PCR儀第2節基因工程的基本操作程序第3章基因工程瓊脂糖凝膠電泳裝置學習目標核心素養闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定。1.科學思維：結合生產實例，舉例說出基因工程的基本操作程序。2．科學探究：針對人類生產和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構想，完成初步設計。1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？到社會中去

科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。2.科研工作者在沒有發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉入了一種Bt基因，抗性比較單一；現在經常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時轉入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產生和發展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉基到社會中去因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉基因棉花，或在轉基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學殺蟲劑的非轉基因棉花；在印度，一些地區要求，在轉基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉基因棉花。我國除新疆棉區及大型農場需設計專門的庇護所外，其他棉區如長江、黃河流域棉區多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構成天然的庇護所，一般無須種植非轉基因棉花作為庇護所。這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環境，始終保持一定的敏感目標害蟲種群。這樣，即使目標害蟲對轉基因抗蟲棉產生了抗性，但是因為其與敏感目標害蟲交配，后代抗性基因會發生分離，所以抗性目標害蟲的種群也不至于迅速增加。（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區種植管理、加強抗性監測、進行嚴格的安全生評價等。到社會中去思考：如何利用PCR技術檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否轉錄出mRNA？

提取受體細胞的DNA，設計一對引物，可以一個與染色體DNA互補結合，另一個引物與目的基因互補結合，這樣只有以重組DNA為模板才能獲得擴增產物（也可以都跟目的基因互補結合，這樣只有含有目的基因，才能獲得擴增產物），之后再進行電泳檢測；

提取受體細胞的mRNA，進行逆轉錄，獲得cDNA，用上述方法進行PCR擴增，之后再進行電泳檢測。探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理：（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。（2）PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理。一次PCR一般要經歷30次循環。2.DNA片段電泳鑒定的原理：（1）DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。（2）PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象（遷移速率與之呈負相關）等有關。探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理（3）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。DNA片段電泳鑒定的原理的說明：

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。

在電泳開始時使用低壓有利于條帶清晰，是因為點樣之后樣品內分子是胡亂排列的，加上電壓之后才統一方向排列好。

電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段。探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。DNA片段電泳鑒定的原理的說明：探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理

電泳緩沖液類似色素提取的層析液，點樣孔通常位于電極的負極端，由于DNA分子在緩沖液中帶負電荷，在電場中DNA便向正極端移動，從而分離出大小不同的DNA片段。

DNA電泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。

凝膠中的DNA分子通過染色，在波長為300nm的紫外燈下才能被檢測出來。DNA片段電泳鑒定的原理的說明：探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理(1)PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）(2)微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）(3)微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）(4)一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）(5)電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）(6)4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板

DNA、擴增緩沖液、無菌水。(7)電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、

瓊脂糖和核酸染料等。探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定二、材料用具10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μLPCR反應體系的配方(一）DNA片段的擴增1、移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定三、方法步驟2、離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）。(一）DNA片段的擴增探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定三、方法步驟3、反應：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環程序變性復性延伸預變性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min可根據目的片段長度適當調整延伸時間預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。1、配制瓊脂糖溶液

根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。2、制備凝膠（1）將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。（3）將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。（2）待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。電泳緩沖液用來維持PH值，使DNA帶負電荷。（二）DNA片段的電泳鑒定探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定三、方法步驟梳子孔為加樣孔，加樣孔側連電極負極。3、加樣

將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。4、電泳：

接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。凝膠載樣緩沖液類似層析液（二）DNA片段的電泳鑒定探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定三、方法步驟5、觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。（二）DNA片段的電泳鑒定探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定三、方法步驟1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定四、實驗注意五、結果分析與評價1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的