ICS:11.120.99C10/29團體標T/CACM0132016金銀花快速PCR鑒定QuicklyPCRidentificationofLoniceraeJaponicaeFlos2016-12-12發布2016-12-12實施中華中醫藥學會發布前言 2規范性引用文件 3術語和定義 5儀器設備 6試劑和溶液配制 7檢驗程序 8結果判定 9結果報告 本標準的全部技術內容為推薦性。本標準是對《中華人民共和國藥典》標準的補充。本標準由中華中醫藥學會歸口。本標準起草單位:中國中醫科學院中藥資源中心、國藥種業有限公司。本標準主要起草人:袁媛、黃璐琦、蔣超、趙玉洋、周駿輝、何雅莉、王繼永。請注意本標準的某些內容有可能涉及專利,本標準的發布機構不應承擔識別這些專利的責任。1金銀花快速PCR鑒定本標準規定了使用快速PCR鑒定金銀花藥材和飲片、種子種苗的通用方法和要求。本標準適用于金銀花藥材和飲片、種子種苗鑒定。2規范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。《中華人民共和國藥典》GB/T6682《分析實驗室用水規格和試驗方法》GB/T23632《進境植物檢疫截獲有害生物鑒定復核規程》GB/T27403《實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測》GB/T3543.1《農作物種子檢驗GB/T3543.5《農作物種子檢驗規程真實性和品種純度鑒定》3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。按一定規則取自某一整體的一個或多個部分,并能反映該整體的相關信息,可以作為判斷該整體的基礎。從樣品中提取出DNA的方法。通過一定技術使一段特定的DNA片段拷貝數增加的過程,可通過聚合酶鏈式反應擴增技術實現。聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction(PCR)模板DNA先經高溫變性為單鏈,兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應的一段互補序列發生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四種脫氧核糖核酸(dNTP)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復變性、退火和延伸這一循環,使位于兩段已知序列之間的DNA片段拷貝數呈幾何倍數增長。其擴增產物可通過多種特異性和敏感性好的方法進行檢測。一般使用對照樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產物檢測過程,用于證明鑒定過程可獲得目標核酸片段的操作。使用常見偽品藥材代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產物檢測過程。2以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產物檢測過程,用以證明提取過程中沒有核酸污染。對照樣品包括對照藥材和種子種苗對照樣品。種子種苗對照樣品是由中藥材種子種苗標準起草單位提交,經全國中藥材種子(種苗)標準化技術委員會認定并保存,與品種名稱相符的種子種苗樣品。金銀花快速PCR鑒定應采用抽取有代表性的送檢樣品與對照樣品比較的驗證方式,即依據金銀花特異性DNA位點差異,使用單核苷酸多態性標記法進行鑒定。利用堿裂解法提取金銀花模板DNA,以提取的DNA為模板進行PCR擴增,熒光檢測或瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。5儀器設備所有制備樣品使用的器具在使用前應滅菌處理。5.1PCR儀使用前應進行溫度校準。5.2手持式紫外燈5.3連續可調微量移液槍5.4保溫設備6試劑和溶液配制除另有規定外,實驗試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑;實驗用水符合GB/T6682的要求;所配制的試劑均應滅菌后保存,并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期和配制者姓名;PCR試劑應小量分裝保存以減少污染;材料及試劑的保存都應有防污染措施。含有0.5mol/L氫氧化鈉(NaOH)、1%聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)、1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)溶液:在800mL去離子水中溶解26.2中和緩沖液含有0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)溶液,pH值為8.0:在800mL去離子水中溶解12.