第一節獲得純種微生物是發酵工程的基礎第1章發酵工程選擇性必修3學習目標1、歸納和概括微生物所需營養物質和生長條件，進一步形成結構與功能等生命觀念，并能基于這些觀念設計合適的培養基，選擇合適的培養和計數方法，有目的地培養純種微生物。2、歸納和概括無菌技術對微生物研究和發酵的影響，闡釋無菌技術的方法和應用。3、關注微生物特定功能在生產和生活中的應用。了解發酵工程：

帶有酸味的醋、含苦味的啤酒、氣味芳香的白酒，都是由谷物發酵而來，卻能形成口味截然不同的產品，這都源于微生物的奇妙作用。

人們利用微生物發酵制作食品的歷史悠久，在此基礎上發展而來的發酵工程技術則利用微生物大規模生長和代謝活動生產出更多有價值的產品。微生物是發酵工程的靈魂，不同產品的發酵生產需要使用不同來源、不同種類的微生物。

青霉素是人類最早發現的抗生素，現在抗生素的種類已達數千種，臨床上常用的也有上百種。這些抗生素都是由不同種類的微生物產生的。材料閱讀：抗生素的生產菌種思考與討論：1.欲大量生產抗生素，就要大規模培養對應菌種的微生物，微生物的培養需要滿足哪些條件？2.自然界中的微生物種類繁多，而且常常生活在一起，如何才能分離得到生產所需的純種微生物？1．培養基為微生物提供所需營養物質微生物需要的營養物質

分離、純化和培養微生物是研究和利用微生物的前提。微生物的生存和生長依賴于適宜的營養物質和生長環境。

培養基是一種由人工配制的適合微生物生長、繁殖并產生代謝產物的營養基質。

微生物生長所需的營養物質碳源

碳源物質在細胞內經過一系列復雜的化學變化后，成為微生物自身的結構物質和代謝產物。

自養微生物：能夠利用CO2為唯一或主要碳源。

異養微生物：則利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉和纖維素等有機碳源。葡萄糖、大豆油和甘油是該培養基中的碳源。

微生物生長所需的營養物質氮源

氮源物質主要用于合成細胞中的蛋白質、核酸等，一般包括蛋白質及其不同程度的降解產物，如蛋白胨（多肽混合物）、氨基酸，以及尿素、銨鹽、硝酸鹽等。該培養基中的氮源由酪蛋白和玉米漿提供。

微生物生長所需的營養物質生長因子

定義：通常是指微生物自身不能合成或合成量不足，但又是微生物生長和代謝所必需的小分子。

種類：某些維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。

來源：酵母浸粉、牛肉浸膏或植物組織提取液等天然物質中含有不同的生長因子。不需要生長因子的微生物，培養基中的生長因子由玉米漿提供。

微生物生長所需的營養物質無機鹽

無機鹽一般有磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物以及含鈉、鉀、鈣、鎂等元素的化合物。

微量元素：鋅、錳、鉬、鐵、銅等

微量元素往往存在于天然有機物、自來水等物質中，一般不需要特別添加。該培養基中的KH2PO4是微生物生長和代謝所需要的無機鹽。

微生物生長所需的營養物質水

水是微生物生長和代謝必不可少的營養物質。

微生物生長所需的營養物質

選用或設計培養基首先要考慮選擇適宜的營養物質。由于微生物具有不同的營養類型，對營養物質的要求也各不相同，且不同微生物生長、繁殖和代謝產物積累所需的pH也不相同。因此，必須根據各種微生物的特點及實驗目的選用合適的培養基。培養基的類型：

根據成分來源、物理狀態和基本用途，可對培養基進行不同的分類。培養基的類型枯草桿菌根據培養基的成分來源分類：

天然培養基含有蛋白族、牛肉有和酵母浸粉等化學組成不確定的成分,如培養常見維菌的牛肉音蛋白膜培養基。合成培養基是由化學版分完全確定的物質配制面成的培養基。根據培養基的物理狀態分類：

