基因工程概論第一章、基因工程的基本概念第二章、基因工程的基本原理第三章、基因工程所需要的基本條件第四章、基因工程操作過程第五章、目的基因克隆戰略第六章、動植物基因工程簡介第一章基因工程的概念1、重組DNA技術的基本定義重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。2、基因工程的基本定義基因工程是指重組DNA技術的產業化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是基因重組、克隆和表達的設計與構建（即重組DNA技術）；而下游技術則涉及到基因工程菌或細胞的大規模培養以及基因產物的分離純化過程。第一章基因工程的概念3、重組DNA技術與基因工程的基本用途（1）分離、擴增、鑒定、研究、整理生物信息資源（2）產生物活性物質大規模生產生物活性物質（3）設計、構建生物的新性狀甚至新物種第一章基因工程的概念大規模生產生物活性物質第一章基因工程的概念基因工程的特點1）不受親緣關系限制；2）可以定向改變生物的遺傳特征；3）增加目的基因的劑量。第一章基因工程的概念第一章基因工程的概念第二章基因工程的基本原理基因工程技術的基礎理論19世紀中孟德爾豌豆雜交試驗遺傳因子經典遺傳學20世紀摩爾根果蠅雜交實驗基因基因學1944年艾弗瑞肺炎雙球菌轉化實驗遺傳物質是DNA分子遺傳學－解決了遺傳的物質基礎問題1953年，沃森－克瑞克DNA的雙螺旋結構和半保留復制分子生物學－解決了遺傳機制問題60年代確定了中心法則---解決了遺傳信息的傳遞問題70年代發現了工具酶1973年伯格－杰克森－考恩－鮑耶完成了DNA的體外拼接誕生了基因工程技術80年代生物技術產業形成第二章基因工程的基本原理基因的分子生物學基礎第二章基因工程的基本原理基因工程的基本原理（1）提高外源基因的劑量——分子遺傳學原理（2）篩選修飾重組基因表達的轉錄調控元件，如：啟動子、增強子、操作子、終止子、上游調控序列等——分子生物學原理（3）修飾構建蛋白質生物合成的翻譯調控元件，如：SD序列、mRNA非編碼區、密碼子等——分子生物學原理（4）基因工程菌（微型生物反應器）的增殖及穩定生產——生化工程學原理第二章基因工程的基本原理基因工程的支撐技術（1）核酸凝膠電泳技術（2）核酸分子雜交技術（3）細菌轉化轉染技術（4）DNA序列分析技術（5）寡核苷酸合成技術（6）基因定點突變技術（7）聚合酶鏈反應（PCR）技術第二章基因工程的基本原理第三章基因工程所需的基本條件A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的載體C用于基因轉移的受體菌或細胞第三章基因工程所需的基本條件限制性內切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細胞的破壁、轉化、核酸純化、檢測等。工具酶及其應用第三章基因工程所需的基本條件限制性核酸內切酶1、限制性核酸內切酶的發現及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵。1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII。2、限制性核酸內切酶的命名A工具酶第三章基因工程所需的基本條件3、限制性核酸內切酶的類型A工具酶第三章基因工程所需的基本條件4、II型限制性核酸內切酶適合用于基因操作，其基本特性：識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列識大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構。A工具酶第三章基因工程所需的基本條件nicknickA工具酶第三章基因工程所需的基本條件nicknickA工具酶第三章基因工程所需的基本條件A工具酶第三章基因工程所需的基本條件DNA連接酶DNA連接酶的基本性質：（1）修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵A工具酶第三章基因工程所需的基本條件（2）修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵A工具酶第三章基因工程所需的基本條件（3）連接多個平頭雙鏈DNA分子A工具酶第三章基因工程所需的基本條件DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶I基本性質：（1）5’→3’的DNA聚合酶活性（2）5’→3’的核酸外切酶活性（3）3’→5’的核酸外切酶活性用途：制備32P標記的探針。A工具酶第三章基因工程所需的基本條件2、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