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris),冷卻至室溫后用濃鹽酸調節溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。6.3dNTP混合液6.520%PVP溶液在80mL去離子水中溶解20.0gPVP-40,加水定容至100mL,分裝后濾過除菌,冷卻后-20益3保存。在80mL去離子水中溶解1.0gBSA,加水定容至100mL,分裝后濾過除菌時置冰上操作。6.8金銀花檢測用引物對序列醋酸,充分混勻,加去離子水定容至1L,室溫保存,使用時用去離子水50倍稀釋。在80mL去離子水中溶解溴酚藍250mg、二甲苯青250mg、蔗糖250mg,加水定容至100mL,分裝。7檢驗程序為防止交叉污染,收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增與產物檢測應在不同操作間或在同一操作間不同隔離區域進行,進入各區域應嚴格按照單一方向進行,即樣品制備區寅核酸制備區寅擴增區寅檢測區。送檢樣品應可分成2批,每批可分為同樣的3份,總量不低于100g。收樣時應檢查包裝的完整性,并在樣品袋上貼上標簽,填寫采集數據表。對商品包裝和送樣說明進行拍照記錄,照片隨樣品一起備檔。送檢樣品抽樣方法參照2015年版《中華人民共和國藥典》四部藥材和飲片取樣法(通則0211)進行取樣。去除藥材和飲片表面附著物,依次使用75%乙醇和無菌雙蒸水擦拭表面后晾干。送驗樣品、試樣的抽取、分取應有代表性。在生產基地取樣,送驗樣品可以為組織或器官;在加工或銷售地點取樣,送驗樣品為種子或種苗。取送檢樣品置乳缽、勻漿機或球磨粉碎儀中充分研磨粉碎,必要時加適量液氮研磨。稱取經預處理的送檢樣品20mg置2.0mL離心管中;加入200滋L提取緩沖液,充分混勻;加入800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min或靜置5min;轉移500滋L上清液至一新的作為DNA模板待測或-20益保存備用。每個送檢樣品必須重復2次,每1次從送檢樣品提取核酸的過程都必須設置1個提取空白對照。注:使用堿裂解法提取的金銀花DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜長期保存。7.4PCR擴增首次使用本方法時,應校對PCR儀溫控準確性,并使用陽性對照和陰性對照以核對使用的Taq聚合酶的適用性。47.4.1對照試驗PCR檢測應重復2次,并設置陽性對照、陰性對照和空白對照。7.4.2PCR反應體系7.4.3PCR反應參數延伸10s,35個循環。對擴增產物進行檢測或置4益下保存。7.5擴增產物檢測7.5.1熒光染料顯色檢測長下檢測熒光,若PCR產物出現與陽性對照相同的熒光即為陽性結果,反之為陰性結果。7.5.2瓊脂糖凝膠電泳檢測取PCR擴增產物,加入6伊上樣緩沖液混勻,2%瓊脂糖凝膠電泳染色,紫外波長下檢測。陰性對照和空白對照無條帶,且送檢樣品與陽性對照在100~200bp有一條DNA條帶為陽性結果,否則為陰性結果。8結果判定在陰性對照、陽性對照和空白對照結果符合規定的情況下,若送檢樣品與陽性對照一致,則判定測試結果為陽性,否則為陰性。9結果報告9.2鑒定報告樣品經檢測后,實驗室應根據實驗的具體操作程序和結果做好詳細的實驗記錄,出具檢測報告。檢測報告至少包含以下內容:送檢樣品的名稱、狀態和明確的標識;檢測依據;取樣方法與日期;儲存條件;檢測開始和結束日期;檢測負責人和實驗人員;陽性對照、陰性對照、送檢樣品;特定方法取得的結果,結果使用的單位及計算方法;檢測結論;檢測過程觀察到的特別情況;其他需要報告的內容。檢測結果應來自同一實驗室樣品的兩份送檢樣品。當一份送檢樣品的結果為陽性,另一份為陰性時,要重新測試。可以適當增加核酸擴增反應體系中DNA模板量,使兩份樣品得到相同結果。每個樣品應至少制備兩份DNA,必要時需檢測模板DNA的質量,確保提取的DNA片段大于擴增片段。核酸擴增可設置PCR抑制劑對照。如果經過兩次以上從核酸提取開始的重復檢測,檢測結果不一致,5可在檢測報告中注明檢測低限,檢測低限應符合最低含量水平。11廢棄物處理檢測過程中的廢棄物,收集后在焚燒爐中焚燒處理,有毒有害廢棄物應經過除害再進行處理,處理要符合環保要求。6附錄A(資料性附錄)金銀花快速PCR鑒定體系的建立A.1金銀花及其偽品資料金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花,主要活性成分為綠原酸、木犀草苷等酚酸、黃酮類物質,臨床應用非常廣泛。盡管在2005年版《中國藥典》中已明確將忍冬作為金銀花唯一植物來源,但之前各版《中國藥典》根據臨床療效、地區用藥習慣等,曾先后選定忍冬、紅腺忍冬(L.HypoglaucaMiq.)、華南忍冬花習用品,金銀花民間藥用非常混亂。