根據瓊脂加人量的不同,培養基呈現不同物理狀態：半固體培養基加人量為0.3%-0.7%，固體培養基加人量為1.5%-2.0%。液體培養基常用于微生物的大量培養，半固休培養基可用于觀察微生物的運動和分類鑒定等，固體培養基常用于微生物分離、鑒定、計數和菌種保存等。根據培養基的基本途徑分類：通用培養基營養物質齊全，可以滿足多種微生物的營養需求。選擇培養基有利于目的微生物生長，使其成為優勢菌，從而抑制雜菌生長，如僅以纖維素為碳源的培養基可用來篩選土壤中產纖維素分解酶的微生物。鑒別培養基用于區分和鑒定不同微生物，如大腸桿菌在伊紅美藍培養基上的菌落呈現金屬光澤的紫黑色。根據培養基的不同分類：

用于工業生產的發酵培養基的原料還應具備來源豐富、價格低廉、質量穩定等特點。例如，常用的碳源有葡萄糖、蔗糖和淀粉水解物等，常用的氮源有玉米漿、黃豆餅粉和各種蛋白水解物等。2．無菌技術是微生物研究和發酵工程的基礎無菌技術

在微生物發酵培養中，一般使用的是經過分離篩選獲得的純種微生物，全過程不能有雜菌污染，而且所用的微生物也不允許污染環境。這種防止純種微生物被其他微生物污染，且自身也不污染操作環境的技術稱為無菌技術。消毒和滅菌的區別

消毒：采用較溫和的理化條件，僅殺死物體內外一部分對人體或動植物有害的病原菌，但對被消毒的對象基本無害。

常用消毒方法：煮沸消毒法、巴氏消毒法（不耐高溫物體如牛奶）、和化學藥物消毒（酒精擦拭雙手、氯氣消毒水源）。消毒和滅菌的區別

滅菌：采用強烈的理化條件使物體內外的一切微生物（包括芽孢）喪失其生長繁殖能力的措施。

常用滅菌方法有：

①高溫滅菌：高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌（火焰灼燒和烘箱干燥滅菌）

②過濾滅菌（將含菌的液體或氣體通過高溫滅菌的過濾介質，阻截其中的微生物，以達到除菌）

③輻射滅菌（利用電離輻射或紫外輻射等殺滅微生物）為了確保微生物實驗操作過程中不污染雜菌，還需要人為提供一個無菌區域。進行微生物實驗操作時，操作者的衣著和手需進行清潔和消毒；實驗結束時，也一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養基丟棄前，一定要進行滅菌處理，以免污染環境。無菌區域探究·實驗：1-1酵母浸粉胨葡萄糖培養基的配制▲實驗目標：

學習和掌握配制培養基的一般方法和步驟。▲實驗原理：

培養基一般含有微生物所必需的營養物質。酵母浸粉胨葡萄糖培養基中的葡萄糖主要提供碳源，蛋白胨和酵母浸粉主要提供氮源和生長因子。該培養基常用于酵母的培養。▲材料器具：

燒杯、250mL三角燒瓶、三角燒瓶塞、量筒、培養皿、玻璃棒、牛皮紙、紗布、線繩、精密pH試紙、酒精燈、火柴、記號筆、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液、可加熱的磁力攪拌器、天平、滅菌鍋、注射器、無菌過濾器、超凈工作臺等。探究·實驗：1-1酵母浸粉胨葡萄糖培養基的配制▲實驗步驟：

1.稱量：稱量配制500mLYPD培養基所需的酵母浸粉5g、蛋白胨10g、瓊脂10g。單獨配制20%葡萄糖溶液50mL，備用。

2.溶解：在燒杯中加入酵母浸粉和蛋白胨，并加入約250mL蒸餾水，攪拌均勻，在磁力攪拌器上加熱溶解后，再加入瓊脂并使之熔化。加熱過程中需控制溫度，并用玻璃棒不斷攪拌。待瓊脂充分熔化后，停止加熱，補水至450mL。

