選擇性必修三《生物技術與工程》第3章

基因工程

第2節

基因工程的基本操作程序第三課時

目的基因的篩選與獲取一目錄

基因表達載體的構建二

目的基因的檢測與鑒定四

將目的基因導入受體細胞三第四步：目的基因的檢測與鑒定知識要知道將表達載體導入受體細胞后，如何判斷導入是否成功？即使導入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達？1.分子水平檢測2.個體生物學水平鑒定

目的檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性。第四步：目的基因的檢測與鑒定知識要知道

1.檢測的內容和方法2.鑒定的目的和方法1.分子水平檢測③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因新知識自學(P82-83頁）抗原-抗體雜交PCR等技術檢測第四步：目的基因的檢測與鑒定知識要知道1.分子水平檢測③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因抗原-抗體雜交PCR等技術檢測蘇云金桿菌提取Bt毒蛋白注射抗體標記抗體轉基因棉花提取蛋白電泳分離抗原-抗體雜交第四步：目的基因的檢測與鑒定知識要知道

1.檢測的目的和方法

2.鑒定的目的和方法2.個體生物學水平鑒定新知識自學(P82-83頁）例：確定棉花是否賦予了抗蟲特性以及抗性的程度抗蟲植物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡抗鹽植物抗除草劑植物抗病毒（菌）植物獲取目的基因產物的轉基因生物用一定濃度鹽水澆灌正常生長鑒定方法成功標志噴灑除草劑正常生長病毒（菌）接種實驗未染病提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定知識要知道PCR儀DNA片段的擴增電泳裝置瓊脂糖凝膠電泳知識要知道探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理：PCR利用了

DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。一次PCR一般要經歷

30次循環。（1）DNA片段的擴增（2）DNA片段的電泳鑒定DNA在一定的pH下會帶上電荷，帶電的DNA會在電場的作用下向所帶電荷相反的電極移動，即電泳。PCR產物一般用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其在凝膠中的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子大小和構象（如鏈狀和環狀）等有關。凝膠中的DNA通過染色，可在300nm紫外燈下被檢測出來。知識要理解探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理：（2）DNA片段的電泳鑒定DNA在一定的pH下會帶上電荷，帶電的DNA會在電場的作用下向所帶電荷相反的電極移動，即電泳。PCR產物一般用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其在凝膠中的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子大小和構象（如鏈狀和環狀）等有關。凝膠中的DNA通過染色，可在300nm紫外燈下被檢測出來。DNA分子中的磷酸基團能解離出氫離子，剩下的部分（DNA的磷酸殘基）帶負電荷，因此DNA分子可從負極向正極遷移，知識要理解探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理：（2）DNA片段的電泳鑒定DNA在一定的pH下會帶上電荷，帶電的DNA會在電場的作用下向所帶電荷相反的電極移動，即電泳。PCR產物一般用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其在凝膠中的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子大小和構象（如鏈狀和環狀）等有關。凝膠中的DNA通過染色，可在300nm紫外燈下被檢測出來。電源

凝膠濃度越小，篩孔越大，DNA分子遷移速率就越高。

凝膠濃度相同時，DNA分子越大，遷移速率越低。知識要理解探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理：（2）DNA片段的電泳鑒定DNA在一定的pH下會帶上電荷，帶電的DNA會在電場的作用下向所帶電荷相反的電極移動，即電泳。PCR產物一般用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其在凝膠中的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子大小和構象（如鏈狀和環狀）等有關。凝膠中的DNA通過染色，可在300nm紫外燈下被檢測出來。知識要理解探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定（2）DNA片段的電泳鑒定DNA在一定的pH下會帶上電荷，帶電的DNA會在電場的作用下向所帶電荷相反的電極移動，即電泳。PCR產物一般用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其在凝膠中的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子大小和構象（如鏈狀和環狀）等有關。凝膠中的DNA通過染色，可在300nm紫外燈下被檢測出來。例1

、下列有關電泳的敘述，錯誤的是(

) A.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程 B.待測樣品中DNA分子的大小和構象、凝膠的濃度等都會影響DNA在電泳中的遷移速率C.進行電泳時，帶電分子會向著與其所帶電荷相同的電極移動

D.PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定C知識要理解探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定2.實驗過程：加樣孔→標準參照物：不同的已知大?。ㄩL度）的DNA片段；作用是便于確定待測泳道中DNA的大小。咱們來當一回偵探知識要知道探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定2.實驗過程：3.結果分析與評價：（1）你是否成功擴增出DNA片段的斷依據是什么？

在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細程度（條帶的分布代表擴增產物的類型；條帶的粗細代表擴增產物量的多少）。知識要知道探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定（2）.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因？

如果擴增不成功（沒有條帶），可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。

如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列結合（非特異性結合）；復性溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。

注意:P85①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。

②該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。

③在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。

④在進行操作時，一定要戴好一次性手套。

⑤PCR擴增不能隨意加大試劑用量。知識要理解探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定（1）PCR擴增目的基因時，復性溫度的設定是成敗的關鍵。復性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結合。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，假設引物的長度相同，在G、C含量高時，設定的復性溫度要高一些。因為DNA分子中G-C之間有3個氫鍵，A-T之間有2個氫鍵。4.關鍵點撥：（2）未出現擴增條帶的主要原因①

TaqDNA聚合酶失活。②

引物出現質量問題。③

Mg2＋濃度過低。④

變性時的溫度低，變性時間短。（3）出現非特異性擴增條帶的主要原因①

模板DNA出現污染。②

引物特異性不強或形成引物二聚體。③

Mg2＋濃度過高。④

復性時的溫度過低等。例題分析探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定例2：用PCR方法檢測轉基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如圖所示。據此做出分析不合理的是(

)A.PCR產物的分子大小在250至500bp之間B.3號樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號樣品對應植株不是所需的轉基因植株D.10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾B探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定例3．新型冠狀病毒是一種單鏈RNA病毒。新型冠狀病毒的核酸檢測采用“實時熒光定量RT—PCR”技術，通常在1～2h內即可得到檢測結果。此方法是PCR技術和熒光檢測技術的結合，利用熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行檢測分析。步驟如下：

(1)利用樣本中提取的RNA獲得cDNA，過程①使用________酶。需要將樣本中的RNA經過過程①形成cDNA后再進行PCR擴增的原因__________________________________________________。(2)PCR技術的原理是______________，一般要經歷三十多次循環，每次循環可以分為變性、復性和延伸三步，每一個步驟都要控制好相應的溫度，延伸的溫度________(填“高于”“低于”或“等于”)復性的溫度，而________(填“高于”“低于”或“等于”)變性的溫度。用PCR技術檢測目的基因是否轉錄出了mRNA例題分析探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定(3)過程②中對cDNA序列進行擴增，需設計兩種引物。下圖為cDNA的部分序列，請問兩種引物的結合位置是________。(4)在檢測過程中，隨著PCR的進行，反應產物不斷累積，“雜交雙鏈”熒光信號的強度也等比例增加，為了保證檢測結果的準確性，一般要達到或超過閾值時才能判定為陽性，最終確診。雖然RT—PCR技術是當前被廣泛認可的檢測手段之一，但仍然存在有“假陰性”現象，結合上述內容，分析可