免疫細(xì)胞分離技術(shù)免疫細(xì)胞分離技術(shù)是現(xiàn)代免疫學(xué)研究和臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)工具。通過各種先進(jìn)的分離技術(shù)，科研人員能夠從復(fù)雜的混合組織中獲得高純度的目標(biāo)免疫細(xì)胞，用于后續(xù)的功能研究、藥物篩選和免疫治療。本課程將系統(tǒng)介紹各類免疫細(xì)胞的分離原理和方法，包括密度梯度離心、免疫親和、流式細(xì)胞術(shù)和磁珠分選等核心技術(shù)，以及不同免疫細(xì)胞類型的特異性分離策略和注意事項。課程概述1課程內(nèi)容本課程共十章，涵蓋免疫細(xì)胞基礎(chǔ)知識、分離原理、各類細(xì)胞的特異性分離方法、純度檢測和功能驗證。從理論到實踐，全面介紹現(xiàn)代免疫細(xì)胞分離技術(shù)的應(yīng)用。2授課方式理論與實踐相結(jié)合，通過多媒體教學(xué)、實驗室演示和案例分析，幫助學(xué)生掌握關(guān)鍵技術(shù)和方法。每章結(jié)束后有練習(xí)題和討論環(huán)節(jié)，促進(jìn)知識內(nèi)化。3適用對象免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程等專業(yè)高年級本科生、研究生，以及從事免疫學(xué)研究、細(xì)胞治療和臨床診斷的專業(yè)技術(shù)人員。學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握基礎(chǔ)知識理解各類免疫細(xì)胞的生物學(xué)特性、表面標(biāo)志物和功能特點，為分離技術(shù)的選擇和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。熟悉技術(shù)原理掌握密度梯度離心、免疫親和分離、流式細(xì)胞分選和磁珠分選等主要分離技術(shù)的工作原理、適用范圍和操作流程。實踐操作技能能夠獨立完成外周血單個核細(xì)胞分離、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分離，并進(jìn)行純度檢測和功能驗證。培養(yǎng)科研能力能夠針對不同研究目的，設(shè)計合理的細(xì)胞分離策略，解決分離過程中的常見問題，并將分離技術(shù)應(yīng)用于實際科研和臨床工作。第一章：免疫細(xì)胞簡介免疫細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的核心執(zhí)行單位，負(fù)責(zé)識別和清除外來病原體、異常自身細(xì)胞和有害物質(zhì)。它們廣泛分布于血液、淋巴組織和各種組織器官中，共同構(gòu)成了人體的免疫防御網(wǎng)絡(luò)。免疫細(xì)胞根據(jù)發(fā)育來源可分為骨髓源性和胸腺源性；根據(jù)功能可分為先天免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞。不同類型的免疫細(xì)胞在形態(tài)、表面標(biāo)志物、功能機(jī)制和分布位置等方面存在顯著差異。研究免疫細(xì)胞的分離技術(shù)，首先需要了解各類免疫細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，以便選擇合適的分離方法和策略。本章將概述主要免疫細(xì)胞類型的特征及其在免疫應(yīng)答中的作用。免疫細(xì)胞的類型淋巴細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，主要參與特異性免疫應(yīng)答和免疫記憶形成，是適應(yīng)性免疫的核心細(xì)胞。吞噬細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，負(fù)責(zé)吞噬和消化病原體及死亡細(xì)胞，同時分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。抗原提呈細(xì)胞主要包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，能夠攝取、加工和提呈抗原，激活T細(xì)胞，連接先天免疫和適應(yīng)性免疫。淋巴細(xì)胞定義與特征淋巴細(xì)胞是最主要的免疫細(xì)胞類型，約占白細(xì)胞總數(shù)的20-40%。它們體積小，核大細(xì)胞質(zhì)少，在血液和淋巴組織中廣泛分布，是適應(yīng)性免疫的主要執(zhí)行細(xì)胞。分類根據(jù)發(fā)育來源和功能，淋巴細(xì)胞可分為T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞三大類。它們各自表達(dá)不同的表面分子，執(zhí)行不同的免疫功能，共同參與機(jī)體的免疫防御。生物學(xué)特性淋巴細(xì)胞具有識別特異性抗原、產(chǎn)生免疫記憶和自我調(diào)節(jié)等特點。它們在靜息狀態(tài)下體積小，活化后可增大并快速增殖，分化為效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞。T細(xì)胞發(fā)育和分化T細(xì)胞源于骨髓造血干細(xì)胞，在胸腺中發(fā)育成熟，經(jīng)過陽性選擇和陰性選擇，確保只有能夠識別自身MHC但不與自身抗原過度反應(yīng)的T細(xì)胞才能存活。分類與功能T細(xì)胞主要分為CD4+輔助T細(xì)胞（Th）和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）。Th細(xì)胞可進(jìn)一步分化為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等亞型，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；CTL直接殺傷被病原體感染的細(xì)胞。表面標(biāo)志物所有成熟T細(xì)胞表面均表達(dá)CD3和T細(xì)胞受體（TCR）復(fù)合物。此外，不同亞群還表達(dá)特異性標(biāo)志物，如CD4、CD8、CD25、CD45RA、CD45RO等，用于區(qū)分不同功能的T細(xì)胞亞群。B細(xì)胞1發(fā)育過程B細(xì)胞在骨髓中發(fā)育，經(jīng)過多個階段（前B細(xì)胞、前B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞）后成為成熟的初始B細(xì)胞，遷移至脾臟和淋巴結(jié)等外周淋巴組織。發(fā)育過程中，B細(xì)胞重排免疫球蛋白基因，形成獨特的B細(xì)胞受體（BCR）。2功能特點B細(xì)胞是體液免疫的主要執(zhí)行細(xì)胞，能夠識別可溶性抗原，在T細(xì)胞幫助下活化、增殖并分化為漿細(xì)胞，分泌抗原特異性抗體。部分活化B細(xì)胞可分化為長壽命的記憶B細(xì)胞，負(fù)責(zé)免疫記憶的形成。3表面標(biāo)志物成熟B細(xì)胞表面表達(dá)多種特征性分子，包括B細(xì)胞受體（膜表面免疫球蛋白）、CD19、CD20、CD21、CD22和CD40等。這些分子既是B細(xì)胞鑒定的標(biāo)志，也是B細(xì)胞分離的靶點。NK細(xì)胞定義與起源自然殺傷（NK）細(xì)胞是一類大顆粒淋巴細(xì)胞，屬于先天免疫系統(tǒng)，起源于骨髓造血干細(xì)胞，但其發(fā)育途徑與T細(xì)胞和B細(xì)胞不同。NK細(xì)胞約占外周血淋巴細(xì)胞的5-15%。1識別機(jī)制NK細(xì)胞通過表面的激活受體和抑制受體平衡調(diào)節(jié)識別靶細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞表面MHC-I分子缺失或表達(dá)異常（如腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞），抑制信號減弱，激活信號占優(yōu)，NK細(xì)胞被激活。