基本性質：大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。基本用途：補平由核酸內切酶產生的5’粘性末端。A工具酶第三章基因工程所需的基本條件3、依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）反轉錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈A工具酶第三章基因工程所需的基本條件核酸酶1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）2、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘端外切A工具酶第三章基因工程所需的基本條件3、雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）特異性地從5‘端外切4、單鏈核酸內切酶：S1核酸酶：內切單鏈DNA或RNAA工具酶第三章基因工程所需的基本條件其中又以Ti質粒轉化載體最為重要。漂洗后將非特異結合的探針去掉。20世紀摩爾根果蠅雜交實驗基因基因學1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）平末端DNA片段加接頭值得警惕的是受傷的植物組織有時能產生冠癭堿，所以可以檢測到該化合物，即所謂本底。cDNA文庫的構建過程因此作對照樣的分析是重要的。目前常用的人造染色體載體包括：它是由中間表達載體和卸甲載體構建而成。－解決了遺傳機制問題2）Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）第二節重組載體的構建及細菌轉化2、限制性核酸內切酶的命名用酚、酚/氯仿/異戊醇處理去除上2、目的基因與載體的連接第五章基因克隆的策略核酸修飾酶1、末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT）：不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPsA工具酶第三章基因工程所需的基本條件（不論是選擇標記基因還是篩選標記基因，后者亦稱報告基因）都必須具備以下四個條件：①編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶；大腸桿菌作為寄主進行DNA克隆的實驗方案3’AAAAAAAA②基因較小，可構成嵌合基因；第二章基因工程的基本原理它是由中間表達載體和卸甲載體構建而成。第四章重組DNA技術的操作過程因此作對照樣的分析是重要的。第三章基因工程所需的基本條件Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。將上述菌液在冰浴5分鐘,然后在4℃,4000rpm離心10分鐘;（2）修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵用于基因工程的載體第三章基因工程所需的基本條件載體的功能及特征1、載體的功能（1）運送外源基因高效轉入受體細胞（2）為外源基因提供復制能力或整合能力（3）為外源基因的擴增或表達提供必要的條件2、載體應具備的條件（1）具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）（2）具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點（3）具有較高的外源DNA的載裝能力（4）具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點（5）具有合適的篩選標記B載體第三章基因工程所需的基本條件質粒B載體第三章基因工程所需的基本條件人造染色體DNA載體人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數百甚至上千kb的DNA片段，此時考斯質粒和噬菌體載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區、分配區、穩定區與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩定的復制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細菌人造染色體（BAC）；酵母人造染色體（YAC）。B載體第三章基因工程所需的基本條件細菌人造染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質粒的基礎上構建的，其裝載量范圍在50-300kb之間。主要適用于克隆大型基因簇（genecluster）結構和構建動植物基因文庫。酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）B載體第三章基因工程所需的基本條件B載體P1噬菌體載體構建基因組文庫的示意圖pAd10sacBⅡScaI+BamHI長臂+短臂加入外源DNA片段重組DNA分子離體包裝感染宿主細胞第三章基因工程所需的基本條件B載體植物克隆載體

第三章基因工程所需的基本條件第三章基因工程所需的基本條件基因工程的基本步驟基因分離酶切載體酶切基因和載體連接導入細菌重組質粒繁殖重組克隆的選擇序列分析和基因表達等研究導入植物細胞第四章重組DNA技術的操作過程第五章基因克隆的策略引言第一節目的基因的獲得第二節重組體的構建及細菌轉化第三節重組克隆的篩選和鑒定引言基因克隆的本質是把某一目標DNA片段通過無性的方式進行擴增和表達，而這一過程往往是通過載體和寄主細胞來實現的。一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目標DNA片段的獲得；2、克隆載體的構建；3、寄主細胞的轉化；4、重組體克隆的選擇和鑒定。

