一、基因印記的概念是一種在基因組DNA水平對(duì)雙親等位基因特異性的修飾作用。結(jié)果導(dǎo)致來自不同性別親本（父母）的同源染色體上等位基因存在功能上的差異。驢馬正反雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果公驢—母馬公馬—母驢

騾

駃騠

基因組印跡現(xiàn)象最早由HelenCrouse于1960年在昆蟲研究中首次提出。

Sciara昆蟲的兩條X染色體

1980年，Cattanach等人發(fā)現(xiàn)，具有兩條母源11號(hào)染色體的小鼠在胚胎期比正常小鼠小，而具有兩條父源11號(hào)染色體的小鼠在胚胎期比正常小鼠大。但是，這兩種小鼠胚胎都無法正常發(fā)育而死于發(fā)育階段。

1984年，McCrath等人用人工單性生殖的方法產(chǎn)生了兩種特殊類型的小鼠胚胎：一種小鼠胚胎的全套染色體全部來自雄性親本，另一種小鼠胚胎的全套染色體全部來自雌性親本。但兩類小鼠均在發(fā)育期死亡。

1991年，Dechiara等人做了小鼠IGF-2剔除基因的實(shí)驗(yàn)，首次證明了生物體本身帶有基因組印跡基因。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除父源IGF-2等位基因小鼠發(fā)育成成體個(gè)體小，但若剔除的等位基因來自母源，動(dòng)物的個(gè)體沒有變化。直至1993年，F(xiàn)einberg實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)了基因組印跡也存在于人類。

二、基因組印跡與腫瘤的關(guān)系

IGF-2作為印跡基因，在正常人群里，只有父系的等位基因表達(dá)，母系的等位基因則處于靜止?fàn)顟B(tài)。

約有40%WT的患者腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)有IGF-2等位基因父母系共同表達(dá)。這種靜止的基因被重新活化表達(dá)的現(xiàn)象，稱作LOI（Lossofimprinting）。

結(jié)腸癌患者也可檢測(cè)到IGF-2的LOI現(xiàn)象，而且這種現(xiàn)象不僅存在于癌組織，也存在于癌旁組織和病人的血細(xì)胞中。由此被認(rèn)為這種現(xiàn)象很可能成為該病早期診斷的指標(biāo)。

此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與基因組印跡異常有關(guān)的腫瘤還有肝癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌等等。

目前已經(jīng)被證實(shí)與人類腫瘤發(fā)生相關(guān)的印跡基因除IGF-2外，還有WT1、P57KIP2、P73、NOEY2以及M6P/IGF-2R等等。

三、IGF-2基因LOI的檢測(cè)方法1、DNA水平篩選雜合子2、RNA水平觀察雜合性是否完整酶切位點(diǎn)：GGGCC|CGTGCCCC|CCGGGCACGGG即該序列在人群中存在SNP：等位基因a5’-GGGCCC-3’等位基因b5’-GTGCCC-3’

人群中將形成三種基因型：GG

TT

GT

雜合子的鑒定可以通過PCR產(chǎn)物酶切后電泳的方法完成GGTTGT236bp173bp63bpLOI的鑒定可以通過雜合子RT-PCR產(chǎn)物酶切后電泳的方法完成236bp173bp63bp正常(印記)正常LOI一、實(shí)驗(yàn)安排內(nèi)容contentclassperiod1基因組DNA提取genomicDNAextraction42RNA提取RNAextraction43聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)RT-PCR44電泳檢測(cè)及基因型分析electrophoresisandgenotypeanalysis4實(shí)驗(yàn)一基因組DNA的提取【基本原理】

常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA的原理在于用蛋白裂解液和蛋白酶將組織充分消化后，再應(yīng)用酚/氯仿將蛋白質(zhì)變性，而核酸則溶于水相，再在一定濃度的鹽和無水乙醇的作用下將核酸從水相中析出?！酒鞑摹?/p>

1．電子天平；2．勻漿器；3．EP管；4．冰盒；5．手套；6．高速離心機(jī)【試劑】1．酚；2．氯仿；3．無水乙醇；4．75%乙醇；5．純水【操作步驟】胃癌組織洗滌200ulPBS離心8000rpm5min消化180ulTE,20ul10%SDS3ul蛋白酶K,50℃2h棄上清留100ul酚提取300ul酚離心10000rpm10min移水相至新管酚、氯仿抽取150ul酚150ul氯仿離心10000rpm10min移水相至新管沉淀DNA1/10VNaAC(30ul)2V乙醇(600ul)離心10000rpm5min洗DNA75%乙醇300μl棄上清離心8000rpm5min棄上清干燥溶解DNA適量TE實(shí)驗(yàn)二組織總RNA的提取

【基本原理】

組織中的RNA主要分布在胞漿中，包括mRNA、tRNA和rRNA三種。mRNA含量最低，半衰期短，易于降解。在RNA的提取過程中，主要采用強(qiáng)變性劑，如異硫氰酸胍等破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，失活RNA酶。細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)等經(jīng)酚、氯仿等有機(jī)溶劑抽提被去除。真核生物中18SrRNA、28SrRNA經(jīng)瓊脂糖電泳后，在紫外燈下可觀察到兩條清晰的條帶。RNA提取關(guān)鍵:防止內(nèi)源性和廣泛存在的外源性RNA酶，如器皿、試劑和手上等存在的RNA酶對(duì)核酸的降解作用，所用材料、器皿均需經(jīng)DEPC處理（包括0.1%溶液浸泡過夜，蒸餾水沖洗及高壓滅菌15min去除殘存的DEPC）。【器材】1．電子天平；2．勻漿器；3．EP管；4．冰盒；5．手套；6．低溫冷凍高速離心機(jī)【試劑】