3.調整pH：用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液將pH調至6.5。探究·實驗：1-1酵母浸粉胨葡萄糖培養基的配制▲實驗步驟：

4.分裝：將燒杯中的培養基趁熱倒入250mL三角燒瓶中，每瓶加量約90mL，注意不要把培養基沾到瓶口。用瓶塞和牛皮紙包扎封口。

5.滅菌：將上述培養基與洗凈、干燥并包扎好的培養皿一起放入滅菌鍋于121℃滅菌20～30min。探究·實驗：1-1酵母浸粉胨葡萄糖培養基的配制▲實驗步驟：

6.倒平板：在超凈工作臺中，將葡萄糖溶液用無菌過濾器除菌后，加入冷卻至50℃左右的培養基中（每90mL培養基加入10mL）。混勻后，右手持三角燒瓶，左手將瓶塞拔出并用小拇指夾住，瓶口保持對著酒精燈火焰。然后，左手拿培養皿，將皿蓋在火焰附近打開一縫，用酒精燈火焰迅速燒瓶口后，往培養皿中倒入約15mL培養基。加蓋后小心晃動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部。最后，將培養皿平置于臺面上，待凝固后即為平板。探究·實驗：1-1酵母浸粉胨葡萄糖培養基的配制▲結果分析：

1.通過什么證據可判斷你制作的培養基平板沒有被污染？

2.培養基平板若出現冷凝水，會對微生物的分離純化產生什么影響？在本實驗過程中，你是采取什么方法來防止冷凝水出現的？

未接種的培養基在恒溫箱中保溫一段時間后,如果無菌落生長,說明培養基制備成功、合格,未受到污染。

冷凝水倒流污染培養基分離和純化微生物常用平板劃線法和稀釋涂布平板法微生物的分離和純化

從混雜的微生物群體中，獲得只含有某一種或某一株微生物的過程，常用平板劃線法和稀釋涂布平板法。

平板劃線法是通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的微生物細胞逐步稀釋分散到培養基的表面的方法。在數次劃線后培養，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，即菌落。

稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養基表面的方法。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個菌落。探究·實驗：1-2酵母的分離和純化▲實驗目標：

1.學會平板劃線法和稀釋涂布平板法的操作方法。

2.學會觀察與區分平板劃線法和稀釋涂布平板法的實驗結果。▲實驗原理：

通過平板劃線法和稀釋涂布平板法，使微生物在固體培養基上生長，形成由單個細胞繁殖而成的單菌落，從而可以挑取這種單菌落獲得純種培養物。▲材料器具：

酵母液、接種環、涂布棒、移液器、0.1mL和1mL無菌移液器吸頭、酒精燈、火柴、試管、試管架、超凈工作臺、酵母浸粉胨葡萄糖培養基平板等。▲實驗步驟：微生物的平板劃線1.點燃酒精燈，將接種環在火焰上灼燒滅菌。2.拔掉盛有酵母液的三角燒瓶塞，使三角燒瓶口迅速通過火焰后將冷卻的接種環伸入酵母液中蘸取一環酵母液，再次將三角燒瓶口通過火焰后塞上瓶塞。3.小心揭開培養皿蓋，以能使接種環輕松進入為宜。將接種環上的酵母液在平板邊緣的一塊區域連續劃“之”字線，然后燒去接種環上的殘余菌液，待冷卻后，從第1區域劃線的末端開始往第2區域內劃線，繼續在第3區域內重復以上操作。劃線時一定要輕，不要劃破培養基。探究·實驗：1-2酵母的分離和純化▲實驗步驟：微生物的稀釋涂布1．酵母液的稀釋（1）取6支試管，分別加入9mL生理鹽水后封口，按101~106的順序編號，滅菌。（2）用移液器吸取1mL酵母液，注入101倍稀釋的試管中，混合均勻。（3）從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，混合均勻。依此類推，直到完成最后一支試管106倍的稀釋。探究·實驗：1-2酵母的分離和純化▲實驗步驟：2.涂布方法（1）將涂布棒浸在盛有75%酒精的燒杯中。（2）用移液器吸取0.1mL稀釋倍數為104倍的酵母液，滴加到培養基平板表面的中央。（3）取出沾有少量酒精的涂布棒快速穿過火焰，待酒精燃盡后，冷卻幾秒鐘。（4）用涂布棒將酵母液均勻地涂布在整個平板的表面，確保整個平板的表面都被覆蓋。（5）另取培養基平板，重復上述操作，分別涂布105和106兩個稀釋倍數的酵母液。探究·實驗：1-2酵母的分離和純化▲實驗步驟：微生物的培養和菌落的觀察