目前，以大腸桿菌為寄主，以質粒和噬菌體等為載體的基因克隆體系已經相當的成熟，本章將以這種克隆模式為主體對基因克隆的策略展開討論和分析。大腸桿菌作為寄主進行DNA克隆的實驗方案DNA片段的獲得載體構建細菌轉化重組體的鑒定限制性內切酶消化機械切割雙鏈cDNA的合成化學法直接合成同聚物加尾粘性末端連接平末端連接加接頭造成粘性末端重組噬菌體DNA轉染重組質粒的轉化體外包裝進行轉導表型鑒定核酸雜交免疫學分析酶切鑒定第一節目的DNA片段的獲得1、化學法直接合成基因2、從基因組文庫中釣取目的基因3、從cDNA文庫中釣取目的基因4、通過PCR直接擴增出目的基因1、化學法直接合成基因所謂基因就是具有特定生物學功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子結構，完全可以在實驗室進行人工合成。1977年，K.Itakura利用化學途徑首次合成了編碼腦激素的基因（生長激素釋放因子基因），并在大腸桿菌中實現了成功的表達。從此，化學合成基因得到了很大的發展迅速。早期通過化學合成的部分基因基因人胰島素轉運RNA-干擾素腸促胰液肽尿抑胃激素-干擾素大小（bp）12654281162453合成年代197819791981198219821984基因視紫紅質前腦菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶Ａ大小（bp）105777170385324375合成年代1985198519851985198619872、從基因組文庫中釣取基因文庫（genelibrary）是指匯集了某一生物基因組DNA全部序列的重組體DNA群體（轉化子群）。基因組文庫的大小（即應該包含多少個獨立的克隆）與基因組本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有關。基因組的大小（bp）2×106（細菌）

2×107（真菌）

3×109（動物）

理論數實際數理論數實際數理論數實際數克隆片段的平均大小（bp）5×10340018314000184186000002763110910×10320091920009208300000138155020×1031004581000460315000069077440×103502785002300750003543862、從基因組文庫中釣取因為基因組DNA片段是隨即克隆的，所以基因組大小除以克隆片段大小得到的只是克隆數的理論值，從統計學的角度分析，從這個理論克隆數中克隆到特定基因片段的幾率只有50%。當克隆數增加到這一理論值的2倍時，克隆到特定DNA片段的幾率就上升到75%。所以為了達到一種合理的幾率以克隆到目的基因，一個完整的基因組文庫就必須含有3-10倍于最低重組克隆數的克隆。1975年，L.Clarke和J.Carbon提出了一個計算完全基因組文庫所需實際克隆數的公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)。其中，N代表實際克隆數；p代表在重組群體中出現特定基因的幾率（一般的期望值都為99%）；f代表限制性片段的平均大小與相應生物體基因組大小的比值。2、從基因組文庫中釣取目的基因1981年Ish-Horowics和Burke設計的特殊的基因組克隆方案，選用MboI或Sau3A進行基因組DNA的酶切。不僅是因為它們是4堿基識別位點的酶，而且它們和BamHI是同尾酶。cosHindIIIBamHISalISalIHindIII磷酸化酶SalIBamHIBamHIHindIIIBamHIBamHISalIHindIIISau3A磷酸化酶32-47kb3、從cDNA文庫中釣取目的基因從真核生物基因組文庫中直接分離到目的基因十分困難，這主要是因為：真核生物的基因組太大，而其中非編碼區占的比例很大；另外，真核基因大都有很大的內含子，很難從基因組文庫中直接分離到目的基因。

克隆真核生物的基因往往是從cDNA文庫的建立開始的。主要步驟包括：總RNA的提取和純化；cDNA的合成；cDNA文庫的構建。A.文庫的構建5’TTTTTTTTTDNA聚合酶I3、從cDNA文庫中釣取目的基因3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA多聚T引物反轉錄酶AAAAAAAATTTTTTTTT堿降解RNAS1核酸酶加接頭插入載體并導入寄主細胞重組克隆cDNA文庫的構建過程A.文庫的構建A.文庫的構建

