第3章

基因工程第1節

重組DNA技術的基本工具第1課時

重組DNA技術的基本工具高中生物學|人教版（2019）|選擇性必修3·生物技術與工程基因工程指按照人們的愿望，進行嚴格的設計并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。基因工程的概念重組DNA技術基因DNA分子水平別

名：操作對象：操作水平：實

質：基因重組科技探索之路：基因工程的誕生和發展1.為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？①DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。②雙鏈DNA分子的空間結構都是規則的雙螺旋結構。2.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內表達？①基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。③生物界共用一套遺傳密碼。思考相同的遺傳信息在不同生物體內表達出相同的蛋白質。基因工程

科學家在培育發光植物時，需要在體外對螢火蟲、發光海藻等生物的相關基因“切割”、改造和“拼接”，將重組DNA分子導入植物體內，并使其表達。

DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。準確切割DNA分子將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導入受體細胞課程標準內容要求素養目標1.概述基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發展而來的。2．闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。1.科學思維：通過基因工程的誕生和發展生物學史的學習，認同科學發展的階段性和繼承性。2.科學思維：通過對基因工程三種基本工具特點，種類的學習，運用歸納與概括等方法，培養科學的思維習慣和能力。教學目標目錄CONTENTS限制性內切核酸酶——“分子手術刀”1DNA連接酶——“分子縫合針”2基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”3【探究·實踐】DNA的粗提取與鑒定4一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”限制性內切核酸酶切割DNA分子的工具是限制性內切核酸酶，又稱限制酶。主要從原核生物中分離純化出來的來源：數千種種類：能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。特點：（限制酶不是一種酶，而是一類酶）磷酸二酯鍵識別序列大多數是六個核苷酸序列EcoRISmaI5'5'3'3'5'5'3'3'一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”限制性內切核酸酶取自大腸桿(E.coli)，識別序列GAATTC，在G與A之間切割識別序列為CCCGGG，在G與C之間切割切口處是平整的，這樣的切口叫平末端。兩條單鏈的切口處，伸出幾個核苷酸，剛好能互補配對，這樣的切口叫黏性末端。

①主要起到切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的。

②原核細胞內DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”限制性內切核酸酶根據你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么？為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？思考EcoRⅠ

閱讀72頁資料卡“限制酶的命名”，說說EcoRⅠ各個字母的代表含義。大腸桿菌（Escherichiacoli）屬名（Escherichia）首字母種名（coli）前兩個字母R型菌株從中分離的第一個限制酶一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”拓展限制酶的命名例如：流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為：HindIHindIIHindIII一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”活動任務一：理解限制性內切核酸酶的作用

假設剪刀代表HindⅢ限制酶和SmaI限制酶（從5’→3’方向識別AAGCTT和CCCGGG序列，在A/A之間與C/G切割），嘗試用“分子手術刀”對以下片段進行剪切，并思考問題。片段一...TAGAATTCGCTGGAAAGCTTCGATCCGAC......ATCTTAAGCGACCTTTCGAAGCTAGGCTG...片段二...CTAAGCTTCACTTCAAGTCGCAAGCTTCT......GATTCGAAGTGAAGTTCAGCGTTCGAAGA...一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”活動任務一：理解限制性內切核酸酶的作用問題1：觀察剪開的DNA分子，限制酶切割一次可斷開幾個磷酸二酯鍵？產生多少個游離的磷酸基團？產生幾個黏性末端？消耗幾分子水？可斷開2個磷酸二酯鍵；產生2個游離的磷酸基團；產生2個黏性末端；消耗2分子水。問題2：將剪開的片段一分子旋轉180°，觀察產生的2個黏性末端堿基序列有什么特點？

中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。正向讀與另一條鏈反向讀的堿基順序完全一致。注：平末端也存在回文序列。一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”活動任務一：理解限制性內切核酸酶的作用問題3：現有2個不同來源的DNA片段A和B，若A片段用限制酶SpeⅠ進行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進行切割。各限制酶的識別序列和切割位點如下：一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”（1）請寫出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。（2）同種限制酶切割產生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產生的黏性末端是否一定不同？同種限制酶產生的黏性末端相同。不同的限制酶可能會形成相同的黏性末端。同尾酶：識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶構建載體時，切割位點的選擇范圍擴大。一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”（3）哪種限制酶切割B片段產生的DNA片段能與限制酶SpeⅠ切割A片段產生的DNA片段相連接？為什么？

