職業教育醫學生物技術專業教學資源庫干細胞的體外培養職業教育醫學生物技術專業教學資源庫一、技術原理職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（一）技術原理基本原則：促進ES增殖的同時，維持其未分化的二倍體狀態。有飼養層（feederlayer）培養法：以小鼠成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系（STO）或小鼠胚胎成纖維細胞（MouseEmbryoFirbroblasts,MEF）制備飼養細胞單層，主要是利用其分泌的生長因子FGF和抑制干細胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干細胞在體外克隆而不分化。無飼養層培養法：利用各種能分泌抑制分化因子的細胞制備條件培養基或在基礎培養基中加入重組的LIF制備條件培養基。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫二、基本過程職業教育醫學生物技術專業教學資源庫飼養層細胞制備或條件培養基制備胚胎的制備和培養胚胎干細胞的分離胚胎干細胞的培養胚胎干細胞的鑒定凍存與復蘇細胞克隆形態堿性磷酸酶檢測核型的鑒定分化能力的觀察嵌合能力的測定職業教育醫學生物技術專業教學資源庫1、飼養層細胞培養小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）：取孕12.5-14.5d鼠胚胎軀干，以植塊培養法或分散細胞培養法制備，取第三代至第五代細胞作為飼養層細胞。STO細胞：按照一般已建細胞系培養方法。DMEM加10%小牛血清作為培養液。采用胎數多小鼠一次大量培養MEF凍存，用時復蘇。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫MEF和STO的優缺點：MEF分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制分化因子的能力比STO強，STO作飼養細胞時常需在培養基中加入LIF。MEF不能長期傳代，需經常準備懷孕小鼠制備第三代至第五代細胞，STO則可長期傳代培養。MEF不具耐藥性，不能作為轉染外源性基因的胚胎干細胞篩選用。SNL細胞為轉染了neor抗性基因和LIF基因的STO細胞，可分泌足夠的抑制分化因子，并因帶有neor抗性基因可用于轉基因胚胎干細胞篩選。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫胚胎干細胞培養過程中，死亡MEF或STO的染色體可能導致胚胎干細胞的突變及影響正常核型的保持。不易獲得純的胚胎干細胞作為生化和分子生物學方面的分析。使用前如用絲裂霉素C處理，如清洗不徹底，殘余的絲裂霉素C會影響胚胎干細胞的增殖。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫2、飼養單層制備MEF或STO連成一片，以含10μg/ml絲裂霉素培養液370C作用2-3h（如細胞層較薄，也可縮短至30min-1.5h），或γ射線照射（劑量為30-100Gy）。棄含絲裂霉素培養液，PBS洗5次，γ射線處理者不用清洗。消化細胞，制備懸液種植至用0.1%明膠處理過（0.1%明膠水溶液覆蓋培養瓶表面，室溫2h以上）的培養瓶，種植細胞數：MEF7.5×104-105個/cm2，STO為5×104個/cm2。培養至細胞連成一片沒有間隙（中間可補加處理過的細胞），制備好的飼養單層置培養箱，5天內使用，使用前換成干細胞培養液。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫觀察：好的飼養單層，細胞連成一片，無間隙，死亡細胞和雜細胞極少。MEF和STO產生的抑制分化因子一部分分泌到培養液中，一部分錨定在細胞外基質上。無間隙的飼養單層保證了胚胎干細胞都能與飼養層細胞接觸而達到最佳效果。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫3、用于培養胚胎干細胞的條件培養基直接在胚胎干細胞培養液中加入重組的LIF，使終濃度為1000U/ml。Baffalo大鼠肝細胞株BRL條件培養基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干細胞分化的因子DIF。收集培養72h的培養液，過濾除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干細胞培養液，再添加8-10%胎牛血清。