2功能作用NK細(xì)胞可直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，無需事先致敏；能分泌多種細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α等，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；參與抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）。3表面標(biāo)志物人NK細(xì)胞主要表達(dá)CD56和CD16（FcγRIII），不表達(dá)CD3。根據(jù)CD56表達(dá)強(qiáng)度，可分為CD56bright和CD56dim兩個亞群，功能略有差異。其他特征性標(biāo)志還包括NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D等。4吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。它們通過識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），迅速做出免疫反應(yīng)。吞噬細(xì)胞的主要功能是吞噬并消化病原體、死亡細(xì)胞和異物；分泌細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；部分吞噬細(xì)胞還能處理和提呈抗原，連接先天免疫和適應(yīng)性免疫。在細(xì)胞分離技術(shù)中，常利用吞噬細(xì)胞的貼壁性和特異性表面標(biāo)志物進(jìn)行分離。抗原提呈細(xì)胞（APC）1專職APC樹突狀細(xì)胞是最有效的抗原提呈細(xì)胞，表達(dá)高水平的MHC和共刺激分子2次級APC巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等也具有抗原提呈能力，但效率較低3非專業(yè)APC其他組織細(xì)胞在特定條件下可表達(dá)MHC-I提呈抗原抗原提呈細(xì)胞是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，它們攝取外來抗原或自身異常蛋白，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行加工處理，然后通過MHC分子將抗原肽段展示在細(xì)胞表面，提呈給T細(xì)胞識別。除了提呈抗原外，專業(yè)APC還表達(dá)CD80/CD86等共刺激分子和分泌細(xì)胞因子，提供T細(xì)胞活化所需的第二信號和第三信號。不同類型的APC有各自偏好的抗原攝取方式和處理途徑，共同構(gòu)成完整的抗原提呈網(wǎng)絡(luò)。第二章：細(xì)胞分離的基本原理樣本制備組織消化、單細(xì)胞懸液制備1初步富集密度梯度離心、紅細(xì)胞裂解2特異性分離免疫親和、流式分選、磁珠分選3純度驗證流式檢測、功能分析4免疫細(xì)胞分離技術(shù)的核心原理是利用細(xì)胞之間的物理特性差異（如密度、大小、顆粒度）或生物學(xué)特性差異（如表面標(biāo)志物表達(dá)），將目標(biāo)細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分離出來。現(xiàn)代細(xì)胞分離技術(shù)通常結(jié)合多種原理，采用多步驟策略：先通過物理方法進(jìn)行初步富集（如從外周血中分離單個核細(xì)胞），再利用特異性方法進(jìn)行精細(xì)分離（如從PBMC中分離特定的T細(xì)胞亞群）。這種策略既提高分離效率，又保證細(xì)胞純度和活性。密度梯度離心法原理基于不同細(xì)胞類型密度差異，在離心力作用下，細(xì)胞在梯度介質(zhì)中按密度大小分層。常用的梯度介質(zhì)包括Ficoll、Percoll等，通常調(diào)整為特定密度（如1.077g/ml）。分離效果以Ficoll分離PBMC為例，離心后形成多層：上層為血漿，中間層（界面層）為單個核細(xì)胞和血小板，下層為梯度介質(zhì)，底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。收集界面層即可獲得PBMC。操作要點梯度介質(zhì)與稀釋血液需小心分層；離心力、溫度、加速和減速速率都需嚴(yán)格控制；離心后小心收集界面層，避免污染；分離后需多次洗滌去除殘留梯度介質(zhì)。免疫親和分離法1免疫親和分離特異性抗體與細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合2基質(zhì)固定抗體抗體固定在磁珠、柱子或培養(yǎng)皿上3靶細(xì)胞結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞與固定抗體特異性結(jié)合4非靶細(xì)胞洗脫非目標(biāo)細(xì)胞被洗脫，靶細(xì)胞被保留5靶細(xì)胞回收通過洗脫緩沖液或酶切回收目標(biāo)細(xì)胞免疫親和分離法利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理，使用特異性抗體（通常為單克隆抗體）識別并結(jié)合細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，從而將目標(biāo)細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分離出來。根據(jù)操作模式，可分為正向分選（直接選擇目標(biāo)細(xì)胞）和負(fù)向分選（去除非目標(biāo)細(xì)胞）。此方法是現(xiàn)代細(xì)胞分離技術(shù)的核心，具有特異性高、效率高、細(xì)胞活性保存好等優(yōu)點。磁珠分選、流式細(xì)胞分選和親和柱分離等技術(shù)都是基于免疫親和原理的衍生技術(shù)。流式細(xì)胞分選法細(xì)胞染色用熒光標(biāo)記的特異性抗體標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞表面分子，不同細(xì)胞亞群可用不同熒光標(biāo)記，實現(xiàn)多參數(shù)分析。流式檢測細(xì)胞懸液以單細(xì)胞流經(jīng)激光束，每個細(xì)胞的散射光和熒光信號被探測器捕獲，分析細(xì)胞理化特性和表面標(biāo)志物表達(dá)。電荷分選根據(jù)預(yù)設(shè)門限，賦予目標(biāo)細(xì)胞特定電荷，使其在電場中偏轉(zhuǎn)，被收集到相應(yīng)的收集管中，實現(xiàn)物理分選。收集分析分選后的細(xì)胞可進(jìn)行純度檢測、功能分析或培養(yǎng)擴(kuò)增。現(xiàn)代流式分選儀可實現(xiàn)多達(dá)18個參數(shù)同時分析，且保持高細(xì)胞活性。磁珠分選法原理利用包被特異性抗體的磁性微珠，與目標(biāo)細(xì)胞表面抗原結(jié)合，在磁場作用下，標(biāo)記細(xì)胞被吸附，非標(biāo)記細(xì)胞流出，實現(xiàn)分離操作方式正向分選：直接標(biāo)記并保留目標(biāo)細(xì)胞；負(fù)向分選：標(biāo)記并去除非目標(biāo)細(xì)胞，收集未標(biāo)記部分常見系統(tǒng)MACS系統(tǒng)（MiltenyiBiotec）：磁性微珠與分離柱配合使用Dynabeads（ThermoFisher）：直接磁性分離，不使用柱子優(yōu)勢操作簡便，可同時處理大量樣本，保持細(xì)胞活性，成本相對較低，可實現(xiàn)多參數(shù)分選局限性純度可能低于流式分選，難以分離極低豐度細(xì)胞，依賴特異性抗體的質(zhì)量第三章：外周血單個核細(xì)胞（PBMC）分離1定義和意義外周血單個核細(xì)胞（PBMC）是指外周血中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和部分樹突狀細(xì)胞的總稱，不包括紅細(xì)胞、血小板和顆粒細(xì)胞。PBMC分離是大多數(shù)免疫細(xì)胞分離的第一步，也是最常用的基礎(chǔ)細(xì)胞分離技術(shù)。