構建好文庫后就需要從眾多的克隆中篩選出含有目的DNA片段的克隆,這時一般要用到菌落原位雜交技術.如果兩條同原性很高的DNA序列解鏈后混合,當條件恢復時來源于不同的DNA的單鏈間可以通過堿基互補而發生緊密結合（雜交）。所以我們可以將某種已知的DNA序列制備成探針（Probe），即將DNA序列用同位素或地高辛標記，這樣就可以同過探針的雜交來篩選出含有特定DNA序列的克隆。用同位素標記后可以通過X-光片的感光來探測到有雜交信號的克隆，用地高辛標記后可以通過結合在抗地高辛抗體上的堿性磷酸酶與顯色底物的反應直接觀察到發生了雜交的克隆（對應位置顯為紫色）。B.克隆的篩選B.克隆的篩選將克隆轉移到一張硝酸纖維素膜或是尼龍膜上。用堿處理使的細胞中的DNA釋放出來并且發生解鏈。然后通過烘烤或紫外線照射將DNA固定在膜上。

菌落原位雜交的基本流程是：B.克隆的篩選將轉好的膜在含有探針的雜交液中雜交，使得探針與目標DNA緊密結合。漂洗后將非特異結合的探針去掉。探針為地高辛標記時，可以通過抗體和地高辛的二次雜交和顯色反應在含有特定DNA片段的克隆對應位置出現紫色印記。如果探針為同位素標記時，可以通過放射自顯影使得X-光片感光而在相應位置出現感光信號。C.目標DNA片段的獲得一般來說將篩選到的克隆提取其中質粒DNA，通過酶切就可以獲得所要的目標DNA片段。但是，有時克隆到的片段還是比較大，為了進一步獲得更精確的DNA片段，我們還要進一步的DNA雜交。比如，我們可以將克隆到的DNA片段用某一種或幾中限制性內切酶消化，再通過電泳將不同分子的DNA分開，然后通過毛細管法將DNA從凝膠中轉移到尼龍膜上，最后用探針雜交以確定含有特定片段的目的DNA片段。4、通過PCR直接擴增出目的基因如果已經知道了某一基因家族中某一成員的序列，則可以根據該家族基因的保守序列設計特異性引物直接從該生物基因組DNA中擴增獲得該基因的特定區域，甚至是全基因。如果該基因很大是，可以分段進行克隆，然后再將獲得的片段連接起來，最終得到目的基因的全序列。第二節重組體的構建及細菌轉化1、載體的選擇和分離2、目的基因與載體的連接3、重組體向寄主細胞的導入質粒DNA的分離方法很多，但其中共同的步驟是：用溶菌酶處理含有載體的寄主細胞培養物，以破壞細胞壁；加入SDS（sodiumdodecylsulfate,十二烷基硫酸鈉）之類的去污劑使寄主細胞發生溫和的溶菌作用。這時，細胞內的環狀質粒DNA、多聚核糖體、可溶性蛋白質等生物大分子放出來，而核染色體仍然附著在細胞的碎片上。通過離心將細胞碎片及附著于其上的染色體DNA等物質去除，這時質粒DNA分布在上清液中。e.用酚、酚/氯仿/異戊醇處理去除上清液中的蛋白質，最終獲得質粒。1、載體的選擇和分離互補粘性末端分子間的連接用同一可產生粘性末端的限制性內切酶去切割外源DNA分子和載體時，所產生的粘末端DNA分子間很容易進行連接。當然，通過同尾酶切割后的DNA片段也具有這種特性。除了盡量選用粘性末端連接外，構建載體還應注意：實驗步驟要盡量簡單易行，并設法提高連接的效率（如防止載體的自連）；連接到載體上的外源片段應該能重新切割下來，以便于回收克隆的DNA片段。如果是要求實現基因表達的序列，還要注意轉錄和翻譯的密碼子結構的正確性。要注意插入片段的方向性。2、目的基因與載體的連接載體自連或產生二具體等2、目的基因與載體的連接POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH連接酶連接酶連接酶堿性磷酸酶2Pi寄主修復缺口載體自連或產生二具體等載體去磷防止連接反應中的載體自連外源DNA片段的定向插入當兩個末端具有相同得粘性末端的DNA分子或是平末端的DNA分子插入到載體中時，會出現正向和反向插入兩種情況。一方面，我們可以通過對重組質粒的酶切鑒定來選擇正向插入的克隆或反向插入的克隆；另一方面，通過選用兩種合適的限制性內切酶分別對載體和外源DNA進行切割也可以實現外源DNA分子的定向插入。2、目的基因與載體的連接HindIIIBamHIHindIIIBamHIHindIIIBamHI平末端DNA片段加接頭在實際操作中，往往會出現找不到合適酶切位點，或是所產生的外源DNA只能是平末端的情況，這時就需要對平末端的DNA分子進行連接。對于這種連接實驗，我們可以采用加接頭法，也可以采用末端轉移酶加尾法，當然用平末端直接連接也是可以的，只是連接效率要低得多。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA2、目的基因與載體的連接3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶平末端DNA片段末端加尾法連接2、目的基因與載體的連接3、重組載體向寄主細胞的導入

