DB35DB35/T1854—2019蜜蜂以色列急性麻痹病毒病診斷技術DiagnostictechniquesforIsraeliacuteparalysisvirusofhoneybees福建省市場監督管理局發布I 1 1 1 1 2 2 5 7 8 91GB/T6682—2008分析實驗室RT-PCR：逆轉錄聚合酶鏈式反應（ReverseTranscriptionPolymeraTBE：三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（TrihydroxymethylAminomethane-BoricAcid-以色列急性麻痹病毒病是由IAPV引起的一種常見的蜜蜂病毒病，可侵染各個發育時期的蜜蜂個體IAPV屬于小核糖核酸病毒總科（Picornaviridae），病毒基因組是由9的兩個開放讀碼框被一個由184個核苷酸組成的基因間區域分開。靠5′端的開放讀碼框編碼翻譯與RNA譯用于加工不同衣殼蛋白的、由944個氨基酸組成的結構性多聚蛋白。IAPV有兩個內核糖體進入位點，一個位于5′端非翻譯區，另一個位于兩個開放閱讀框之間的基因間區域，在衣殼蛋白的起始翻譯合成25.1.2在巢脾上只剩下蜂王、幼蟲和一些未成年工蜂以及花粉等殘留食物，且在蜂箱內并無5.1.3蜜蜂個體感染早期腹部、胸部逐漸變黑，翅膀顫抖，在蜂箱外的空地上轉圈，既不采6.1.1.8冰箱（2℃~8℃和-80℃)。3探針IAPV-P序列為5′-FAM-CGGAACGCCGCATGTGTTACCA-BHQ1-3′。應2℃~8℃保存；若樣品24h內不能送達實驗室，則應-20℃或更低溫度保存。選取不超過200mg～300mg待鑒定幼蟲蟲體或成蜂蜂體，置于D清洗；4℃,10000r/min離心10min，棄上清液，沉淀室溫干燥5min；加20μLDEPC水溶解RNA沉4/3/后加入樣品孔中進行電泳。在電泳時設立D使用凝膠成像分析系統觀察核酸條帶并判斷結果，經核酸擴增電泳后如出現一條大小約270bp的DNA片段，應對其切膠回收后進行測序，也可直接送PCR產物進行測序，參考序列參見附錄B，同源性達待檢樣品經核酸擴增電泳后，在大小約270bpDN5//變性2min；之后95℃變性15s，60℃退火30s，收集熒光陽性對照樣品有對數擴增曲線，而且Ct值≤30；陰性對照和空白對照無擴增曲線，而且Ct值＞4067溶液的配制三羥甲基氨基甲烷（Tris）54.0g8 aaggctcagctaggatgacacgcctgtacactgtcgacattagttaagttacaattacacgtcttttgccggtcaactgattatgatttttgtataacgacaaacagtgatgaactgtataactcatcaataacaaaatggattctatcttgatcgaagtctagtagatccccaatatagccctgaaaagcttgagggacgagatagctctataaatactagtggacgaagcgagttccgtattgtgtacgttgggagtattgctttcttgttgtgaatcaccagg