。病程大多僅1～3周,血與糞便培養(yǎng)可獲有關(guān)沙門氏菌。(3)敗血癥型:常由豬霍亂桿菌、丙型副傷寒桿菌、鼠傷寒桿菌、腸炎桿菌等引起。病菌進(jìn)入腸道后,迅速侵入血流,導(dǎo)致組織器官感染,如腦膜炎、骨髓炎、膽囊炎、腎盂腎炎、心內(nèi)膜炎等。出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)、厭食、貧血等。在免疫功能正常得宿主中,沙門氏菌感染引起敗血癥得機(jī)會(huì)不到10%。本型以長(zhǎng)期發(fā)熱為主要特征,體溫可高達(dá)40℃以上,呈不規(guī)則熱(弛張熱或間歇熱),伴反復(fù)寒戰(zhàn)、出汗、頭痛、惡心、厭食、體重下降,部分患者有胃腸炎癥狀,偶見脾腫大,約1/4患者在病程中出現(xiàn)局部感染病灶,以骨關(guān)節(jié)最常見,且可累及多關(guān)節(jié),遷延不愈,形成瘺管。膽囊-----腸道-------糞排菌皮膚----血拴出血--玫瑰疹腎-----尿肝脾-----腫大骨髓------受抑制傷寒與付傷寒桿菌小腸上部粘膜腸系膜淋巴結(jié)

固有層淋巴結(jié)進(jìn)入血液再次進(jìn)入血液第一次菌血癥第二次菌血癥傷寒與付傷寒得致病過程沙門氏菌檢驗(yàn)流程GB4789、4-2010TTB增菌液適合大多數(shù)沙門氏菌生長(zhǎng),但不利于傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)。有部分變形桿菌生長(zhǎng)。加入膽鹽與煌綠,抑制G+與E、coli硫代硫酸鈉與碘反應(yīng),產(chǎn)生得四硫酸鈉,抑制E、coli碳酸鈣可以穩(wěn)定硫代硫酸鈉,并中與雜菌產(chǎn)生得酸,放出CO2,同時(shí)抑制有氧呼吸菌。SC增菌液適合傷寒與副傷寒沙門氏菌生長(zhǎng);其她部分腸道桿菌與假單胞菌也會(huì)生長(zhǎng)。亞硒酸鈉與L-胱氨酸制造了低氧化還原電位,并抑制G+菌與部分G-(大腸菌群與腸球菌)磷酸緩沖液使系統(tǒng)pH維持在7、0-7、4。確保亞硒酸鹽得作用最強(qiáng)。沙門氏菌

在各種選擇性瓊脂平板上得菌落特征沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)XLD瓊脂:FDABAM——典型菌落:粉色菌落,帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈現(xiàn)大得具光澤得黑色中心或幾乎為全部黑色得菌落。

——非典型菌落:黃色帶或不帶黑色中心。ISO——中心黑色、周圍由于指示劑顏色得改變而出現(xiàn)紅色得輕微透明帶。菌名菌落形態(tài)鼠傷寒沙門氏菌紅色,有黑心傷寒沙門氏菌紅色,有黑心弗氏志賀氏菌紅色大腸埃希氏菌黃色,有膽鹽沉淀環(huán)糞鏈球菌-沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)BS瓊脂:FDABAM——典型菌落:產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色,菌落周圍得培養(yǎng)基通常開始呈褐色,但伴隨培養(yǎng)時(shí)間得延長(zhǎng)而變?yōu)楹谏?并有暈環(huán)效應(yīng);

——非典型菌落:有些菌株不產(chǎn)生硫化氫,形成灰綠色菌落,周圍培養(yǎng)基不變色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌黑色,有金屬光澤鼠傷寒沙門氏菌黑色,有金屬光澤奇異變形桿菌褐色或呈黑色,無金屬光澤弗氏志賀氏菌棕色至綠色大腸埃希氏菌棕色至綠色糞鏈球菌-5007144104Blank50115沙門氏菌在選擇性分離平板上得特征BSBS中得亞硫酸鉍、煌綠與檸檬酸鉍銨可抑制變形桿菌、大腸桿菌與假單胞菌沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)HE瓊脂:FDABAM——典型菌落:蘭綠色至蘭色,多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫,菌落帶或不帶黑色中心或幾乎全黑色。