重組DNA分子構建好后必須轉移到適當的受體細胞中才能得到擴增和表達。將普通的質粒分子導入受體細胞的過程稱為轉化（tranformation）;將具有感染能力的噬菌體DNA分子導入受體細胞的過程稱為轉染（transfection）；而噬菌體主動將其DNA注入受體細胞得過程稱為感染（infection）.1970年，Mandel和Higa等發現，用CaCl2溶液處理過的大腸桿菌細胞比較容易獲得噬菌體的DNA；1972年，Cohen等也發現用CaCl2溶液處理過的大腸桿菌能被環狀的質粒DNA分子所轉化。這種經過處理能夠接受外源DNA的細胞成為感受態細胞（copetentcell）.3、重組體向寄主細胞的導入大腸桿菌感受態細胞的制備在不含抗生素的LB平板上涂布大腸桿菌DH5α，于37℃培養過夜(16-20h)；挑一個單菌落接種于25mL無菌的LB培養液中，37℃中速震蕩培養3h；將上述菌液在冰浴5分鐘,然后在4℃,4000rpm離心10分鐘;將細菌沉淀用5mL預冷的CaCl2（0.1M）重懸，冰浴一會后于4℃4000rpm離心10分鐘；將細菌沉淀用1mL預冷的CaCl2（0.1M）重懸，取200uL用于細菌轉化,其余菌液加入20%的無菌甘油,搖勻后于-20℃保存備用;質粒DNA轉化大腸桿菌的程序3、重組體向寄主細胞的導入用冷的無菌槍頭吸取200uL感受態細胞到一新的離心管中,加入質粒DNA后冰浴30分鐘；立即將轉化用的離心管置入42℃水浴中靜置90秒；迅速將離心管移入冰水混合物中冰浴1-2分鐘;加入800uL的LB培養基,混勻后于37℃水浴5分鐘；將離心管側向固定在搖床上,37℃緩慢震蕩培養45分鐘;于室溫1000rpm離心5分鐘,棄取約800uL的培養液,再將剩余的培養液和細菌重懸,然后涂布到含有抗生素的LB平板上37℃選擇培養過夜(16h);檢測選擇平板上的抗性菌落,并提取質粒DNA進行鑒定.第三節重組克隆的篩選和鑒定根據所使用克隆載體的特性不同，重組克隆的篩選方法也多種多樣。比如，用噬菌體DNA作為載體時就不需要篩選，所有正常的噬菌斑都是重組體；當使用pUC系列載體時，白色菌落一般都是重組體；如果所用的質粒并不具備明顯的鑒別特性，那么我們也可以利用DNA的酶切分析進行直接鑒定。比如，從平板上隨機挑選10個菌落，然后提取其中的質粒DNA分子，并對其進行酶切分析，同樣可以準確地選擇得到所要的重組克隆，而且同時可以鑒定外源片段插入的方向，選擇得到所要的理想克隆。有時，我們不僅想知道哪些是重組體克隆，而且想知道重組體克隆中哪些是含有某個基因的克隆（比如在cDNA文庫的篩選中，我們就需要選擇到含有目的基因克隆）。這時我們可以用比較復雜的核酸雜交或免疫化學的方法。隨機挑取提取質粒第三節重組克隆的篩選和鑒定連接產物轉化空載體轉化酶切質粒1.00.53.5kb1234567891011M1.00.50.51.04.03.05.0AA第六章