限制酶XbaⅠ；（4）上述片段連接完成后，該重組DNA分子的新連接處能否再被所用的限制酶識別？為什么？

不能再被所用的限制酶識別；因為限制酶XbaⅠ與SpeⅠ切割產生了相同的黏性末端。

因為所用的兩種限制酶均不能識別該重組DNA分子的新連接處的脫氧核苷酸序列。一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”活動任務一：理解限制性內切核酸酶的作用問題4：圖中片段甲、乙分別用限制酶(EcoRⅠ)切割后得到的片段能否拼接，應該怎么處理？（注：EcoRⅠ的識別序列為GAATTC，且在G/A之間切割DNA分子）TGAATTCGACTTAAGCAGAATTCTTCTTAAGA完全互補的黏性末端能通過氫鍵暫時連接在一起，但并不穩定。缺口怎么辦？思考限制性內切核酸酶——“分子手術刀”1DNA連接酶——“分子縫合針”2目錄CONTENTS基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”3【探究·實踐】DNA的粗提取與鑒定4二、DNA連接酶——”分子縫合針“DNA連接酶作用將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。類型類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源作用區別大腸桿菌都能將雙鏈DNA片段“縫合“起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵。T4噬菌體只能連接互補黏性末端的DNA片段黏性末端和平末端均能連接，但連接平末端的效率相對較低二、DNA連接酶——”分子縫合針“活動任務二：區別DNA連接酶和DNA聚合酶問題：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？5′3′TACGTACTGAAT5′3′切口DNA聚合酶DNA連接酶二、DNA連接酶——”分子縫合針“活動任務二：區別DNA連接酶和DNA聚合酶DNA連接酶的作用注意：①DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA。②DNA連接酶作用沒有特異性。二、DNA連接酶——”分子縫合針“活動任務二：區別DNA連接酶和DNA聚合酶DNA聚合酶的作用DNA聚合酶DNA聚合酶只能將單個核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，形成磷酸二酯鍵。二、DNA連接酶——”分子縫合針“歸納

比較一：比較DNA連接酶和DNA聚合酶類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶不同點作用催化________________與已有脫氧核苷酸鏈片段連接，形成____________。

催化兩個____________之間形成_____________。

作用結果催化形成與模板鏈互補的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有______黏性末端或平末端的__________連接起來，形成_____________。模板__________________相同點①化學本質都是______________；②都是催化形成_____________。

單個脫氧核苷酸兩個DNA片段磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵互補DNA片段重組DNA分子蛋白質磷酸二酯鍵需要不需要二、DNA連接酶——”分子縫合針“歸納

比較二：比較核酸有關的幾種酶項目DNA連接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵磷酸二酯鍵作用對象DNA片段DNA單個脫氧核苷酸DNADNA作用結果將兩個DNA片段連接成完整的DNA分子切割雙鏈DNA分子將單個脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸目錄CONTENTS限制性內切核酸酶——“分子手術刀”1DNA連接酶——“分子縫合針”2基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”3【探究·實踐】DNA的粗提取與鑒定4三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”

要讓熒光基因在植物體內表達，需將這個基因送到植物細胞內去，能將外源基因送入受體細胞的工具是什么？噬菌體三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”基因進入受體細胞的載體作用：將外源基因送入受體細胞。種類動植物病毒噬菌體質粒（最常用）質粒：裸露、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA外，具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA。動物病毒三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”基因進入受體細胞的載體最常用的載體——質粒DNA復制的起始位點，并帶著插入的目的基因一起復制。復制起始位點四環素抗性基因氨芐青霉素抗性基因作為標記基因，可用含青霉素的培養基鑒別。不能被酶切破壞便于重組DNA篩選與鑒定。限制酶切割位點注意：真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”活動分析歸納載體需要具備的條件問題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？條件①：具有一個或多個限制酶切割位點。條件②：能在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。條件③：具有標記基因，便于重組DNA分子的篩選。條件④：載體DNA必須是安全的，不會對受體細胞有害。問題2：要使攜帶的外源基因在受體細胞中穩定存在，載體需要具備什么條件？問題3：我們用肉眼看不到載體是否進入受體細胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？條件原因①穩定存在并能自我復制或整合到受體DNA上②有一個至多個限制酶切割位點③具有特殊的標記基因④無毒害作用三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”活動分析歸納載體需要具備的條件能使目的基因穩定存在且數量可擴增可攜帶多個或多種外源基因便于重組DNA分子的篩選對受體細胞無毒害作用，避免受體細胞受到損傷三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”活動重組DNA分子的模擬操作

請根據圖3-3中的相關信息找到兩條片段上EcoRI

的識別序列和切割位點。然后，用剪刀進行“切割”。待切割位點全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來。…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG1.根據示，應選限制酶___________________切割來構建重組質粒。2.用圖中外源DNA和質粒構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割，是_______________________________________________。3.使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割，而不用EcoRⅠ一種限制酶切割，是為了防止

________________。三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”應用HindIII和BamHISmaⅠ會破壞抗性基因和外源DNA中的目的基因目的基因、質粒自身環化及反向連接重組DNA分子的構建拓展：標記基因的篩選原理載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性。在含有該抗生素的培養基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞。課堂小結限制酶DNA連接酶載體①能自我復制或能整合到宿主DNA上②有一個至多個限制酶切割位點③有特殊的標記基因④對受體細胞無害質粒、噬菌體、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種

類:磷酸二酯鍵來

源：主要來源于原核生物特

點：作用部位：具有專一性結

果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種

類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作

用：把兩條雙鏈DN