2主要方法Ficoll密度梯度離心法是PBMC分離的金標(biāo)準(zhǔn)，基于不同血液成分密度差異，在離心力作用下實現(xiàn)分層分離。此外還有磁珠分離法、Leucosep離心管法等改良方法，適用于不同實驗需求。3應(yīng)用領(lǐng)域分離的PBMC可用于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究、疫苗開發(fā)、細(xì)胞因子檢測、細(xì)胞治療（如CAR-T）、藥物篩選和毒性評價等多個領(lǐng)域。掌握PBMC分離技術(shù)是進(jìn)行高級免疫細(xì)胞分離的前提。PBMC分離的原理PBMC分離的核心原理是利用血液各組分之間的密度差異。當(dāng)使用密度為1.077g/ml的Ficoll分離液時，密度小于該值的細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）會位于分離液上方的界面處，而密度大于該值的細(xì)胞（如粒細(xì)胞和紅細(xì)胞）則沉降到分離液下方。此外，分離過程還涉及血液與分離液的比例控制、離心力大小、離心時間、溫度等多個影響因素。正確理解和控制這些因素，是獲得高純度、高活性PBMC的關(guān)鍵。Ficoll密度梯度離心法血液采集抗凝管采集新鮮血液1血液稀釋用PBS1:1稀釋抗凝血2分層加樣輕輕鋪在Ficoll分離液上3密度梯度離心800g離心30分鐘，緩加緩?fù)?收集界面吸取單核細(xì)胞層5Ficoll密度梯度離心法是分離PBMC最經(jīng)典、最可靠的方法。其基本原理是利用Ficoll溶液的特定密度（通常為1.077g/ml），在離心力作用下，將血液中不同密度的組分分層。操作關(guān)鍵點包括：使用合適抗凝劑（如EDTA或肝素）采集血液；血液需1:1稀釋以降低黏度；分層時需極其小心，避免混合；離心條件嚴(yán)格控制；收集界面層時需精準(zhǔn)操作，避免吸入分離液或血漿。正確操作可獲得約95%純度的PBMC，活性>95%。PBMC分離步驟（1）1準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備材料：新鮮全血（EDTA或肝素抗凝）、Ficoll分離液、PBS、無菌離心管、移液槍和吸頭、離心機(jī)。所有操作在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，試劑預(yù)熱至室溫，確保無菌環(huán)境。2血液稀釋將全血與等體積的PBS混合均勻（1:1稀釋），稀釋目的是降低血液黏度，防止紅細(xì)胞聚集，提高分離效率。稀釋液應(yīng)輕柔混勻，避免產(chǎn)生氣泡和細(xì)胞損傷。3分層加樣在15ml離心管中加入3mlFicoll分離液，然后小心將稀釋后的血液沿管壁緩慢滴加到Ficoll上層，保持兩層界面清晰，不混合。或使用Leucosep管，先加Ficoll，離心后再加血液。PBMC分離步驟（2）1密度梯度離心將加樣完成的離心管放入離心機(jī)，設(shè)置800g（約2000rpm），常溫離心30分鐘，加速和減速均設(shè)為最低檔位，避免離心過程中層次混合。離心后可觀察到清晰分層：上層為血漿，中間為渾濁的白色環(huán)狀界面層（PBMC），下層為透明的Ficoll，底部為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。2收集PBMC使用巴斯德吸管或移液器小心吸取界面層的PBMC，盡量少帶血漿和Ficoll。將收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的15ml離心管中，加PBS至10ml，輕輕混勻，300g離心10分鐘洗滌。棄上清，重懸細(xì)胞，再次洗滌1-2次，去除血小板和殘留Ficoll。3細(xì)胞計數(shù)和質(zhì)控最后一次洗滌后，用適量PBS或培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)等量混合，在血球計數(shù)板上計數(shù)，確定細(xì)胞數(shù)量和活性。正常情況下，每毫升全血可獲得約1-2×10^6個PBMC，活性應(yīng)>95%。可通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測PBMC組分。PBMC分離注意事項樣本處理血液樣本應(yīng)在采集后4小時內(nèi)處理，過長時間會導(dǎo)致細(xì)胞活性下降。若無法及時處理，應(yīng)在室溫保存，避免冷藏（會激活中性粒細(xì)胞）。樣本應(yīng)輕柔混勻，避免劇烈震蕩造成溶血。操作技巧分層加樣是關(guān)鍵步驟，必須保持界面清晰。離心參數(shù)（速度、時間、加減速）需嚴(yán)格控制。收集界面層時要精準(zhǔn)，避免吸入過多Ficoll或血漿。洗滌次數(shù)不應(yīng)少于2次，確保去除殘留分離液和血小板。常見問題分離后回收率低：可能是血液保存不當(dāng)、離心參數(shù)不適或收集不完全。紅細(xì)胞污染：可能是分層不清、離心參數(shù)不當(dāng)或紅細(xì)胞脆性增加。細(xì)胞活性差：可能與樣本質(zhì)量、操作時間過長或機(jī)械損傷有關(guān)。細(xì)胞保存分離的PBMC可立即使用，或在4℃短暫保存（<24小時）。長期保存需使用凍存液（含10%DMSO的血清）緩慢冷凍至-80℃或液氮中。凍存前，細(xì)胞濃度應(yīng)控制在1-2×10^7/ml，確保凍存效果。第四章：T細(xì)胞分離技術(shù)重要性T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫的核心細(xì)胞，在免疫監(jiān)視、抗感染和抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。分離高純度、功能完整的T細(xì)胞對免疫學(xué)研究和細(xì)胞治療（如CAR-T）至關(guān)重要。從PBMC中分離T細(xì)胞是常見的免疫細(xì)胞分離任務(wù)。分離策略T細(xì)胞分離通常采用兩步策略：先通過密度梯度離心法獲得PBMC，再基于T細(xì)胞特異性表面標(biāo)志（如CD3、CD4、CD8）進(jìn)行免疫分選。主要分離方法包括磁珠分選法和流式細(xì)胞分選法，可根據(jù)實驗需求選擇正向分選或負(fù)向分選。挑戰(zhàn)與發(fā)展T細(xì)胞分離的主要挑戰(zhàn)在于保持細(xì)胞的功能活性和表型穩(wěn)定性。近年來，封閉式自動化分離系統(tǒng)和基于微流控技術(shù)的新方法不斷涌現(xiàn)，提高了分離效率和細(xì)胞質(zhì)量，促進(jìn)了T細(xì)胞在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中的廣泛使用。T細(xì)胞表面標(biāo)志物T細(xì)胞表面表達(dá)多種特征性分子，這些分子不僅是T細(xì)胞鑒定和分類的標(biāo)志，也是T細(xì)胞分離的主要靶點。所有成熟T細(xì)胞都表達(dá)CD3分子復(fù)合物和T細(xì)胞受體（TCR），因此CD3通常作為全部T細(xì)胞的標(biāo)志物。根據(jù)共受體表達(dá)，T細(xì)胞可分為CD4+和CD8+兩大亞群。CD4+T細(xì)胞主要識別MHC-II提呈的抗原，包括Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg，表達(dá)CD25和Foxp3）等。CD8+T細(xì)胞識別MHC-I提呈的抗原，主要發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。此外，記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞可通過CD45RA/CD45RO等標(biāo)志物區(qū)分。磁珠分選T細(xì)胞（原理）正向分選使用抗CD3抗體標(biāo)記的磁珠直接標(biāo)記T細(xì)胞，在磁場中保留標(biāo)記細(xì)胞，非標(biāo)記細(xì)胞流出。優(yōu)點是操作簡單，缺點是分離的T細(xì)胞表面結(jié)合有抗體，可能影響后續(xù)功能研究。