年齡2-3周大鼠心肌細胞條件培養基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干細胞分化因子。收集1-6代細胞培養液，過濾除菌，用前6份+3份胚胎干細胞培養液+1份胎牛血清。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫4、胚胎干細胞的分離和培養（1）培養液配制培養液要用超純水或五蒸水，不能有細菌內毒素污染，水要現用現制。高糖DMEM作為基礎培養基，葡萄糖濃度為（4.5g/L）：有助于囊胚貼壁、內細胞團增殖及胚胎干細胞集落形成。使用前還要添加β-巰基乙醇（0.1mmol/L）或單硫甘油（0.15mmol/L）：保護細胞內酶和蛋白質中的巰基不被氧化，促進胚胎干細胞的貼壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺點。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫血清缺點：成分復雜，不利于整合到胚胎干細胞基因組中外源性基因功能的測定；可能含有一些未知的促進胚胎干細胞分化的因子；含有微量的血紅蛋白和內毒素，干擾胚胎干細胞生長。無血清胚胎干細胞培養液無上述缺點，但細胞貼附力不如有血清培養基。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（2）胚胎干細胞的分離小鼠：母小鼠超數排卵交配（注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培養：培養皿內制備直徑0.5cm左右露滴狀培養液液滴，并覆蓋透明石蠟油，胚胎置于液滴中培養胚胎干細胞分離：普通分離法、免疫外科法，棄除滋胚層細胞，獲得內細胞團（innercellmass，ICM），并分散為3-4個細胞在一起的細胞團職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（3）胚胎干細胞培養有飼養層細胞培養：將內細胞團吸置處理過的飼養層上，一個內細胞團放置一個孔，370C、5%CO2、飽和濕度培養2d后出現小集落，并逐步增大，6-10d可消化傳代，消化時，消化30s后棄消化液，殘余消化液繼續作用，當飼養單層出現裂隙（或顯微鏡下細胞之間分開），終止消化，一般為2-3min加適量培養液，輕輕吹打成單細胞懸液，接種新飼養層擴大培養。無飼養層培養：明膠包被培養板，條件培養基。已建系胚胎干細胞：將已培養2-3d生長旺盛干細胞消化成單細胞懸液，添加新的培養液，按照1：3或1：6比例轉鐘。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫注意事項：最初分離的內細胞團以3-4個細胞團為宜，但集落形成后，傳代過程中一定要消化成單細胞，否則胚胎干細胞會互相誘導，易于分化。培養條件要始終如一。為了增強胚胎干細胞粘附力，除明膠包被外，還可以用纖維連接蛋白和多聚賴氨酸等促進粘附。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（4）培養結果hES細胞集落（×10）胚胎干細胞呈集落狀（島嶼狀）生長，邊緣整齊，表面平滑，結構致密，隆起生長，細胞之間界限不清。消化成單細胞后細胞小而圓，核大，胞漿小。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫小鼠胚胎生殖細胞的相位襯度圖像職業教育醫學生物技術專業教學資源庫小鼠胚胎生殖細胞培養皿含有數百個小鼠胚胎生殖細胞群的培養皿。每一個紅色染色的斑點代表一個由數百或數千個干細胞組成的個體集落。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫5、胚胎干細胞的凍存和復蘇凍存液：胚胎干細胞培養液+10%-15%DMSO。凍存細胞密度：106-107個/ml凍存與復蘇方法同普通細胞。LIF條件培養基培養的細胞，仍然用不含LIF的胚胎干細胞培養液凍存。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫三、胚胎干細胞的鑒定職業教育醫學生物技術專業教學資源庫1、ES細胞生物學特性（1）ES細胞形態結構及核型ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態結構，胞體體積小，核大，有一個或幾個核仁。細胞中多為常染色質，胞質結構簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了二倍體性質。正常ES細胞染色體正常，如發生異常則其很難發育分化形成動物個體。