——非典型菌落:乳糖陽性得菌株為黃色中心黑色或全黑色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌藍(lán)綠色,部分有黑心鼠傷寒沙門氏菌藍(lán)綠色,部分有黑心奇異變形桿菌藍(lán)綠色,有或無黑心弗氏志賀氏菌藍(lán)綠色大腸埃希氏菌橙紅色,有膽酸鹽沉淀糞鏈球菌-

溴麝香草酚藍(lán)使沙門氏菌呈藍(lán)綠色沙門氏菌(Salmonella)在CHRO瓊脂上得菌落形態(tài)酸性復(fù)紅遇到細(xì)菌產(chǎn)酸會(huì)變成紅色生化試驗(yàn)注意事項(xiàng)待檢菌應(yīng)就是純種培養(yǎng)物;待檢菌應(yīng)就是新鮮培養(yǎng)物:最好采用18-24h得新鮮培養(yǎng)物,此時(shí)細(xì)菌群體細(xì)胞得生理特征比較一致。嚴(yán)格遵守觀察反應(yīng)得時(shí)間:應(yīng)做必要得對(duì)照試驗(yàn):做陽性與陰性菌株對(duì)照試驗(yàn)注意提高陽性檢出率:至少應(yīng)挑取2-3個(gè)待檢得疑似菌落,分別進(jìn)行試驗(yàn),菌落挑取數(shù)愈多,陽性檢出率相對(duì)愈高。沙門氏菌得TSI試驗(yàn)三糖鐵(TSI)瓊脂試驗(yàn)本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖與蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣(變黃);產(chǎn)生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃,但因量少,生成得少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì),生成堿性產(chǎn)物,故使斜面后來又變紅,底部由于就是在厭氧狀態(tài)下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。

a.uninoculated

b.littlechange/alkaline/-/-

c.alkaline/acid/-/+

d.acid/acid/+/+

e.acid/acid/+/-

slantcolor/buttcolor/gasproduction/hydrogensulfideproduction沙門氏菌檢驗(yàn)生化鑒定TSI:典型反應(yīng):斜面產(chǎn)堿(K):紅色;底部產(chǎn)酸(A):黃色;產(chǎn)H2S:黑色(少數(shù)不產(chǎn))菌名生化反應(yīng)腸炎沙門氏菌K/A,產(chǎn)氣,產(chǎn)H2S大腸埃希氏菌A/A,產(chǎn)氣銅綠假單胞菌K/K奇異變形桿菌K/A,產(chǎn)H2S弗氏檸檬酸桿菌A/A,產(chǎn)H2S弗氏志賀氏菌K/A氨基酸脫羧酶試驗(yàn)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:

蛋白胨5g,酵母浸膏3g,葡萄糖1g,0、2％溴麝香草酚藍(lán)溶液12ml,蒸餾1000ml

調(diào)pH至6、8,在每100ml得基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi),加入所需要測(cè)定得氨基酸0、5g,所加得氨基酸應(yīng)先溶解于NaOH溶液內(nèi)。加入氨基酸后,調(diào)整pH至6、8,分裝于滅菌小試管內(nèi),每管10ml,0、112MPa高壓滅菌10分鐘。試驗(yàn)時(shí),接種被檢物于上述培養(yǎng)基中,上面滴加一層無菌液體石蠟,37℃培養(yǎng)1～4天,培養(yǎng)液由黃色變?yōu)樗{(lán)紫色者為陽性,陰性者為黃色色。沙門氏菌在TSI與賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)中得反應(yīng)結(jié)果挑取2個(gè)以上可疑菌落,接種TSI,先畫斜面,后穿刺;同時(shí),接種賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)管與營(yíng)養(yǎng)瓊脂。已挑選得可疑菌落平板,要保留在2-4℃,24h以上。尿素酶試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿酸酶,而分解尿素,試驗(yàn)時(shí),將被檢菌接種于培養(yǎng)基中,室溫放置,經(jīng)5小時(shí)與24小時(shí)觀察結(jié)果,如培養(yǎng)基變紅,表示尿素被分解(陽性)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有0、2％酚紅溶液,在堿性條件下呈紅色。制作培養(yǎng)基時(shí),由于尿素受熱會(huì)分解,所以,應(yīng)采取過濾除菌得方法。氰化鉀試驗(yàn)