負(fù)向分選使用抗非T細(xì)胞標(biāo)志物（如CD14、CD16、CD19、CD56等）的抗體混合物，標(biāo)記并去除非T細(xì)胞，未標(biāo)記的T細(xì)胞流出。優(yōu)點是獲得的T細(xì)胞表面無抗體干擾，缺點是純度可能略低。兩步分選先進(jìn)行全T細(xì)胞分離，再分離特定亞群。例如，先使用抗CD3磁珠獲得全T細(xì)胞，再使用抗CD4或CD8磁珠進(jìn)一步分離亞群。此方法適用于低豐度亞群分離，可提高純度和特異性。磁珠分選T細(xì)胞（步驟）樣本準(zhǔn)備從外周血中分離PBMC，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^7/ml。使用冰冷的分選緩沖液（含2%FBS和2mMEDTA的PBS）重懸細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)新鮮，活性>90%，避免反復(fù)凍融。磁珠標(biāo)記以負(fù)向分選為例：將細(xì)胞懸液與生物素標(biāo)記的抗非T細(xì)胞抗體混合物（抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD56等）孵育15分鐘。洗滌后，加入抗生物素磁珠，4℃孵育15分鐘。期間輕輕混勻，避免細(xì)胞沉降。磁場分離將標(biāo)記細(xì)胞懸液加入預(yù)濕潤的分離柱（放置在磁鐵架上）。未標(biāo)記的T細(xì)胞流出收集。用緩沖液洗滌柱子3次，確保所有未標(biāo)記T細(xì)胞洗脫。若需高純度，可使用兩個連續(xù)柱子進(jìn)行二次分離。質(zhì)量控制分離后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和活性檢測。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞純度（CD3+比例）和亞群分布（CD4+、CD8+比例）。分析分離效率（回收率=獲得T細(xì)胞數(shù)/理論T細(xì)胞數(shù)×100%）。典型純度應(yīng)>95%，回收率>90%。流式分選T細(xì)胞99.9%純度流式分選可基于多參數(shù)精確選擇目標(biāo)細(xì)胞90%活性優(yōu)化的分選參數(shù)可保持細(xì)胞功能完整80%回收率典型的T細(xì)胞流式分選回收效率4h操作時間單次分選處理1×10^7細(xì)胞所需時間流式細(xì)胞分選是基于熒光激活細(xì)胞分選（FACS）原理的高精度分離技術(shù)，能夠同時分析多種細(xì)胞表面標(biāo)志物，實現(xiàn)更精細(xì)的T細(xì)胞亞群分離。典型的T細(xì)胞流式分選步驟包括：細(xì)胞標(biāo)記（使用熒光抗體如CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC等）；流式檢測和設(shè)置分選門；電荷賦予和物理分選；收集分選細(xì)胞和質(zhì)量控制。與磁珠分選相比，流式分選的優(yōu)勢在于多參數(shù)分析能力強(qiáng)，可分離極低豐度亞群，純度極高；劣勢在于操作復(fù)雜，設(shè)備昂貴，速度較慢，不適合大規(guī)模細(xì)胞分離。流式分選特別適用于研究性分離和稀有亞群（如記憶干細(xì)胞）分離。T細(xì)胞亞群分離T細(xì)胞亞群分離是在全T細(xì)胞分離基礎(chǔ)上的進(jìn)一步精細(xì)分離，通常基于特定亞群的表面標(biāo)志物。常見的T細(xì)胞亞群分離包括：CD4+T細(xì)胞（輔助T細(xì)胞）分離，使用抗CD4抗體；CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）分離，使用抗CD8抗體；Treg細(xì)胞分離，使用CD4+CD25+CD127低表達(dá)作為標(biāo)志。T細(xì)胞亞群分離可采用直接從PBMC一步分離或從預(yù)先富集的T細(xì)胞中二次分離兩種策略。對于低豐度亞群（如Treg、Th17等），推薦采用二步法，先富集總T細(xì)胞，再分離特定亞群。分離方法仍以磁珠分選和流式分選為主，具體選擇取決于純度要求、細(xì)胞數(shù)量和下游應(yīng)用。第五章：B細(xì)胞分離技術(shù)1分離意義B細(xì)胞是體液免疫的主要執(zhí)行者，負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體和建立體液免疫記憶。分離純B細(xì)胞對于研究抗體反應(yīng)、疫苗評價、自身免疫疾病機(jī)制和B細(xì)胞淋巴瘤治療等領(lǐng)域至關(guān)重要。高純度B細(xì)胞是研究抗原特異性免疫反應(yīng)和抗體基因庫構(gòu)建的基礎(chǔ)。2分離難點B細(xì)胞在外周血中比例相對較低（約5-15%的PBMC），且不同個體和生理狀態(tài)下波動較大。B細(xì)胞表面標(biāo)志物種類多，不同分化階段表達(dá)譜差異大。某些B細(xì)胞亞群（如記憶B細(xì)胞）極度稀少，需特殊技術(shù)分離。3分離策略B細(xì)胞分離通常采用兩步策略：先分離PBMC，再基于B細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物（如CD19、CD20、CD22）進(jìn)行分選。磁珠分選和流式分選是主要方法，臨床級分離還可使用纖維素柱吸附或自動化封閉系統(tǒng)。B細(xì)胞表面標(biāo)志物CD19B細(xì)胞系最廣泛的標(biāo)志物，從前B細(xì)胞到漿細(xì)胞前階段均表達(dá)。作為B細(xì)胞共受體復(fù)合物的成員，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD19是B細(xì)胞分離最常用的靶分子，幾乎所有B細(xì)胞分離試劑盒都使用抗CD19抗體。CD20成熟B細(xì)胞表面表達(dá)的鈣通道蛋白，從前B細(xì)胞晚期到漿細(xì)胞前階段表達(dá)，漿細(xì)胞不表達(dá)。廣泛用于B細(xì)胞淋巴瘤的靶向治療（如利妥昔單抗）。也可用作B細(xì)胞分離的靶分子，但覆蓋范圍略窄于CD19。膜表面免疫球蛋白（mIg）B細(xì)胞受體的主要組成部分，成熟B細(xì)胞表達(dá)IgM和IgD，記憶B細(xì)胞可表達(dá)IgG、IgA或IgE。不同階段B細(xì)胞表達(dá)不同類型和水平的mIg，可用于區(qū)分不同B細(xì)胞亞群，如初始B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞。磁珠分選B細(xì)胞1細(xì)胞準(zhǔn)備從外周血或淋巴組織獲取單細(xì)胞懸液，若為外周血，需先分離PBMC。計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^7/ml，使用含2%FBS和2mMEDTA的PBS作為分選緩沖液。確保細(xì)胞新鮮、活性高，且充分混勻成單細(xì)胞懸液。2分選策略選擇可選擇正向分選（直接標(biāo)記CD19+B細(xì)胞）或負(fù)向分選（標(biāo)記非B細(xì)胞）。正向分選操作簡單，純度高；負(fù)向分選可避免激活B細(xì)胞或影響其功能。根據(jù)下游研究需求選擇合適策略，如功能研究優(yōu)先選負(fù)向分選。3磁珠標(biāo)記根據(jù)所選策略，加入相應(yīng)磁珠標(biāo)記的抗體。正向分選使用抗CD19磁珠；負(fù)向分選使用抗非B細(xì)胞標(biāo)志物（CD3、CD14、CD16等）的抗體混合物。在4℃條件下孵育15-30分鐘，期間輕輕混勻，避免細(xì)胞沉降。4磁場分離與質(zhì)檢將標(biāo)記細(xì)胞懸液加入置于磁鐵架上的分離柱。對于正向分選，洗脫后移除磁鐵，用緩沖液沖洗收集CD19+細(xì)胞；對于負(fù)向分選，直接收集流出液中的未標(biāo)記B細(xì)胞。分離后進(jìn)行計數(shù)、活性檢測和純度分析（流式檢測CD19+比例，應(yīng)>95%）。