第2節動物細胞工程二動物細胞融合技術與單克隆抗體河北峰峰第二中學一、動物細胞融合技術概述1.概念：使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。2.結果：形成的雜交細胞具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息。3.原理：細胞膜具有一定的流動性5.意義：突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能

4.誘導融合的常用方法：PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法。6.應用：（1）細胞融合技術已經成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。（2）利用動物細胞融合技術發展起來的雜交瘤技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。相關信息1.“滅活病毒”中滅活的具體含義是什么？

用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構2.滅活病毒誘導細胞融合的原理是什么？

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導細胞融合的方法細胞融合成功的標志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能2025/4/6動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較二、單克隆抗體的制備1.早期獲得抗體的方法向動物體內反復注射某種抗原從動物血清中分離所需抗體產量低、純度低、特異性差缺點：2.單克隆抗體(1)概念：化學性質單一、特異性強的抗體(2)制備：理論基礎：每一個B細胞只分泌一種特異性抗體。B淋巴細胞不能無限增殖

克隆單一的B淋巴細胞，得到的細胞群就能分泌出化學性質單一、特異性強的抗體制備思路：困難：米爾斯坦科勒

由于發明了單克隆抗體的制備技術，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學或醫學獎大膽設想：B淋巴細胞骨髓瘤細胞（能產生抗體）（能大量增殖）融合細胞（既能產生抗體，又能大量增殖）單克隆抗體制備的過程：2025/4/6注射特定的抗原培養骨髓瘤細胞從脾中提取B淋巴細胞多種骨髓瘤細胞誘導融合將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合能產生抗體，但不能大量增殖不能產生抗體，但能大量增殖PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法單克隆抗體制備的過程：多種雜交細胞：未融合的細胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次篩選：用特定的選擇培養基在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長雜交瘤細胞：（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）第二次篩選：克隆化培養、抗體檢測（可進行多次）抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（分泌的抗體能與特定抗原結合）每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞克隆化培養多孔細胞培養板（能產生所需抗體的雜交瘤細胞）單克隆抗體制備的過程：抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（分泌的抗體能與特定抗原結合）注射到小鼠腹腔內體外培養單克隆抗體從細胞培養液中提取從小鼠腹水中提取（能產生所需抗體的雜交瘤細胞）第一次篩選第二次篩選原因方法結果誘導融合后得到的細胞中，除雜交瘤細胞之外，還有未融合的親本細胞，也有融合的具有同種核的細胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經第一次篩選之后獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞用特定的選擇培養基進行篩選用96孔板培養，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下，進行克隆化培養和抗體檢測（進行多次篩選）篩選獲得雜交瘤細胞獲得足夠數量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞兩次篩選的比較2025/4/62025/4/6應用到的技術：原理：

細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖多種雜交細胞及未融合的細胞誘導

融合小鼠骨髓瘤細胞多種B淋巴細胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細胞第一次篩選用特定的選擇性培養基第二次篩選足夠數量的能產生所需抗體的雜交瘤細胞體外培養注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體克隆化培養、抗體檢測（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）（產生抗體）（能無限增殖）從腹腔液中提取從培養液中提取歸納：（可進行多次）動物細胞融合、動物細胞培養單克隆抗體的應用資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。資料2使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。抗體-藥物偶聯物（antibody-drugconjugates,ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)三部分組成，它的作用機制如下圖所示。抗體藥物接頭ADC被細胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細胞凋亡1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？討論

抗體主要發揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；

藥物發揮治療效應，如殺傷靶細胞2.除了細胞毒素，還有哪些物質理論上可以作為ADC偶聯的藥物？3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優勢？①可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療；②一些作用于細胞信號轉導通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行治療①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養、冷凍保存和復蘇利用，有利于控制產品的質量和標準化生產診斷試劑盒；②ADC能夠協同發揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優點4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應用？你可以課后搜集資料，然后以“單克隆抗體在臨床上的應用”為主題，出一期黑板報或制作電子板報宣傳相關知識。

單克隆抗體在臨床上的應用涉及治療、診斷等方面。單克隆抗體藥物已被廣泛用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，如利妥昔單抗被用于治療復發難治的低分化B細胞淋巴瘤；曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。在臨床診斷方面，單克隆抗體被廣泛用于-些感染性疾病的檢測、腫瘤的診斷、激素和細胞因子的測定等。以單克隆抗體在診斷腫瘤方面的應用為例，用放射性同位素或熒光標記抗腫瘤表面抗原的單克隆抗體，可以用這些抗體來對體內的腫瘤進行定位，輔助診斷并確定腫瘤的復發與轉移等。

單克隆抗體能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發生特異性結合，并且可以大量制備。

利用同位素或熒光標記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病三、單克隆抗體的應用1.單克隆抗體的優點：2.單克隆抗體的應用（1）廣泛用作診斷試劑實例：