《中國植物志》收載有102種忍冬屬植物,其中作為“金銀花冶中藥材商品民間用藥的約有19種(含變種)。民間作為“金銀花冶商品用藥的忍冬屬植物除金銀忍冬,盤葉忍冬、硬毛忍冬外均屬于忍冬組纏繞亞組,形態學非常類似,化學成分上均含有綠原酸類,藥理活性有所類似,常有混用現象。《中國藥典》(2015年版)藥材鑒定項下收載了金銀花性狀鑒定和薄層色譜鑒定方法。但破碎的中藥性狀鑒定特征會模糊化甚至消失,導致鑒定效力減弱;而通過薄層色譜對供試品中綠原酸進行鑒定存在一定缺陷,主要表現為:淤綠原酸在多種植物中均存在,作為專屬性鑒定成分值得商榷;于該方法無法鑒定金銀花及其近緣種。與傳統中藥鑒定方法相比,中藥分子鑒定具有準確性高、重現性好等特點,且不受樣品形態的限制,原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中成藥(丸劑、散劑等),以及中藥材種子種苗和種質資源均可應用,由于其所需檢樣量少,對珍稀藥材及化石標本的鑒定更具應用價值。建立金銀花快速PCR鑒定標準,有利于滿足中藥材和中藥飲片、種子種苗真偽鑒定的需求,保證中藥質量可控。本附錄收集了9種金銀花常見偽品用于設計特異性PCR引物,具體樣品信息見樣品表。A.2引物設計金銀花trnL-trnF序列625位G/T變異可以準確鑒定金銀花及其同屬偽品,據此位點設計快速PCR鑒定引物(見圖A.1)。鑒定引物序列為:7圖A.1金銀花正偽品序列比對及引物設計結果A.3實驗樣品選取來自不同產地的8個正品金銀花(忍冬)及忍冬屬9種16個近緣種偽品材料進行快速PCR研究。植物樣品采自廣西、河南、山東、北京、安徽地區,憑證標本保存于中國中醫科學院中藥資源中心和廣西藥用植物園。詳見表A.1。A.1丹毒風熱毒蘊證可選用的中成藥序號物種拉丁名產地個數鑒定人1忍冬河南省封丘縣4劉紅彥2忍冬山東省臨沂市4李圣波3紅腺忍冬廣西崇左市2吳慶華4華南忍冬山東省臨沂市1李圣波5灰氈毛忍冬廣西南寧市2吳慶華6黃褐毛忍冬廣西桂林市2余麗瑩7水忍冬廣西桂林市2余麗瑩8金銀忍冬安徽省合肥市1彭華勝9郁香忍冬北京市2郝近大新疆忍冬北京市2郝近大繁果忍冬北京市2郝近大8A.4PCR反應體系的建立PCR反應程序:94益預變性1min;94益變性10s,60益退火延伸10s,35個循環,獲得擴增產物。取出PCR管,對反應產物進行檢測或置4益下保存。取5滋L反應液經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,染色后接通電源按5V/cm恒壓進行電泳20min,電泳結束后,將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。上述PCR各主要參數均經過系統的考察。取20mg干燥材料,使用堿裂解法提取總DNA,所提取D72益7min。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,利用trnL.F/trnL.R引物,金銀花(忍冬)及其9個同屬混淆品均獲得約1050bp大小的擴增產物,與trnL-trnF片段大小一致(圖A.2),說明堿裂解法提取的DNA可以滿足PCR反應的要求。MNTCMNTC1234567892000bp1000bp750bp500bpM:DL2000marker;1:忍冬;2:紅腺忍冬;3:灰氈毛忍冬;4:華南忍冬;5:黃褐毛忍冬;6:水忍冬;7:金銀忍冬;8:郁香忍冬;9:新疆忍冬A.4.2PCR反應條件考察利用金銀花(忍冬)SNP鑒定引物JYH.F和JYH.R進行位點特異性PCR反應,并分別考察:型PCR儀(Eppendorf公司)、TC-512型PCR儀(TECHNE公司)對PCR反應穩定性的影響。對金銀花鑒定結果進行考察,結果表明,使用快速PCR鑒定引物擴增時,如當退火溫度為66益時,偽品也有熒光;當退火溫度為70益和72益時,均無熒光;當退火溫度為68益時,僅正品有熒光,所以金銀花快速PCR鑒定的最佳退火溫度選擇68益(圖A.3A)。減少PCR反應時間,在退火溫度為68益時,逐漸減少循環數。當循環數為27個循環,PCR產物出現弱熒光(圖A.3B)。然而,當選用27個循環時,變性-退火/延伸的時間低于20s時即無法擴增出條帶,故最終選擇循環數為30。960℃60℃62℃A30cyle35cyle23412341B91℃85℃1234123410s5s23412341DHSTaqApataTaq2342341EPCT-100ABI970023412341F85℃41234Mastercyclrt1234rTaq1234ls1234TC-51223487℃123TransTaq2343S23466℃64℃2383℃2323440cyle341295℃C4圖A.3不同因素對快速PCR的影響A:退火溫度;B:循環數;C:變性溫度;D:變性時間,其中退火時間與變性時間一致;E:Taq酶種類的影響,其中HSTaq為