流式分選B細(xì)胞熒光標(biāo)記將PBMC或淋巴組織單細(xì)胞懸液與熒光標(biāo)記的B細(xì)胞特異性抗體（如CD19-PE、CD20-APC）和排除標(biāo)記（如7-AAD用于排除死細(xì)胞）混合孵育。若需分離特定B細(xì)胞亞群，可使用多色組合，如CD19+IgD+CD27-（初始B細(xì)胞）或CD19+IgD-CD27+（轉(zhuǎn)換記憶B細(xì)胞）。儀器設(shè)置在流式細(xì)胞儀上設(shè)置適當(dāng)參數(shù)，包括散射光（前向散射FSC和側(cè)向散射SSC）和熒光通道。進(jìn)行單染和FMO（FluorescenceMinusOne）對照，確定陽性群體的準(zhǔn)確門限。設(shè)置適當(dāng)?shù)姆诌x速度和壓力，平衡細(xì)胞純度和回收率。細(xì)胞分選確認(rèn)門位置后，開始細(xì)胞分選。對于常規(guī)B細(xì)胞分選，首先通過FSC/SSC選取淋巴細(xì)胞群體，排除細(xì)胞碎片；然后選擇活細(xì)胞（7-AAD陰性）；最后根據(jù)CD19或CD20表達(dá)選擇B細(xì)胞。分選的細(xì)胞直接收集到含培養(yǎng)基的管中。質(zhì)量驗證分選后取少量細(xì)胞進(jìn)行復(fù)檢，確認(rèn)純度（CD19+比例通常可達(dá)>99%）。計數(shù)分選細(xì)胞數(shù)量，計算回收率。回收的B細(xì)胞可直接用于下游實驗，如功能研究、RNA提取、單細(xì)胞測序或體外培養(yǎng)。B細(xì)胞亞群分離初始B細(xì)胞記憶B細(xì)胞邊緣帶B細(xì)胞漿細(xì)胞母細(xì)胞調(diào)節(jié)性B細(xì)胞B細(xì)胞根據(jù)發(fā)育階段和功能特點可分為多個亞群，不同亞群在免疫反應(yīng)中發(fā)揮不同作用。主要B細(xì)胞亞群包括：初始B細(xì)胞（CD19+IgD+CD27-）：未經(jīng)抗原刺激的成熟B細(xì)胞；記憶B細(xì)胞（CD19+CD27+）：經(jīng)抗原刺激并產(chǎn)生記憶的B細(xì)胞，可進(jìn)一步分為IgM記憶B細(xì)胞和轉(zhuǎn)換記憶B細(xì)胞；漿母細(xì)胞（CD19+CD38++）：正在分化為漿細(xì)胞的B細(xì)胞；邊緣帶B細(xì)胞（CD19+IgM+IgD+CD27+）：介于先天和適應(yīng)性免疫之間的B細(xì)胞。B細(xì)胞亞群分離主要依靠流式分選技術(shù)，利用多色標(biāo)記區(qū)分不同亞群。對于臨床應(yīng)用，也可使用連續(xù)磁珠分選策略，先富集總B細(xì)胞，再基于特定標(biāo)志物分離亞群。B細(xì)胞亞群分離對研究免疫記憶、疫苗效果和B細(xì)胞相關(guān)疾病機(jī)制具有重要價值。第六章：NK細(xì)胞分離技術(shù)1234臨床意義NK細(xì)胞具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的能力，是腫瘤免疫治療的重要效應(yīng)細(xì)胞。高純度NK細(xì)胞的分離是NK細(xì)胞治療（如過繼性NK細(xì)胞輸注、CAR-NK細(xì)胞）的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。分離挑戰(zhàn)NK細(xì)胞在外周血中比例較低（約占PBMC的5-15%），且與部分T細(xì)胞亞群（NKT細(xì)胞）表型重疊。成熟NK細(xì)胞易被激活，分離過程可能影響其功能。部分NK細(xì)胞亞群極為稀少，需特殊技術(shù)分離。主要方法NK細(xì)胞分離主要基于其特征性表面標(biāo)志物（如CD56+CD3-），采用磁珠分選或流式分選技術(shù)。臨床規(guī)模NK細(xì)胞分離可使用自動化系統(tǒng)，如CliniMACS等。體外擴(kuò)增是獲取大量NK細(xì)胞的補(bǔ)充策略。應(yīng)用方向分離的NK細(xì)胞可用于基礎(chǔ)研究（如殺傷機(jī)制研究）、藥物篩選（如檢測藥物對NK細(xì)胞功能的影響）和臨床治療（如過繼性NK細(xì)胞治療、CAR-NK細(xì)胞治療）等多個領(lǐng)域。NK細(xì)胞表面標(biāo)志物標(biāo)志物表達(dá)特點分離中的應(yīng)用CD56幾乎所有人NK細(xì)胞表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度可分為CD56bright和CD56dim兩個亞群NK細(xì)胞分離的主要陽性標(biāo)志物CD16大多數(shù)NK細(xì)胞表達(dá)（主要是CD56dim亞群），介導(dǎo)ADCC部分NK細(xì)胞分離方案中的輔助標(biāo)志物CD3NK細(xì)胞不表達(dá)CD3，T細(xì)胞表達(dá)NK細(xì)胞分離的主要排除標(biāo)志物，區(qū)分NK和NKT細(xì)胞NKp46NK細(xì)胞特異性激活受體，表達(dá)相對穩(wěn)定CD56表達(dá)異常時的替代標(biāo)志物NKG2DNK細(xì)胞上表達(dá)的主要激活受體之一NK功能研究的重要標(biāo)志物磁珠分選NK細(xì)胞正向分選使用抗CD56磁珠直接標(biāo)記NK細(xì)胞，在磁場中保留標(biāo)記細(xì)胞。優(yōu)點是操作簡單，純度較高；缺點是可能共同分選出少量NKT細(xì)胞（CD56+CD3+），且抗體結(jié)合可能影響CD56分子功能。適用于對純度要求不是極高的應(yīng)用。負(fù)向分選使用抗非NK細(xì)胞標(biāo)志物（CD3、CD14、CD19等）抗體混合物，標(biāo)記并去除非NK細(xì)胞。優(yōu)點是分離的NK細(xì)胞表面無抗體結(jié)合，功能保持完整；缺點是純度可能略低于正向分選，且成本較高。推薦用于功能研究和細(xì)胞治療。兩步分選先去除明確的非NK細(xì)胞（如紅細(xì)胞、單核細(xì)胞），再進(jìn)行NK細(xì)胞特異性分選。例如，先通過Ficoll分離PBMC，再進(jìn)行NK特異性磁珠分選。或先用抗CD3磁珠去除T細(xì)胞，再用抗CD56磁珠分選NK細(xì)胞。這種策略可提高純度和回收率。臨床級分離使用符合GMP要求的封閉式系統(tǒng)（如MiltenyiCliniMACS或Cytochrome大規(guī)模分離系統(tǒng)）進(jìn)行自動化分離。這些系統(tǒng)使用臨床級試劑，可處理大量起始材料（如白細(xì)胞單采產(chǎn)物），獲得足夠臨床使用的NK細(xì)胞，純度和活性符合臨床要求。流式分選NK細(xì)胞流式分選是分離高純度NK細(xì)胞及特定NK亞群的金標(biāo)準(zhǔn)方法。基本流程包括：樣本制備（通常從PBMC開始）；熒光抗體標(biāo)記（典型組合為CD56-PE、CD3-FITC和CD16-APC，加7-AAD排除死細(xì)胞）；流式儀器參數(shù)設(shè)置和門限確定；細(xì)胞分選和收集；質(zhì)量控制和下游應(yīng)用。典型的NK細(xì)胞流式分選策略是：首先通過FSC/SSC選擇淋巴細(xì)胞群體；排除死細(xì)胞（7-AAD陰性）；選擇CD3-CD56+群體作為NK細(xì)胞；必要時可進(jìn)一步根據(jù)CD56表達(dá)強(qiáng)度和CD16表達(dá)分離NK亞群（CD56brightCD16-和CD56dimCD16+）。分選后的NK細(xì)胞純度通常可達(dá)99%以上。流式分選的優(yōu)勢在于能夠精確區(qū)分細(xì)微的表型差異，分離特定功能的NK亞群，且可同時分選多個不同群體。缺點是處理量有限，不適合大規(guī)模分離；設(shè)備和操作要求高。流式分選特別適用于研究性分離和稀有NK亞群（如組織駐留NK細(xì)胞）的分離。NK細(xì)胞純度檢測流式細(xì)胞術(shù)檢測最常用的NK細(xì)胞純度檢測方法。典型組合使用CD56和CD3雙染色，NK細(xì)胞表現(xiàn)為CD56+CD3-。高質(zhì)量分離應(yīng)達(dá)到>90%的CD56+CD3-比例。可添加CD16、CD45等標(biāo)志物進(jìn)行多參數(shù)分析，或使用NKp46、NKG2D等功能分子評估NK細(xì)胞亞群分布。