植物基因工程載體及其構建第一節

植物基因工程載體種類第二節

根癌農桿菌Ti質粒的結構與功能第三節

Ti質粒基因轉化機理第四節

Ti質粒的改造及載體構建第五節

常用選擇標記和報告基因植物基因轉化系統l

1.載體轉化系統（Ti質粒轉化載體、Ri質粒轉化載體、病毒轉化載體）l

2.

DNA直接導入轉化系統（原生質體、基因槍）l

3.種質轉化系統（花粉管通道法、生殖細胞浸泡法、胚囊子房注射法）。載體轉化系統是目前植物基因工程中使用最多、機理最清楚、技術最成熟的、最重要的一種轉化系統,其中又以Ti質粒轉化載體最為重要。第一節植物基因工程載體種類根據其功能和構建過程，可分為以下種類。（1）目的基因克隆載體：其功能是保存和克隆目的基因。與微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的E.Coli小質粒為載體。（2）中間克隆載體：是構建中間表達載體的基礎質粒。是由大腸桿菌質粒插入T-DNA片段、目的基因和標記基因等構建而成。（3）中間表達載體：是含有植物特異啟動子的中間載體。是構建轉化載體的質粒。（4）卸甲載體：是解除武裝的Ti質粒或Ri質粒，是構建轉化載體的受體質粒。（5）植物基因轉化載體：是最后用于目的基因導人植物細胞的載體，亦稱工程載體。它是由中間表達載體和卸甲載體構建而成。雙元載體系統的中間載體與共整合系統中間載體不同之處是①無同源序列；②具有LB和RB;③無Co1E1復制點

五、載體構建中常用的選擇標記及報告基因如何選擇和篩選轉化體同樣是一個重要問題。科學家家一直試圖把轉化體帶上一個標記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標記基因，并已插入各種轉化載體中，作為一種標記基因。（不論是選擇標記基因還是篩選標記基因，后者亦稱報告基因）都必須具備以下四個條件：①編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶；②基因較小，可構成嵌合基因；③能在轉化體中得到充分表達；④檢測容易，并且能定量分析。選擇標記基因和篩選標記基因除具有上述共同之處外，它們在功能和性質上還有一定差異。選擇標記基因的功能主要是該基因的產物給予植物細胞產生一種選擇壓力，致使未轉化細胞不能生長、發育與分化。而轉化細胞對該標記產生抗性，不影響其生長等，從而將轉化細胞選擇出來，例如，Cat（氯霉抗性基因）。篩選標記基因強調給轉化細胞帶上一種標記，起報告和識別作用，故稱報告基因。2．報告基困的應用在理想狀態下，所有的在含有選擇劑培養條件下再生的植株都是被轉化體。不幸的是事情并非盡如人愿。由于種種原因，例如生理抗性的產生，選擇與植物種類的敏感性，無性系的變異性，甚至“逃避者”或漏洞的出現等，都會產生非轉化植株的再生。因此，對在選擇劑條件下再生的植株或組織乃至細胞都要進一步的篩選確定其是否屬于真正的基因轉化體。這是篩選標記基因的第一個作用。篩選標記基因的第二個功能是在轉化系統中通過瞬時表達檢測來確定轉化是否成功，或檢測轉化的基因是否能在轉化細胞中得到表達，因此起到報告的作用，故亦稱之為報告基因（reportgene）。第三功能是被用于啟動子表達特性的評估和亞細胞區問的研究分析等。目前作為篩選標記的基因1）冠癭堿opine基因至今廣泛用于轉化載體作為篩選標記之一是合成冠癭堿基因。各種農桿菌菌