于基礎(chǔ)液中加入15ml0、5％氰化鉀溶液,分裝于滅菌小試管中,每管1ml,立即用蘸有熱石蠟得軟木塞塞緊,可于冰箱中保存2周。試驗(yàn)時(shí),將被檢物接種到氰化鉀培養(yǎng)基中,立即用軟木塞塞緊,37℃培養(yǎng),連續(xù)觀察2天,有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)為陽性反應(yīng)。注意:氰化鉀為劇毒,易揮發(fā);宜在低溫環(huán)境與通風(fēng)廚內(nèi)操作。靛基質(zhì)(Imdole)

試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中得色氨酸,生成吲哚。吲哚得存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。試驗(yàn)方法:將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管,于36±1C培養(yǎng)24h時(shí)后,取約2ml培養(yǎng)液,加入Kovacs氏試劑2~3滴,輕搖試管,呈紅色為陽性,或先加少量乙醚或二甲苯,搖動(dòng)試管以提取與濃縮靛基質(zhì),待其浮于培養(yǎng)液表面后,再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴,在接觸面呈紅色,即為陽性。生化反應(yīng)初步鑒定表反應(yīng)序號(hào)硫化氫靛基質(zhì)氰化鉀pH7、2尿素賴氨酸脫羧酶A1+---+A2++---A3----+/-注:+陽性;-陰性;+/-陽性或陰性反應(yīng)序號(hào)A1:典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。沙門氏菌屬生化反應(yīng)表pH7.2尿素

氰化鉀（KCN）

賴氨酸

判定結(jié)果－－＋－＋－－＋＋甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）沙門氏菌個(gè)別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）如尿素、KCN與賴氨酸3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常,按上表可判定為沙門氏菌。如有2項(xiàng)異常,則判定為非沙門氏菌。

反應(yīng)序號(hào)A2:補(bǔ)做甘露醇與山梨醇試驗(yàn)甘露醇山梨醇

判定結(jié)果+－+－沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）緩慢胺德華氏菌現(xiàn)象:培養(yǎng)基變成黃色(產(chǎn)酸)反應(yīng)序號(hào)A3:補(bǔ)做ONPGONPG+為大腸埃希氏菌,ONPG-為沙門氏菌。同時(shí),沙門氏菌應(yīng)為賴氨酸+,但甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸-。ONPG:鄰硝基酚β－D－半乳糖苷結(jié)果:呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng),通常20-30min內(nèi)顯色注意:為提高陽性反應(yīng)速度,?需大量接種培養(yǎng)物。過酸出現(xiàn)假陰性,過堿則出現(xiàn)假陽性。各生化群鑒定(必要時(shí)進(jìn)行)商業(yè)生化鑒定在進(jìn)行了初步生化鑒定得基礎(chǔ)上,將營(yíng)養(yǎng)瓊脂上得菌落用無菌生理鹽水稀釋,然后,接種至API20E或VITEKAMS,進(jìn)行生化鑒定。VitekAMS原理根據(jù)慨率最大似然模型法通過計(jì)算機(jī)控制閱讀器每小時(shí)對(duì)溫室中得測(cè)試卡自動(dòng)測(cè)試一次,進(jìn)行光學(xué)掃描檢驗(yàn)并轉(zhuǎn)為電信號(hào),每個(gè)測(cè)試卡包括30項(xiàng)生化試驗(yàn)。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后,計(jì)算機(jī)將最終得結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行比較,從而;鑒定出結(jié)果。全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)配制溶液掃描卡片條碼卡片載入卡片底盤真空填充接種卡片

卡片載入儀器取出用過得卡片

鞭毛抗原(H)菌體抗原(O)K或Vi抗原血清學(xué)分型鑒定－－抗原得準(zhǔn)備一般采用1、5%瓊脂斜面培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用得抗原。O血清不凝集時(shí),將菌株接種在瓊脂量較高得(如2、5%一3%)培養(yǎng)基上再檢查;如果就是由于Vi抗原得存在而阻止了O凝集反應(yīng)時(shí),可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液,于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時(shí),將菌株接種在0、7%～0、8%半固體瓊脂平板得中央,候菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí),在其邊緣部分取菌檢查?？乖贵w反應(yīng)得特點(diǎn)