免疫熒光顯微鏡用熒光標(biāo)記的抗CD56和抗CD3抗體染色細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察。NK細(xì)胞表現(xiàn)為CD56陽性（通常呈膜表達(dá)）、CD3陰性。此方法直觀但通量低，主要用于少量樣本的形態(tài)學(xué)確認(rèn)和空間分布研究，不適合常規(guī)純度檢測。功能驗證通過功能測試間接評估NK細(xì)胞純度和質(zhì)量。常用方法包括細(xì)胞毒性實驗（如對K562細(xì)胞的殺傷活性）、細(xì)胞因子分泌檢測（如IFN-γ、TNF-α產(chǎn)生）和脫顆粒反應(yīng)（CD107a表達(dá)）。高活性是純度高、質(zhì)量好的NK細(xì)胞的重要指標(biāo)。第七章：樹突狀細(xì)胞（DC）分離技術(shù)1研究價值樹突狀細(xì)胞是最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。它們不僅是基礎(chǔ)免疫學(xué)研究的重要對象，也是腫瘤疫苗和細(xì)胞治療的關(guān)鍵工具。分離和培養(yǎng)高質(zhì)量的DC對免疫治療的成功至關(guān)重要。2分離挑戰(zhàn)DC在外周血和組織中含量極低（外周血中<1%的白細(xì)胞），且存在多種亞型，形態(tài)和表型各異。不同組織中的DC表面標(biāo)志物表達(dá)譜存在差異，難以用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)分離。DC極易受到分離過程的刺激而改變表型和功能。3主要策略DC分離主要采用三種策略：直接從組織或血液中分離天然DC；從CD34+造血干細(xì)胞誘導(dǎo)分化DC；從單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為單核細(xì)胞衍生DC（MoDC）。其中第三種方法最為常用，特別是在臨床應(yīng)用中。DC的類型和特征樹突狀細(xì)胞是一類異質(zhì)性細(xì)胞群體，根據(jù)發(fā)育來源、組織分布和功能特點可分為多個亞型。主要包括：經(jīng)典DC（cDC），又分為cDC1（CD141+）和cDC2（CD1c+），前者專長于交叉提呈，后者激活CD4+T細(xì)胞；漿細(xì)胞樣DC（pDC），表達(dá)CD123和CD303，是I型干擾素的主要產(chǎn)生者；Langerhans細(xì)胞，主要分布在表皮，表達(dá)Langerin；單核細(xì)胞衍生DC（MoDC），炎癥條件下從單核細(xì)胞分化而來。不同亞型DC表達(dá)不同的識別受體、細(xì)胞因子譜和共刺激分子，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮不同作用。分離特定亞型DC對研究其功能特點和開發(fā)針對性免疫治療具有重要意義。外周血DC分離PBMC制備從健康供者外周血中通過Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。DC在外周血中比例極低（約占PBMC的0.5-2%），需要大量起始血液（通常>100ml）才能獲得足夠數(shù)量的DC用于研究。富集策略由于DC比例低，通常需要先進(jìn)行預(yù)富集，去除主要的非DC細(xì)胞群。常用方法包括：貼壁法去除單核細(xì)胞；抗體雞尾酒（抗CD3、CD14、CD16、CD19等）負(fù)向選擇去除T細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞；密度梯度進(jìn)一步分離低密度細(xì)胞。特異性分離DC亞型特異性分離主要基于特征性表面標(biāo)志物。pDC可使用抗CD123或CD303(BDCA-2)抗體分離；cDC1使用抗CD141(BDCA-3)抗體；cDC2使用抗CD1c(BDCA-1)抗體。分離方法可采用磁珠分選或流式分選，后者純度更高但通量較低。質(zhì)量評估分離后的DC需要進(jìn)行純度和功能驗證。純度評估通常采用流式細(xì)胞術(shù)檢測特異性標(biāo)志物表達(dá)；功能驗證包括形態(tài)學(xué)觀察（特征性樹突）、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（刺激T細(xì)胞增殖能力）、細(xì)胞因子產(chǎn)生譜和抗原呈遞能力等。體外誘導(dǎo)DC分化1單核細(xì)胞分離從PBMC中分離單核細(xì)胞，可采用貼壁法、密度梯度法或CD14磁珠分選法。CD14磁珠分選純度最高，但成本也最高。貼壁法簡便經(jīng)濟(jì)，但純度較低。典型的單核細(xì)胞純度應(yīng)>90%，細(xì)胞活性>95%。2分化培養(yǎng)將純化的單核細(xì)胞以密度0.5-1×10^6/ml接種于含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，添加GM-CSF(50-100ng/ml)和IL-4(20-50ng/ml)誘導(dǎo)分化為未成熟DC。培養(yǎng)物每2-3天添加新鮮細(xì)胞因子，總培養(yǎng)時間約5-7天。3DC成熟誘導(dǎo)未成熟DC具有強(qiáng)抗原攝取能力但抗原提呈能力弱。要獲得功能完整的成熟DC，需添加成熟刺激物，如LPS(100ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)和IL-6(15ng/ml)的"細(xì)胞因子雞尾酒"，或CD40L等，刺激24-48小時。4收獲與功能驗證成熟DC呈典型的星形或樹枝狀形態(tài)，半貼壁生長。輕輕吹打即可收獲。驗證成熟標(biāo)志物表達(dá)（CD80、CD83、CD86和MHC-II高表達(dá)）和功能特性（低抗原攝取能力、高T細(xì)胞刺激能力和高水平IL-12產(chǎn)生）。DC純度和成熟度檢測形態(tài)學(xué)觀察成熟DC呈典型的不規(guī)則形態(tài)，有豐富的胞質(zhì)突起或"樹突"。光學(xué)顯微鏡下可觀察細(xì)胞形態(tài)；電子顯微鏡可觀察更詳細(xì)的超微結(jié)構(gòu)，包括豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和MHC-II小泡等。表面標(biāo)志物檢測流式細(xì)胞術(shù)是評估DC純度和成熟度的主要方法。典型的DC標(biāo)志物包括CD11c、HLA-DR（高表達(dá)）、CD14（低/不表達(dá)）和特定亞型標(biāo)志物。成熟DC高表達(dá)CD80、CD83、CD86和CCR7，低表達(dá)CD1a和CD207。功能測試功能測試是DC質(zhì)量的最終評估。包括：混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR），檢測刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力；抗原特異性T細(xì)胞激活試驗；細(xì)胞因子分泌譜分析（如IL-12p70、IL-10等）；抗原攝取能力（如胞飲FITC-Dextran）。第八章：巨噬細(xì)胞分離技術(shù)巨噬細(xì)胞是組織中的專職吞噬細(xì)胞，由循環(huán)單核細(xì)胞遷移到組織后分化而來。它們在先天免疫防御、炎癥調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和抗原提呈等方面發(fā)揮重要作用。不同組織中的巨噬細(xì)胞具有特定名稱和功能特點，如肺泡巨噬細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞分離的主要挑戰(zhàn)在于：組織巨噬細(xì)胞與組織基質(zhì)結(jié)合緊密，需要特殊方法分離；不同組織巨噬細(xì)胞表型和功能存在明顯異質(zhì)性，難以用統(tǒng)一方法分離；巨噬細(xì)胞易被機(jī)械刺激和消化酶激活，影響功能研究；組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量有限，難以獲得大量純細(xì)胞。