將劃線和涂布后的平板以及一個未涂布的平板都置于30℃恒溫培養箱中，倒置培養24h和48h后，分別觀察并記錄結果。▲結果分析：

1.平板劃線法和稀釋涂布法培養的結果有何異同？

2.采用什么措施能確保獲得單菌落？探究·實驗：1-2酵母的分離和純化

不同微生物在特定培養基上生長、繁殖所形成的菌落特征有很大差異。而同一種微生物在一定條件下培養，其特征往往有一定的穩定性，由此可以對不同微生物加以鑒別。菌落特征是衡量菌種純度、辨認和鑒定菌種的重要依據。菌落特征取決于組成菌落的細胞結構和生長行為。特征描述一般包括：菌落的大小、形態、顏色、透明度、隆起狀態、邊緣特征等。菌落形態大小也受到鄰近菌落的影響。菌落靠得太近，則有限的營養物質、有害代謝物的分泌與積累使菌落生長受到抑制。此外，培養時間的長短也會影響菌落應有特征的表現。廣角鏡：根據菌落特征區分微生物4．測定微生物數量可間接了解微生物的生長狀況

微生物的生長與繁殖分別表現為細胞物質的增加和細胞數量的增加。測定微生物細胞數量可以間接了解微生物的生長狀況，常用方法是稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法。①稀釋涂布平板法

計算公式：每克樣品中的菌株數＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數。

操作：一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。4．測定微生物數量可間接了解微生物的生長狀況②顯微鏡計數法（血細胞計數板）

顯微鏡計數法是利用血細胞計數板在顯微鏡下直接觀察微生物細胞并進行計數的方法。

顯微鏡直接計數也是測定微生物數量的常用方法，但它不能區別死細胞或活細胞，對活動能力強的活細胞也難以計數。探究·實驗：1-3土壤中分解尿素細菌的分離與計數▲實驗目標：

學會從土壤中分離得到分解尿素細菌的方法；通過計數，統計1g土樣中分解尿素細菌的數量。▲實驗原理：

若培養基中唯一的氮源是尿素，那么只有能合成脲酶的細菌才能分解尿素，以尿素作為氮源。無法合成脲酶的其他微生物則由于缺乏氮源而不能生長、繁殖。所以，用這種選擇培養基就能從土壤微生物中分離出分解尿素細菌。▲材料器具：

土壤樣品、燒杯、量筒、250mL和100mL三角燒瓶、三角燒瓶塞、15mm×150mm試管、試管架、培等。探究·實驗：1-3土壤中分解尿素細菌的分離與計數▲實驗步驟：一、配制培養基

1.參照表1-3，配制500mLLB瓊脂培養基，滅菌，制作平板。

2.參照表1-4，配制500mL尿素瓊脂培養基，滅菌后待冷卻至60℃時，加入過濾除菌后的10mL尿素溶液（內含0.5g尿素），搖動，混合均勻后，制作平板。二、制備細菌懸液

在無菌條件下，將10g土樣加到有90mL無菌水的三角燒瓶中，振蕩10min，即成101倍土壤稀釋液。依次用試管