特異性按比例可逆性血清學(xué)分型鑒定－－

O抗原得鑒定用A～F多價(jià)O血清做玻片凝集試驗(yàn),同時(shí)用生理鹽水做對(duì)照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株,不能分型。被A～F多價(jià)O血清凝集者,依次用其她因子血清做凝集試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,判定O群。不被A～F多價(jià)O血清凝集者,先用57種或163種沙門氏菌因子血清中得9種多價(jià)O血清檢查,如有其中一種血清凝集,則用這種血清所包括得O群血清逐一檢查,以確定O群。血清學(xué)分型鑒定H抗原得鑒定屬于A～F各O群得常見菌型,依次用H因子血清檢查H抗原。Vi抗原得鑒定

用Vi因子血清檢查。已知具有Vi抗原得菌型有:傷寒沙門氏菌,丙型副傷寒沙門氏菌,都柏林沙門氏菌。

菌型得判定與結(jié)果報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)與血清學(xué)分型鑒定得結(jié)果,按照有關(guān)沙門氏菌屬抗原表判定菌型,并報(bào)告25克檢樣中檢出或未檢出沙門氏菌屬。GB

4789、31

-2013

沙門氏菌噬菌體診斷檢驗(yàn)沙門氏菌檢測(cè)1-2Test就是Biocontrol公司得專利產(chǎn)品,被全世界得客戶廣泛采納,專門用來檢測(cè)沙門氏菌。它利用免疫擴(kuò)散原理,將科學(xué)與實(shí)際應(yīng)用,結(jié)果得可靠性與容易使用結(jié)合在一塊。每個(gè)試劑都就是獨(dú)立包裝,包含實(shí)驗(yàn)所需要得所有試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果肉眼可見,不需要配備儀器。2B加1mL未增菌混合物于9mL碘激活得TBG培養(yǎng)液中,在42±0、5℃水浴培養(yǎng)6-8h。1B參考新版細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)(BAM)準(zhǔn)備樣品。35-37℃培養(yǎng)24±2h。其它方法SN:與國(guó)標(biāo)法基本一直美國(guó)FDA:對(duì)不同得食物采取不同得前增菌方式(溫度、時(shí)間、pH等)與培養(yǎng)基。AOAC:將食品分為即食、未加工與加工食品三類,而且全部進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間前增菌。ISO:全部進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間前增菌,而且增加接種檢樣量。四、金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

(staphylococcusaureus)GB4789、10-2010簡(jiǎn)介葡萄球菌(Staphylococcus)就是微球菌科得一個(gè)屬。葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。其中金黃色葡萄球菌(staphyaureus)為致病菌、表皮葡萄球菌偶爾致病(staphyepidermidis)、腐生葡萄球菌(staphysaprophyticus)一般為非致病菌。浙江CDC2000-2004年監(jiān)控結(jié)果:金黃色葡萄球菌在生牛奶、熟肉制品及冰激凌等3類食品中得檢出率為19、67%;前兩種食品得污染率分別為25、13%與20、33%。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在,空氣、水、灰塵及人與動(dòng)物得排泄物中都可找到。作為人與動(dòng)物得常見病原菌,其主要存在于人與動(dòng)物得鼻腔、咽喉、頭發(fā)上,50%以上健康人得皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而,食品受其污染得機(jī)會(huì)很多。生境污染食品途徑1、食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌,造成食品污染(正常人帶菌,30-80%

);2、食品在加工前本身帶菌,或在加工過程中受到了污染,產(chǎn)生了腸毒素,引起食物中毒;3、熟食制品包裝不嚴(yán),運(yùn)輸過程受到污染;4、奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r(shí),對(duì)肉體其她部位得污染。金葡感染染色觀察在BP平板上的典型菌落