根據(jù)來源不同，巨噬細(xì)胞分離可分為三類：直接從組織中分離原代巨噬細(xì)胞；從外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化；使用巨噬細(xì)胞系細(xì)胞（如THP-1、RAW264.7等）。本章將重點介紹前兩種方法，特別是常用的腹腔巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的分離技術(shù)。巨噬細(xì)胞的來源和特征1組織特異性巨噬細(xì)胞適應(yīng)特定組織微環(huán)境的專職吞噬細(xì)胞2炎癥巨噬細(xì)胞由循環(huán)單核細(xì)胞遷移分化而來3組織駐留巨噬細(xì)胞胚胎期定居，可自我更新維持4單核細(xì)胞循環(huán)中的前體細(xì)胞5骨髓祖細(xì)胞單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的起源巨噬細(xì)胞是一類高度異質(zhì)性的免疫細(xì)胞，根據(jù)發(fā)育來源可分為兩大類：組織駐留巨噬細(xì)胞，起源于胚胎卵黃囊或胎肝祖細(xì)胞，在組織中長期維持并自我更新，如小膠質(zhì)細(xì)胞、Langerhans細(xì)胞等；炎癥巨噬細(xì)胞，由骨髓源性單核細(xì)胞在炎癥條件下遷移到組織后分化而來。巨噬細(xì)胞根據(jù)激活狀態(tài)可分為M1型（經(jīng)典活化，促炎癥）和M2型（替代活化，抗炎癥）。不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞表達(dá)不同的表面標(biāo)志物、分泌不同的細(xì)胞因子，發(fā)揮不同的功能。在分離和研究巨噬細(xì)胞時，需考慮其來源和極化狀態(tài)的影響。腹腔巨噬細(xì)胞分離1腹腔細(xì)胞收集腹腔巨噬細(xì)胞分離通常使用小鼠或大鼠作為來源。可采集靜息狀態(tài)（未刺激）的腹腔巨噬細(xì)胞，或通過硫糖鋁(2ml4%)、淀粉糊精或刀豆蛋白A等刺激物注射腹腔3-4天后收集募集的巨噬細(xì)胞（數(shù)量更多）。麻醉動物后，暴露腹部，用含5-10mMEDTA的冰冷PBS5-10ml灌洗腹腔2-3次，收集腹腔液。2巨噬細(xì)胞富集腹腔細(xì)胞懸液含有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞。利用巨噬細(xì)胞的貼壁特性進(jìn)行富集：將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)1-2小時，非貼壁細(xì)胞用PBS洗去，剩余貼壁細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞（純度約70-80%）。或使用密度梯度離心法初步富集巨噬細(xì)胞。3純化與鑒定若需更高純度，可使用磁珠分選（抗F4/80或CD11b抗體）或流式分選（F4/80+CD11b+）。分離的巨噬細(xì)胞可通過形態(tài)學(xué)觀察（大型單核細(xì)胞，豐富的胞質(zhì)），特異性標(biāo)志物表達(dá)（F4/80、CD11b、CD68等）和功能測試（吞噬能力、NO產(chǎn)生、細(xì)胞因子分泌等）進(jìn)行鑒定。肺泡巨噬細(xì)胞分離支氣管肺泡灌洗肺泡巨噬細(xì)胞主要通過支氣管肺泡灌洗（BAL）收集。麻醉動物（小鼠/大鼠）或利用人體肺葉切除標(biāo)本，插管氣管，用冰冷PBS反復(fù)灌洗肺泡（小鼠約0.8ml×3次，大鼠約5ml×3次），收集灌洗液。正常肺泡灌洗液中90-95%的細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞。肺組織消化對于深層肺巨噬細(xì)胞，需進(jìn)行肺組織消化。將肺臟灌注清除血液，剪碎組織，用含消化酶混合物（膠原酶I、分散酶II和DNaseI）的培養(yǎng)基消化30-45分鐘。通過70μm細(xì)胞篩過濾獲得單細(xì)胞懸液。消化法獲得的巨噬細(xì)胞包含肺泡和間質(zhì)兩種類型。純化與鑒定初步獲得的細(xì)胞可通過貼壁培養(yǎng)（1-2小時）富集巨噬細(xì)胞。更高純度需使用磁珠分選（人CD14/小鼠F4/80或CD11c）或流式分選（人：CD45+CD206+/小鼠：CD11c+Siglec-F+）。肺泡巨噬細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)豐富，含自體熒光；可通過吞噬測試、表面標(biāo)志物檢測和細(xì)胞因子分泌譜鑒定。巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)1培養(yǎng)條件巨噬細(xì)胞通常在含10-15%血清（FBS或自體血清）的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可添加抗生素防止污染，但應(yīng)注意某些抗生素（如慶大霉素）可影響巨噬細(xì)胞功能。培養(yǎng)板通常預(yù)先涂布胞外基質(zhì)蛋白（如纖連蛋白）以促進(jìn)貼壁和存活。培養(yǎng)溫度37℃，5%CO2，濕度>95%。2體外誘導(dǎo)分化從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞是常用方法。將純化的CD14+單核細(xì)胞（1×10^6/ml）培養(yǎng)在含M-CSF(50-100ng/ml)的完全培養(yǎng)基中5-7天。M1型巨噬細(xì)胞可通過LPS和IFN-γ誘導(dǎo)，M2型通過IL-4和IL-13誘導(dǎo)。不同誘導(dǎo)條件產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞表型和功能存在差異。3功能維持巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)的主要挑戰(zhàn)是維持其功能穩(wěn)定性。原代巨噬細(xì)胞通常不適合長期培養(yǎng)（>1周），隨著培養(yǎng)時間延長，其表型和功能會發(fā)生顯著變化。若需長期研究，建議使用巨噬細(xì)胞系（如THP-1、U937、RAW264.7等）或從造血干/祖細(xì)胞誘導(dǎo)。第九章：免疫細(xì)胞分離后的純度檢測免疫細(xì)胞分離后的純度檢測是確保實驗可靠性和重復(fù)性的關(guān)鍵步驟。無論采用何種分離方法，都需要通過客觀定量的方法確認(rèn)分離細(xì)胞的身份、純度和活性。純度檢測不僅能驗證分離技術(shù)的有效性，也是質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。常用的純度檢測方法包括：流式細(xì)胞術(shù)（最常用，可定量分析特異性標(biāo)志物表達(dá)）；免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫熒光染色（可觀察標(biāo)志物表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)）；分子生物學(xué)方法（RT-PCR檢測特異性基因表達(dá)）；功能測試（驗證細(xì)胞特征性功能）。對于臨床應(yīng)用，通常需要多種方法綜合評估，確保細(xì)胞產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測原理細(xì)胞標(biāo)記熒光抗體與細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合1激光激發(fā)單細(xì)胞流過激光束被激發(fā)產(chǎn)生熒光2信號檢測散射光和熒光被檢測器捕獲轉(zhuǎn)換為電信號3數(shù)據(jù)分析軟件處理生成點圖和直方圖顯示細(xì)胞特性4流式細(xì)胞術(shù)是免疫細(xì)胞純度檢測的首選方法，能夠在單細(xì)胞水平同時分析多個參數(shù)。其基本原理是利用熒光標(biāo)記的抗體特異性識別細(xì)胞表面或胞內(nèi)分子，在激光照射下產(chǎn)生熒光信號，由檢測器捕獲并轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號進(jìn)行分析。