1．TRIzol試劑（Invitrogen/GIBCOBRL）；2．氯仿；3．異丙醇；4．75%乙醇；5．0.1%DEPC處理水【提取RNA操作步驟】胃癌組織制備勻漿200ulTrizol孵育4℃12h蓋上蓋后搖動(dòng)15sec加氯仿40ul冰上放置5min離心12000rpm4℃,15min移水相至新管加異丙醇100ul冰上孵育10min離心12000rpm4℃,10min棄上清洗滌沉淀75%乙醇200ul離心10000rpm4℃,5min空氣干燥溶解RNADEPC水20ul-70℃保存實(shí)驗(yàn)三反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

(RT-PCR)【基本原理】

PCR是體外擴(kuò)增DNA的方法，但不能直接以RNA為模板擴(kuò)增。利用反轉(zhuǎn)錄酶（RTase），可由mRNA生成cDNA（第一鏈）。以此cDNA為模板即可進(jìn)行RNA的PCR擴(kuò)增。如果在PCR反應(yīng)中，除加入待擴(kuò)增的特異基因的引物外，再加入常用的

-actin或GAPDH引物作為內(nèi)參基因擴(kuò)增，則可對(duì)特異基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行半定量分析。RT-PCR的原理【器材】

1．PCR擴(kuò)增儀；2．恒溫水浴箱；3．紫外燈檢測(cè)儀；4．EP管；5．手套【試劑】1．特異基因引物上游引物：5ˊCTTGGACTTTGAGTCAAATTGG3ˊ下游引物：5ˊCCTCCTTTGGTCTTACTGGG3ˊ2．RT-PCR試劑盒(Takara公司)【操作步驟】

一、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1.在EP管中加入以下反應(yīng)液5×RNAPCRBuffer4.0

lMgCl24.0

lRNaseFreedH2O5.5

ldNTPMixture(10mMeach)2.0

lRNaseInhibitor0.5

lAMVReverseTranscriptase1.0

lOligodT-AdaptorPrimer1.0

lRNA樣品(≤1ugtotalRNA)2.0

l總反應(yīng)體系20

l2.按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30

C10min50C20min99

C5min5

C5min二、PCR反應(yīng)1.取上液10

l加入ＥP管中，再加入下列試劑，混勻后，放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，然后用電泳鑒定PCR產(chǎn)物(10

l)。

5×RNAPCRBuffer(含MgCl2)滅菌蒸餾水TaKaRaTaqTM上游引物下游引物總反應(yīng)體系10.00

l28.75l0.25l0.50l0.50l50.00l2.按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94

C5min1個(gè)循環(huán)94

C45sec30個(gè)循環(huán)55

C45sec72

C45sec72

C7min延伸實(shí)驗(yàn)四限制性酶切及電泳檢測(cè)

一、限制性酶切【基本原理】

SNP的存在導(dǎo)致限制性酶切位點(diǎn)發(fā)生改變。根據(jù)IGF2基因第9外顯子具有限制性核酸內(nèi)切酶ApaI位點(diǎn)多肽性的特點(diǎn)，RT-PCR產(chǎn)物行ApaI消化，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行印跡丟失檢測(cè)。【器材】1．恒溫水浴箱；2．EP管；3．手套【試劑】1．ApaI限制性內(nèi)切酶；2．10×Lbuffer；3.純水【操作步驟】ApaI2ul10×Lbuffer4ul水24ulPCR產(chǎn)物10ul總反應(yīng)體系40ulRT-PCR產(chǎn)物酶切體系：37℃水浴搖床過夜1.限制性內(nèi)切酶消化

2.電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物10ul與電泳上樣緩沖液充分混合，在40mA電流下，2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察雜合子情況。一、瓊脂糖凝膠電泳【基本原理】瓊脂糖凝膠電泳是分離、純化、鑒定DNA片段的常用方法。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA分子在電場(chǎng)中通過介質(zhì)而泳動(dòng)，除電荷效應(yīng)外，凝膠介質(zhì)還有分子篩效應(yīng)，與分子大小及構(gòu)象有關(guān)。對(duì)于線性DNA分子，其電場(chǎng)中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。在凝膠中加入少量溴化乙錠(EB)，其分子可插入DNA的堿基之間，因此可在紫外燈下直接觀察到DNA片段在凝膠上的位置，并可在紫外燈下或經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察或拍照。線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系瓊脂糖凝膠的百分濃度（%）線狀DNA分子的有效范圍（Kb）0.360～50.620～10.710～0.80.97～0.51.26～0.41.54～0.22.03～0.1【器材】1．水平電泳槽；2．電泳儀；3．紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)【試劑】1．1%瓊脂糖；2．電泳緩沖液(1×TBE)；3．10mg/ml溴化乙錠(EB)；4．電泳樣品上樣緩沖液(6×)：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯腈，40%（W/V）蔗糖水溶液，在4