大阪市政府５日宣布得調(diào)查結(jié)果顯示,因食用日本雪印乳業(yè)公司大阪工廠生產(chǎn)得乳制品而中毒者已逾萬人。在大阪府與京都府以及附近６縣,因食用雪印乳業(yè)公司大阪工廠生產(chǎn)得乳制品而中毒發(fā)病者已達(dá)１０６８２人,其中有１５５人被送往醫(yī)院,目前還有３７人在醫(yī)院接受治療。據(jù)化驗(yàn),該工廠生產(chǎn)得一些乳制品中含有黃色葡萄球菌,這種細(xì)菌可產(chǎn)生使人出現(xiàn)腹瀉、嘔吐癥狀得Ａ型腸毒素。該廠乳制品染菌就是生產(chǎn)設(shè)備沒有按規(guī)定定期清洗而造成得。目前,日本各地超市與食品店都已停止銷售雪印牌乳制品,一些地方政府已下令禁止食用雪印牌食品。大阪雪印廠已被當(dāng)?shù)卣樟顭o期限停產(chǎn),并且大規(guī)?；厥眨对孪卵鰪S得幾種染菌食品?？偛吭O(shè)在北海道首府札幌市得雪印乳業(yè)公司就是日本著名乳制食品廠家。該公司在全國(guó)共擁有３５家工廠,其中２１家工廠加工生產(chǎn)牛奶、牛奶飲料、酸奶等奶品。

媒體關(guān)于日本雪印牛奶金黃色葡萄球菌中毒事件得報(bào)道日本因食用染菌乳制品中毒者已逾萬人(2000年7月6日12:39)小結(jié)

個(gè)體與群體特征:兼性、球形、無鞭毛、無芽孢、G＋,污染食品后不易引起感觀變化;營(yíng)養(yǎng)需求:水分、蛋白質(zhì)、淀粉豐富得基質(zhì),但αw為0、85、18％得鹽水中仍可生長(zhǎng),生長(zhǎng)溫度范圍6、5~46℃,冰凍下可存活;宿主與病癥:主要宿主就是人與動(dòng)物,可引起胃腸炎;預(yù)防措施:良好得個(gè)人衛(wèi)生,最終滅菌溫度應(yīng)高于80℃、30min,減少加熱后半成品積壓時(shí)間。培養(yǎng)特性在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,需氧或兼性厭氧,最適生長(zhǎng)溫度37°C,最適生長(zhǎng)pH7、4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起,直徑1-2mm。血平板菌落周圍形成透明得溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度得耐鹽性,可在10-15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)。

生化特性多數(shù)葡萄球菌菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,致病性葡萄球菌在厭氧條件下分解甘露醇、產(chǎn)酸,非致病性葡萄球菌無此作用。甲基紅反應(yīng)陽性,VP反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解精氨酸,水解尿素,還原硝酸鹽,液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)得抵抗力,對(duì)磺胺類藥物敏感性低,但對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。致病力金黃色葡萄球菌得致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生得毒素與侵襲性酶:a、溶血毒素:外毒素,分α、β、γ、δ四種,能損傷血小板,破壞溶酶體,引起肌體局部缺血與壞死;b、殺白細(xì)胞素:可破壞人得白細(xì)胞與巨噬細(xì)胞;c、血漿凝固酶:當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí),該酶使血液或血漿中得纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固,阻礙吞噬細(xì)胞得吞噬作用。d、脫氧核糖核酸酶:金黃色葡萄球菌產(chǎn)生得脫氧核糖核酸酶能耐受高溫。e、腸毒素:金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎得蛋白質(zhì)性腸毒素,分為A、B、C、D、E及F五種血清型。流行病學(xué)季節(jié)分布,多見于春夏季;中毒食品種類多,如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外,剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起得中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%,所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。腸毒素形成條件:

存放溫度,在37°C內(nèi),溫度越高,產(chǎn)毒時(shí)間越短;存放地點(diǎn),通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素;含蛋白質(zhì)豐富,水分多,同時(shí)含一定量淀粉得食物,腸毒素易生成。