現(xiàn)代流式細(xì)胞儀通常具有多個激光器和檢測器，可同時檢測10-30個參數(shù)。檢測免疫細(xì)胞純度時，通常選擇該細(xì)胞類型的特征性標(biāo)志物（如T細(xì)胞的CD3、B細(xì)胞的CD19等）和排除標(biāo)志物（其他細(xì)胞類型的標(biāo)志物），結(jié)合活死細(xì)胞染料，全面評估分離細(xì)胞的純度、亞群組成和活性。免疫熒光染色步驟細(xì)胞準(zhǔn)備收集分離的細(xì)胞，用PBS洗滌，調(diào)整濃度至約1×10^6/ml。制備細(xì)胞涂片（離心沉淀或細(xì)胞離心機(jī)）或貼壁培養(yǎng)于載玻片上。必要時進(jìn)行固定（4%多聚甲醛10分鐘）和通透（0.1%TritonX-100，僅檢測胞內(nèi)抗原時需要）。封閉與標(biāo)記使用封閉液（含5-10%血清的PBS）室溫封閉30分鐘，減少非特異性結(jié)合。加入稀釋適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記一抗（如抗CD3-FITC、抗CD19-PE等），4℃孵育2小時或過夜。用PBS-T洗滌3次，每次5分鐘。若使用非標(biāo)記一抗，需進(jìn)一步孵育熒光標(biāo)記二抗。核染色與封片加入核染料（如DAPI，1μg/ml）染色細(xì)胞核，室溫5分鐘。PBS洗滌后，使用抗淬滅封片劑封片。封片干燥后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。熒光通道選擇應(yīng)與所用熒光染料匹配，避免光譜重疊。結(jié)果分析計算特定標(biāo)志物陽性細(xì)胞比例（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）作為純度指標(biāo)。觀察細(xì)胞形態(tài)和標(biāo)志物表達(dá)模式，判斷細(xì)胞身份。合格的分離樣本通常要求目標(biāo)細(xì)胞純度>90%（研究用途）或>95%（臨床用途）。必要時拍攝多個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析。流式細(xì)胞儀操作要點儀器準(zhǔn)備啟動流式細(xì)胞儀，讓系統(tǒng)穩(wěn)定30分鐘。進(jìn)行日常清洗和滅菌程序。校準(zhǔn)儀器，使用單染色對照調(diào)整補(bǔ)償，消除熒光通道間干擾。如有必要，使用熒光微球校準(zhǔn)熒光強(qiáng)度，確保不同批次數(shù)據(jù)可比。樣本制備分離的細(xì)胞懸浮于FACS緩沖液（含2%FBS和2mMEDTA的PBS）中。細(xì)胞數(shù)應(yīng)適中（0.5-1×10^6/樣本），避免過多（堵塞）或過少（統(tǒng)計不足）。準(zhǔn)備單染色對照和FMO（FluorescenceMinusOne）對照，用于設(shè)置補(bǔ)償和門限。數(shù)據(jù)采集設(shè)置合適的閾值和收集速度，通常控制在1000-3000個事件/秒，避免過快導(dǎo)致多細(xì)胞聚集。收集足夠數(shù)量的事件（通常至少10,000個，對稀有群體至少100個），確保統(tǒng)計意義。實時觀察散點圖，檢查是否有異常模式。分析策略使用FSC/SSC識別細(xì)胞群體，排除碎片。用活死染料（如7-AAD、PI）或FSC-A/FSC-H排除死細(xì)胞和聚集。根據(jù)關(guān)鍵標(biāo)志物表達(dá)確定目標(biāo)細(xì)胞群體。計算目標(biāo)細(xì)胞比例和絕對數(shù)量。結(jié)果通常以比例、平均熒光強(qiáng)度(MFI)或直方圖表示。數(shù)據(jù)分析和解釋純度評估純度計算方法：目標(biāo)細(xì)胞數(shù)/總有效細(xì)胞數(shù)×100%。例如，T細(xì)胞分離后的純度為CD3+細(xì)胞百分比，B細(xì)胞分離后的純度為CD19+細(xì)胞百分比。研究用途純度要求通常>90%，臨床應(yīng)用通常要求>95%。同時應(yīng)關(guān)注污染細(xì)胞的類型和比例，某些污染（如死細(xì)胞）影響較小，而其他污染（如激活細(xì)胞）可能嚴(yán)重干擾實驗。活性與功能除純度外，還應(yīng)評估細(xì)胞活性（通常用7-AAD或PI排除死細(xì)胞）和功能狀態(tài)。功能狀態(tài)可通過特定標(biāo)志物表達(dá)反映，如T細(xì)胞活化標(biāo)志（CD25、CD69）、B細(xì)胞活化標(biāo)志（CD80、CD86）或NK細(xì)胞活化受體表達(dá)（NKG2D、NKp46）。功能檢測可結(jié)合增殖實驗、細(xì)胞因子分泌或特異性殺傷活性等。亞群分析多參數(shù)分析可進(jìn)一步評估分離細(xì)胞的亞群組成。例如，T細(xì)胞分離后可分析CD4+/CD8+比例、記憶/初始T細(xì)胞比例，或Treg細(xì)胞比例；B細(xì)胞可分析初始/記憶B細(xì)胞比例；DC可分析成熟度標(biāo)志表達(dá)。亞群組成分析有助于更全面理解分離細(xì)胞的功能特點和潛在應(yīng)用價值。第十章：分離細(xì)胞的功能檢測1細(xì)胞活性檢測驗證細(xì)胞是否存活并保持基本代謝功能2表型穩(wěn)定性檢測確認(rèn)細(xì)胞保持原有表面標(biāo)志物表達(dá)譜3功能應(yīng)答測試評估細(xì)胞對特定刺激的反應(yīng)能力4特異性功能驗證檢測不同免疫細(xì)胞類型的特征性功能免疫細(xì)胞分離后的功能檢測是評估分離質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，也是確保下游實驗可靠性的必要步驟。分離過程可能對細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，如表面抗體結(jié)合可能激活或抑制細(xì)胞，機(jī)械應(yīng)力可能導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激，而分離試劑殘留可能干擾細(xì)胞信號傳導(dǎo)。功能檢測的選擇應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和研究目的確定。基本檢測包括細(xì)胞活性（MTT/CCK-8或臺盼藍(lán)排斥）和應(yīng)激狀態(tài)（熱休克蛋白表達(dá)或活性氧水平）。特異性功能檢測則針對各類免疫細(xì)胞的特征性功能，如T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌、B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生、NK細(xì)胞的殺傷活性和DC的抗原提呈能力等。T細(xì)胞增殖實驗24h刺激時間T細(xì)胞完全活化所需最短時間72h增殖高峰CD3/CD28刺激后增殖達(dá)峰時間2-4增殖倍數(shù)健康T細(xì)胞72小時內(nèi)的典型增殖倍數(shù)95%活性標(biāo)準(zhǔn)功能完整T細(xì)胞的最低增殖應(yīng)答率T細(xì)胞增殖實驗是評估分離T細(xì)胞功能完整性的基本方法。主要刺激方式包括：非特異性絲裂原刺激（如PHA、ConA）；抗CD3/CD28抗體刺激（模擬TCR信號）；同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR，反映對異體MHC的反應(yīng)）；抗原特異性刺激（對特定抗原的記憶T細(xì)胞反應(yīng)）。增殖檢測方法主要有：CFSE標(biāo)記法（通過細(xì)胞分裂稀釋熒光強(qiáng)度評估增殖代數(shù)）；3H-胸腺嘧啶核苷摻入法（測量DNA合成）；MTT/CCK-8法（測量代謝活性）；BrdU摻入法（檢測新合成DNA）；Ki-67表達(dá)檢測（增殖標(biāo)志物）。功能完整的T細(xì)胞應(yīng)表現(xiàn)出劑量依賴的增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子（如IL-