實驗六、細胞凋亡的誘導及觀察2002年10月7日，瑞典卡羅林斯卡醫學院諾貝爾獎評審委員會將2002年諾貝爾生理學或醫學獎授予了悉尼·布雷內、羅伯特·霍維茨和約翰·蘇爾斯頓三位科學家，以表彰他們在“細胞程序性死亡”這一領域中的開創性工作。他們不但發現在生物的器官發育過程中存在細胞程序性死亡，而且闡明了細胞程序性死亡過程中的基因規律。實驗目的1.了解細胞凋亡的原理2.學習離體誘導細胞凋亡的方法2.掌握利用普通顯微鏡和熒光顯微鏡觀察凋亡細胞形態的方法一、細胞死亡（celldeath）定義：細胞生命現象不可逆的停止，分為兩種形式，即壞死性死亡和程序性死亡。1.壞死性死亡（necrosis）定義：細胞外部的化學、物理或者生物的因素的侵襲而造成的細胞崩潰和裂解，是被動的死亡。2.1細胞凋亡（apoptosis）定義：是由體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞主動死亡過程.凋亡細胞將被鄰近的細胞或吞噬細胞所吞噬并消化2.2細胞凋亡誘導因素內源性因素；內源性的因素包括細胞凋亡誘發機制（如Ｆas配體、腫瘤壞死因子等）的激活和抑制機制（生長因子、激素、受體因子等增殖性因子）的失活。外源性的因素；外源性的因素包括放射線、熱休克等物理性因素，藥物、毒物等化學性因素以及病毒、細菌等生物學因素。2.3細胞凋亡的生物學特征形態學特征生物化學特征

DNA片段化大分子的合成

tTG（組織轉谷氨酰胺酶）的積累并達到較高的水平。形態學特征細胞變圓、胞質皺縮，細胞體積減小，染色質凝聚，核碎裂成為染色質塊（核碎片）。整個細胞通過發芽、起泡等方式產生一些球形突起，并在基部脫落形成大小不等的、內含胞質、細胞器和核碎片的凋亡小體（apoptoticbody）。

凋亡的起始：細胞表面的特化結構如微絨毛消失，細胞間接觸的消失，但細胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內質網上脫離，內質網囊腔膨脹，并逐漸與質膜融合；染色質固縮，形成新月形帽狀結構等形態，沿著核膜分布

凋亡小體的形成:核染色質斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞質膜所包圍。細胞表面產生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體凋亡小體逐漸為鄰近的細胞或吞噬細胞所吞噬并消化。細胞凋亡過程的3個階段壞死凋亡形態學特征膜完整性喪失胞漿和線粒體膨脹全細胞裂解

胞膜出芽，但保持完整染色體聚集在核膜周邊胞漿收縮、細胞核凝集最后細胞分裂為凋亡小體Bcl-2家族蛋白導致線粒體膜通透性增加生化特征 離子內環境失調非能量依賴性的（被動過程，在4°C也可以發生）隨機消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態）PostlyticDNA斷裂

ATP依賴性的（主動過程，在4°C不能發生）以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNAladder）PrelyticDNA斷裂線粒體釋放多種因子至胞漿中（細胞色素c、AIF）Caspases級聯活化膜對稱性改變（PS外翻）生理學特征影響群組細胞由非生理學因素引起（如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等）被巨噬細胞吞噬周圍有明顯的炎癥反應只影響單個細胞由生理學刺激誘導（如生長因子缺乏、激素環境改變等）被臨近細胞和巨噬細胞吞噬無炎癥反應細胞的兩種死亡方式及比較細胞凋亡的形態學檢測

1光學顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質的形態學改變來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI；吖啶橙。3電子顯微鏡觀察DAPI4，6-聯脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)可以穿透活細胞膜，對活細胞無毒副作用與雙鏈DNA結合產生比DAPI自身強20多倍的熒光與單鏈DNA結合后，熒光不增強λex

340

nm;λem

488

nm(nurDAPI)