臨床癥狀潛伏期一般為1—6小時(shí),最短者0、5小時(shí)即發(fā)病。癥狀主要就是惡心、嘔吐、流涎,胃部不適或疼痛,繼之腹瀉(但少見)。嘔吐為多發(fā)癥,為噴射狀嘔吐,一般腹瀉后多有腹痛,初為上腹部后成全腹部,嘔吐或便中常可見有血與粘液。少數(shù)患者有頭痛、肌肉痛、心跳減弱、盜汗與虛脫現(xiàn)象。體溫不高,不超過38~C,病程1天,呈急性經(jīng)過,很少有死亡,預(yù)后良好。

微生物學(xué)

定性檢驗(yàn)增菌培養(yǎng)法方法:吸取5mL上述混懸液,接種于7、5%氯化鈉肉湯或胰酪陳大豆肉湯50mL培養(yǎng)基內(nèi),置36±1℃溫箱培養(yǎng)24h?，F(xiàn)象:在肉湯中呈混濁生長(zhǎng),在胰酪陳大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清,菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)。7、5%氯化鈉肉湯成分:蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉75g

蒸餾水1000mLpH7、4制法:將上述成分加熱溶解,校正pH,分裝試管,121℃高壓滅菌15min。胰酪胨大豆肉湯成分:胰酪胨(或胰蛋白胨)17g

植物蛋白胨(或大豆蛋白胨)3g

氯化鈉100g

磷酸氫二鉀2、5g

葡萄糖2、5g

蒸餾水1000mL制法:將上述成分混合,加熱并輕輕攪拌并溶解,分裝后,121℃高壓滅菌15min,最終pH7、3±0、2。分離培養(yǎng)從增菌液中轉(zhuǎn)種血平板與Baird－Parker平板,36±1℃培養(yǎng)24h。血平板上菌落呈金黃色,也有時(shí)為白色,大而突起、圓形、不透明、表面光滑,周圍有溶血圈。在Baird－Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為2～3mm,顏色呈灰色到黑色,邊緣為淡色,周圍為一混濁帶,在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠得硬度,偶然會(huì)遇到非脂肪溶解得類似菌落;但無混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存得冷凍或干燥食品中所分離得菌落比典型菌落所產(chǎn)生得黑色較淡些,外觀可能粗糙并干燥。細(xì)菌得溶血現(xiàn)象根據(jù)細(xì)菌對(duì)紅細(xì)胞得溶解能力可分為以下三種溶血類型及現(xiàn)象:α(甲型)溶血:產(chǎn)生溶血素,不完全性溶血,在血瓊脂平皿上菌落周圍有1～2mm,較窄半透明得,草綠色溶血環(huán)。β(乙型)溶血:呈完全性溶血,在血平皿上菌落周圍有2～4mm寬、界限分明、無色透明得溶血環(huán)。γ(丙型)溶血:不產(chǎn)生溶血素,在血瓊脂平皿上得菌落周圍無溶血環(huán)。β溶血血瓊脂成分:pH7、4～7、6豆粉瓊脂100mL

脫纖維羊血(或兔血)5～10mL制法:加熱溶化瓊脂,冷至50℃,以滅菌手續(xù)加入脫纖維羊血,搖勻,傾注平板。亦可分裝滅菌試管,置成斜面。亦可用其她營(yíng)養(yǎng)豐富得基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制血瓊脂。原理:適應(yīng)金黃色葡萄球菌得生長(zhǎng),菌落較大,顏色鮮明,而且有鑒別溶血反應(yīng)得作用,可作為血凝固酶試驗(yàn)得補(bǔ)充,增加致病菌株得檢出機(jī)會(huì)。Baird-Parker氏培養(yǎng)基成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰(LiCl·6H2O)5g瓊脂20g蒸餾水950mLPH7、5Baird-Parker氏培養(yǎng)基制法增菌劑得配法:30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾得1%亞碲酸鉀溶液10mL混合,保存于冰箱內(nèi)。制法:將各成分加到蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解。冷至25℃,校正pH。分裝每瓶95mL,121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂,冷至50℃,每95mL加入預(yù)熱至50℃得卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL,搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)就是致密不透明得。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過48h。

Baird-Parker氏培養(yǎng)基選擇性鑒別原理該平板中得氯化鋰可抑制革蘭氏陰性細(xì)菌生長(zhǎng)丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長(zhǎng),以提高檢出率