第2節(jié)基因工程的基本操作程序第3章基因工程棉鈴蟲棉鈴蟲（死亡）學習目標核心素養(yǎng)闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定。1.科學思維：結合生產(chǎn)實例，舉例說出基因工程的基本操作程序。2．科學探究：針對人類生產(chǎn)和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構想，完成初步設計。從社會中來

1997年，我國政府首次批準商業(yè)化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？

培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？棉鈴蟲（死亡）棉鈴蟲培育轉基因抗蟲棉的簡要過程：提取棉花細胞(含抗蟲基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因與運載體DNA拼接導入普通棉花(無抗蟲特性)棉花植株(有抗蟲特性)一、基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用。載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。前提核心關鍵保證（一）目的基因的篩選和獲取

1.目的基因概念：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因就是目的基因。

根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指編碼蛋白質的基因，如遇生物抗逆性、優(yōu)良品質、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關的基因。也可以是一些具有調控作用的因子。思考：Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理是什么？

當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響。抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產(chǎn)生危害？（一）目的基因的篩選和獲取知識回顧

請從DNA水平上給基因下一個定義，要求既能反映基因與DNA的關系，又能體現(xiàn)基因的作用。基因通常是有遺傳效應的DNA片段但一段DNA片段不一定是基因--ATGCATGCATCGATGCTAGCGATCGCTAAGCACAG-----TACGTACGTAGCTACGATCGCTAGCGATTCGTGTC---基因1基因2非基因片段非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子編碼區(qū)原核生物基因終止子補充知識：基因結構：非編碼區(qū)

組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游

功能：不能編碼蛋白質，調控遺傳信息的表達

啟動子：RNA聚合酶結合位點轉錄起始的信號

終止子：終止RNA的合成編碼蛋白質的合成加工轉錄mRNA前體成熟mRNA真核細胞的基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點外顯子內含子12345啟動子終止子補充知識：基因結構：（一）目的基因的篩選和獲取2.篩選Bt基因作為轉基因抗蟲棉的目的基因的原因用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑，廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關掌握了Bt基因的序列信息對Bt基因的表達產(chǎn)物--對Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因從相關已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因、人干擾素基因等。獲取目的基因的常用方法有哪些?（一）目的基因的篩選和獲取從基因文庫中尋找聚合酶鏈式反應（PCR）擴增化學合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知初始目的基因的來源1.從生物中直接獲取2.人工合成注意：要保持基因的完整性全稱：聚合酶鏈式反應。原理：DNA半保留復制。操作環(huán)境：體外（PCR擴增儀/PCR儀）。目的：對目的基因的核苷酸序列進行大量復制。優(yōu)點：可以在短時間內大量擴增目的基因。（1）PCR的概念：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。（一）目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因PCR擴增儀復制復制復制復制復制PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學獎。

如果說，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結構，標志著分子生物學時代的開啟，那么PCR技術則標志著分子生物學的騰飛。PCR技術的出現(xiàn)，徹底變革了生物化學、分子生物學、遺傳學、以及現(xiàn)代醫(yī)學等等。（一）目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因ATCGAATCGGTT

UACCTTAGCCAADNA聚合酶母鏈DNA子鏈DNA引物3′3′5′5′知識回顧---DNA復制過程(2)DNA體內復制的條件參與的組分在DNA復制中的作用DNA母鏈4種脫氧核苷酸解旋酶(體外用高溫代替）DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸體內復制的引物為RNA單鏈。一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。（一）目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因(3)DNA體外復制（PCR）的條件參與的組分在DNA復制中的作用DNA母鏈4種脫氧核苷酸90℃以上高溫耐高溫的DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸體外復制的引物一般為DNA單鏈。復制的原料實為dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同時水解產(chǎn)生能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加ATP。（一）目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因緩沖液（含Mg2+)：激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶不同的溫度：變性、復性和延伸需要不同溫度（4）PCR過程：（一）目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因

目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合；然后以單鏈DNA為模板在DNA聚合酶作用下進行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3’端，如此重復循環(huán)多次。

第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應的模板，經(jīng)過變性、復性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應的模板，經(jīng)過變性、復性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物……。（4）PCR過程：（一）目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因每次循環(huán)一般可以分為變性、復性、延伸三步。復性時不一定均為引物與DNA模板結合，也存在DNA解開的兩條單鏈的結合，因此一般在PCR實驗中引物的投入量遠大于產(chǎn)物量（但不能隨意加大濃度）；DNA模板4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶引物5'3'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'變性當溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。復性當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈結合。延伸當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。5'3'5'3'5'3'3'5'（4）PCR過程：（一）目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因TaqDNA聚合酶的應用

高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化。PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個脫氧核苷酸。PCR和細胞內復制的不同點？緩沖液需要為PCR反應提供的物質？DNA模板，四種脫氧核苷酸，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，Taq酶。關于PCR的幾點說明：思考：變性過程破壞的是哪種化學鍵？是否需要酶？氫鍵短單鏈核酸不需要，由dNTP水解供能。

DNA復制不能從頭開始，DNA聚合酶只能從引物的3'端延伸DNA鏈（DNA聚合酶只能催化單個核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羥基上）引物是什么？在復性過程中引物結合到模板鏈的哪一端？延伸過程是否需要ATP供能？PCR為什么需要引物？3’端不需要酶，需要90℃以上的高溫呈指數(shù)形式擴增（n次擴增循環(huán)后，DNA數(shù)量約為2n）（5）PCR結果：（一）目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因①n代后，DNA分子有_____個

②n代后，DNA鏈有_____條③第____代出現(xiàn)完整的目的基因

④n代后，含引物的DNA分子有_____個⑤n代后，共消耗_____個引物⑥第n代復制，消耗了______個引物⑦n代后，完整的目的基因有_____個2n2n+132n2n+1-22n2n-2nPCR技術與細胞內DNA復制的比較比較項目細胞內DNA復制PCR技術區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所主要在細胞核內細胞外(主要在PCR擴增儀內)酶解旋酶、DNA聚合酶等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）溫度細胞內溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進行結果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成思考：復性的過程一定是引物與DNA模板鏈結合嗎？復性時引物與DNA模板的結合是隨機的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結合，但兩條模板鏈重新結合的概率較低。原因是：①模板鏈一般比較長，比引物復雜得多，重新結合的概率較低。

②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的碰撞結合機會，遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞機會。用PCR可以擴增mRNA嗎？不能！由于RNA不穩(wěn)定，需要將RNA反轉錄為cDNA，然后再進行擴增。單鏈RNA逆轉錄酶雜交雙鏈DNA鏈RNA鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNAPCR擴增

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。①基因組文庫：含有一種生物的全部基因。②部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫。（1）基因文庫類型：（一）目的基因的篩選和獲取4.構建基因文庫來獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。（1）基因文庫類型：（一）目的基因的篩選和獲取4.構建基因文庫來獲取目的基因提取某種生物的全部DNA許多D一定大小的DNA片段導入受體菌中儲存用適當?shù)南拗泼盖袑NA片段與載體連接基因組文庫①基因組文庫的構建模式圖

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。（1）基因文庫類型：（一）目的基因的篩選和獲取4.構建基因文庫來獲取目的基因某種生物特定發(fā)育時期的mRNA單鏈互補DNA雙鏈DNA片段

反（逆）轉錄酶DNA聚合酶cDNA文庫②部分基因文庫的構建模式圖成熟mRNA與載體連接導入受體菌中儲存基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較

文庫類型cDNA文庫

基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內含子(位于編碼蛋白質序列的非編碼DNA片段）