職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（2）ES細胞生長特性ES細胞在體外分化抑制培養中，呈克隆狀生長，細胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細胞界限不清，克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化的扁平狀上皮細胞。

ES細胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。此外，其還可以在體外進行選擇、操作、凍存。凍存的細胞可在需要時隨時解凍，繼續培養不失其原有特性，并且來自一個克隆的細胞具有同樣的特征。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（3）ES細胞的高度分化潛能ES細胞在體外需在飼養層細胞上培養才能維持其未分化狀態，一旦脫離飼養層就自發地進行分化。在單層培養時細胞自發分化成多種細胞，懸浮培養中：“簡單類胚體”

“囊狀胚體”

細胞分化物。ES細胞可進行誘導分化

*用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導90％以上的ES細胞分化為神經膠質細胞，

*聚集培養的ES細胞誘導分化則可分化為有節律性收縮的心肌細胞。

*將ES細胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細胞組成可代表3個胚層細胞。

*用ES細胞作核供體進行細胞核移植，可以得到可發育重構胚和動物個體。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（4）堿性磷酸酶的表達

許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細胞和囊胚細胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達，小鼠的EC細胞和ES細胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細胞和ES細胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。因此，AKP常用來作為鑒定EC細胞或ES細胞分化與否的標志之一。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（5）胚胎階段特異性細胞表面抗原的表達

早期胚胎細胞表面均表達胚胎階段特異性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎的原始外胚層細胞、ES細胞、EC細胞和原始生殖細胞的表面均可檢測到SSEA-1的表達。小鼠SSEA-1的表達自8細胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細胞全部呈強陽性，晚期囊胚中部分ICM呈強陽性，部分呈弱陽性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細胞鑒定的一個標志。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫2、ES細胞的全能性主要體現在以下幾方面：

①形成畸胎瘤。將ES細胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤，包括三個胚層細胞；

②形成類胚體。培養ES細胞在非粘附底物中懸浮生長，或控制增殖細胞數目，能夠使之生成類胚體，它是一個與畸胎瘤相似的多種細胞系混雜的集合體、具有三個胚層組織；

職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

③直系分化。通過控制ES細胞生長環境，或遺傳操縱特定基因表達，ES細胞可直接分化成某特定種系細胞，例如將神經決定基因NeuroD2和NeuroD3轉人ES細胞，可使之分化為神經細胞；

④形成嵌合體。將ES細胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細胞可以參與嵌合體各個器官包括生殖腺的發育。這是檢驗一個細胞系是否為ES細胞的標準。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫3、ES細胞的鑒定--細胞的形態結構--核型分析--堿性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫熒光標記--分化能力檢測體外分化試驗體內分化試驗嵌合體形成試驗核移植試驗職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（1）ES細胞形態學鑒定依ES細胞的形態結構（胞體體積小，核大、有一個或幾個核仁）和生長特性（呈克隆狀生長，細胞緊密聚集，形似鳥巢，界限不清）對ES細胞進行初步鑒定。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（2）核型分析

ES細胞具有正常二倍體核型，可用核型分析進行檢驗職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

（3）堿性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在堿性條件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的α-磷酸奈酚鈉水解，產生α-奈酚，然后再與偶氮鹽偶聯，形成不溶性染料而呈現顏色。步驟：生長胚胎干細胞克隆的蓋片以無水乙醇或冷丙酮固定10-15min→水洗→滴加孵育液室溫5-10min→水洗10min→復染（甲基綠等）10min。結果：未分化胚胎干細胞顏色以所用偶氮鹽品種而異，分化者則為復染液顏色。對照：以已建系ES細胞（或小鼠的脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽性對照，作用液中不含α-萘酚磷酸鈉為陰性對照。

職業教育醫學生物技術專業教學資源庫職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（4）胚胎干細胞特異表面抗原的表達免疫熒光檢測SSEA胚胎階段特異性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分離的hES陰性弱陽性強陽性Gearhart分離的hES陽性弱陽性陽性小鼠ES陽性陰性陰性鼠和人胚胎干細胞表達的表面抗原有種屬差異。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（4）胚胎干細胞特異表面抗原的表達RT-PCR檢測轉錄因子Oct-4的表達

Oct-4只限定在多潛能細胞中表達。人和小鼠的胚胎干細胞都表達轉錄因子Oct-4，當胚胎干細胞分化時，其表達能力大大降低。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（5）分化能力檢測體外分化能力觀察:無飼養層和無抑制分化因子的條件下培養，胚胎干細胞會分化成各種細胞或發育成胚胎體：3d“簡單類胚體”

5-10d“囊狀胚體”

