B45DB12QuantitativePCRmethod天津市市場和質量監督管理委員會發布本標準主要起草人：趙新、易萌、劉娜、蘭青闊、劉雪巖、陳銳、朱珠、王成、徐石鮮凍畜、禽肉中動物源性成分的定量檢測實時熒光PCR法下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版GB/T6682分析實驗室用水規格和實時熒光PCRrealtimePCR每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的豬源性成分porcine-derive雞源性成分chicken-derive算試樣中種屬特異性基因和內參基因的比值，從而對鮮凍畜、禽肉中動物源性成分進行定量檢測。Rd1Rd1-P：5′-FAM-CGGCACSus-ACTBSus-P：5′-FAM-TCTGDucg作為試樣，裝入清潔容器中，加封后，標明標記。將試樣于-20℃冷凍保存。SDS裂解液和20μL蛋白酶K（20mg/mL混勻，55℃水浴消化數小時，期間不停顛倒混勻，直至緩慢顛倒混勻，12000rpm離心10min，轉移上清至一5.3.4.1標準樣品和試樣實時熒光P進行45次循環擴增反應（95℃變性15s，60℃退火延伸1min在第二階段的退火延伸（60℃)時段收集熒光信號。4—2.0μL2.0μL—25.0μL—1.0μL1.0μL0.5μL1.0μL—25.0μL情況進行調整。設定閾值處，要求不同濃度梯度標準品的擴增曲線平行，而且同一樣品的不同平根據標準溶液的擴增Ct值和初始模板含量的對數間的線性關系，分別繪制動物源性標準曲線公式：式中：y—測試樣品的Ct值；a—標準曲線的斜率；x—模板靶標濃度以10為底數的對數；b—標準曲線的截距。5.3.5.4數據可接受的標準動物源性成分種屬特異性基因陰性對照和空白對照的Ct值≥38;16SrDNA陰性對照和空白對照的16SrDNA內標基因Ct值≥38;標準曲線的R2≥0.98,標準曲線斜率≥-3.6且≤-3.1,滿足上述條件，可以進行結果計算。否則重新進行實時熒光PCR擴增。5.3.5.5含量計算5.3.5.5.1計算試樣模板靶標濃度將試樣的動物源性成分種屬特異性基因和16SrDNA內參基因的Ct值分別帶入動物源性成分種屬特異性基因和16SrDNA內參基因的標準曲線方程，計算動物源性成分種屬特異性基因和16SrDNA內參基因的靶標濃度。計算試樣模板靶標濃度公式：式中：n—模板靶標濃度y—測試樣品的Ct值；a—標準曲線的斜率；b—標準曲線的截距。5.3.5.5.2計算試樣中動物源性成分種屬特異性基因含量將動物源性成分種屬特異性基因的靶標濃度和16SrDNA內參基因的靶標濃度帶入公式(3),計算出試樣中動物源性成分種屬特異性基因百分含量。計算試樣中動物源性成分種屬特異性基因百分含量的公式：式中：c—試樣中動物源性成分種屬特異性基因的百分含量(%);Du一動物源性成分種屬特異性基因靶標濃度；6結果分析與表述6.116SrDNA內參基因和動物源性種屬特異性基因均出現典型擴增曲線，且16SrDNA內參基因和動物源性種屬特異性基因的Ct值<36,表明樣品中檢出某動物源性成分。表述為“樣品中檢測出某動物源性成分，某動物源性成分含量為c”。依照6.1-6.2進行判斷；如重復實驗動物源性種屬特異性基因出現典型擴增曲線，但Ct值仍在36～38內參基因和動物源性種屬特異性基因出現典型擴增曲線，但Ct1GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGCTACTTCTGTGAGGCAGA61GCTGTGTTCCTTGCCGTCATGTGCCCAGGAGACTGGCGGGGAAGGAAGAGACTGGCGGGGAAGGAA61ACAGAGCGAGTCAGAAGGCT注：劃線部分為OA-F和OA-R引物序列，方61AGCACACTTAGCCGTGTTCCTTGCACTCTCTGCATATATCCACGGTT