λex

364

nm;λem

454

nm(DAPI-DNA-complex)（藍光）優點：結合力強，熒光強且穩定缺點：自身有熒光，背景高。致癌NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocessbyusingDAPIHoechstHoechst是一種水溶性雙苯咪唑類化合物，可以穿透活細胞膜，Hoechst

33342比Hoechst

33258更易穿透活細胞膜，對活細胞的毒性較低

與DNA結合后熒光明顯增強λex

346nm;λem

460

nm(33258)λex

350

nm;λem

461

nm(Hoechst-DNA-complex)（藍光）在凋亡細胞中，細胞膜對Hoechst33258的攝取增高，并且由于染色體高度濃縮，染色呈強藍色熒光優點：結合力強，熒光強于DAPI，缺點：自身有熒光，背景高。穩定性比DAPI差，致癌結果正常細胞核有致密濃染的凋亡細胞核吖啶橙3,6-Bis(dimethylamino)acridinehydrochloride吖啶橙是最經典的靈敏的熒光染料，對細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。細胞核因含DNA呈綠色，細胞質及核仁因含RNA呈紅色；λex

495

nm;λem

526

nminTEbufferpH8.0λem

526

nmwithDNA,λem

650

nmwithDNA(enhancedfluorescencewithDNA）,優點：結合力強，穩定缺點：自身有熒光，背景高。電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象的空泡結構。細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊。T細胞雜交瘤細胞(掃描電鏡)內源性核酸內切酶基因的活化和表達，導致凋亡細胞的染色質DNA的有控裂解，得到的DNA片段的長度為180-200bp的倍數。生化特征：DNA梯狀條帶細胞色素c誘導的凋亡細胞DNA電泳圖1．細胞色素c誘導0h2．細胞色素c誘導1h3．細胞色素c誘導2h4．細胞色素c誘導3h5．細胞色素c誘導4h6．陰性對照7．Marker

（自趙允、翟中和）最簡便可靠的方法2.4細胞凋亡的意義1.動物機體靠對細胞增殖和細胞周期的正負控制以及對細胞凋亡的正負控制來維持細胞總數的平衡和機體的生命活力。如：健康的成人體內，在骨髓和腸中，每小時約有10億個細胞凋亡。

2.細胞凋亡在形態建成中起到重要作用（如手指和腳趾的發育），或者對于不再需要的構造加以消除（如蝌蚪尾巴的消除）。3.細胞凋亡還能夠調節細胞的數量和質量。細胞凋亡對發育中神經細胞數量的調節4.細胞凋亡的研究加深人們對生命現象及某些疾病的認識實驗六、細胞凋亡的觀察原理：HeLa細胞經放線菌素D誘導后，可以產生不同程度的細胞凋亡，利用熒光染色，可以觀察到典型的凋亡核（核碎片）。凋亡核呈顆粒團狀分布，顏色較正常細胞致密且濃染。材料及設備：HeLa貼壁培養細胞、250mg/ml放線菌素D（ActinomycinD）、吖啶橙熒光染料、卡諾氏固定液、0.9%生理鹽水、10%甘油熒光顯微鏡、蓋玻片、載玻片、鑷子、一次性吸管、離心機、EP管、培養皿、小燒杯等。實驗步驟1.誘導：向處于對數生長期的Hela細胞中加入250mg/ml的放線菌素D溶液10~15μl（終濃度0.5~0.75ug/ml），繼續培養18h左右；2.細胞收集和洗滌：將細胞懸液平均轉移到4個1.5毫升的EP管中，用1ml生理鹽水清洗細胞,去掉生理鹽水,將瓶壁上剩余細胞用1ml0.25%的胰酶消化3min后，將細胞懸液加入培養皿,吹打生長面,平均合并至4個EP管中。以2000rpm離心6-8min，去上清；3.細胞預固定和固定：

加入0.9毫升生理鹽水，懸浮細胞，使細胞分散，加入0.1毫升卡諾氏固定液，混勻；離心，去上清（保留0.1毫升生理鹽水）；

加入固定液至1毫升，小心懸浮細胞，室溫下固定處理10min，離心，去上清，加入0.1毫升固定液，小心充分混勻細胞；4.制片（空氣干燥法）取一滴細胞懸液，滴