貼壁細胞為細胞分化物。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫體內分化能力觀察：ES細胞接種同一品系小鼠腹股溝（107個細胞）或裸鼠、SCID小鼠（106個細胞）→約2周后出現腫塊，4-5周進一步增大，摘除腫塊→固定切片染色：見三個胚層組織，為畸胎瘤結構裸鼠和SCID小鼠可接種異種細胞和組織的移植也可接種腹腔，2-3周后觀察腫瘤職業教育醫學生物技術專業教學資源庫嵌合能力測定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化體小鼠（BALB/c小鼠）或純合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）著床前胚胎內，或將來源于白化體小鼠的ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內，再移植到假孕母鼠子宮內，使之發育成個體。如ES具有嵌合能力，則會融合到宿主胚胎細胞中，并共同發育形成各種組織細胞并產生個體小鼠即為嵌合體，其毛色應是ES細胞來源品系小鼠和胚胎供體小鼠毛色的雜合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。除毛色觀察，也可檢測同工酶遺傳標記，或采用PCR和小衛星DNA方法等鑒定嵌合體。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫四、成體干細胞職業教育醫學生物技術專業教學資源庫成體干細胞優點獲取相對容易源于患者自身的成體干細胞在應用時不存在組織相容性的問題，避免了移植排斥反應和使用免疫抑制劑理論上，成體干細胞致瘤風險很低，而且所受倫理學爭議較少成體干細胞還具有多向分化潛能職業教育醫學生物技術專業教學資源庫但胚胎干細胞也存在自身的優勢：胚胎干細胞能永生化，可以傳代建系，且增殖能力強，來源充沛。雖然成體干細胞具有向多系分化的能力，但這種分化的“效率”尚不理想。通過體外的擴增培養能提高轉化效率，但是體外的轉化是否會引起成體干細胞遺傳變化還有待證實，而且這種分化是否是成體干細胞多系分化的結果尚無法肯定。成體干細胞和胚胎干細胞各有自身的優勢和缺陷。同時開展對兩者的研究，能互為裨益，相得益彰。兩者的研究對干細胞領域而言都是必要的。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫成體干細胞鑒定方法：科學家尚未就成體干細胞的鑒定標準達成一致，經常被采用的鑒定方法包括：利用分子標記在活體組織中對細胞進行標記，然后確定它們所產生的特定細胞類型。將細胞從活體動物上分離出來，在對其進行細胞培養的過程中進行標記，之后將細胞移植入另一個動物體內，觀察該細胞是否可以再生其來源組織。分離細胞，進行細胞培養，并對其分化進行控制，通常采用加入生長因子或向細胞內引入新基因的方法，進而觀察細胞的分化方向。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

目前研究的成體干細胞（AdultStemCells）骨髓造血干細胞(HSC)外周血干細胞(PBSC)胎肝干細胞臍血干細胞神經干細胞職業教育醫學生物技術專業教學資源庫造血干細胞作為干細胞研究與應用的突破口1.造血細胞是細胞增殖分化的最佳模型。2.造血干／祖細胞及各系血細胞的表面標志較為清楚，細胞表型特征可進行定量分析，且可分選。3.造血干細胞增殖及向各系分化的重要誘導因子、受體、信號轉導、微環境等因素較為清楚。4.造血細胞發揮功能可相對游離，不需“生物支架”、神經、血管、外科移植等復雜的“下游”工藝，因此便于直接應用于臨床。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫神經干細胞(nuralstemcell，NSC)

NSC可增殖分化出中樞神經系統的三種基本細胞：神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。神經干細胞的生化標記為巢素蛋白及波形蛋白。由于分離神經干細胞所需的胎兒腦組織較難取材，神經干細胞的研究仍處于初級階段。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫五、研究熱點職業教育醫學生物技術專業教學資源庫五、目前干細胞的研究熱點人體干細胞的建株；干細胞保持不分化的培養；干細胞的定向誘導分化；干細胞應用的法律、倫理道德問題；干細胞、組織工程、器官工程；胚胎組織的種植及定向誘導分化。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫六、應用前景職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

六、胚胎干細胞研究的應用前景ES細胞在哺乳動物個體發生發育規律的研究中極有價值的工具；ES細胞是研究細胞分化的理想手段；ES細胞是研究基因功能的首選細胞；ES細胞作為生產轉基因動物的主要途徑之一；ES細胞治療技術將引起一場醫學革命；ES細胞可用于研究細胞癌變機理和新藥物的篩選。

HumanDiseasemodelHepatocytesBloodCells藥物開發、毒性測試臨床醫療應用基礎醫學研究Humandiseasemodel胚胎干細胞的基礎醫學研發與臨床應用職業教育醫學生物技術專業教學資源庫來源于干細胞的組織可能用于治療的疾病

細胞類型 治療的疾病神經細胞

中風、帕金森氏病、老年癡呆癥、脊髓損傷、多發性硬化病心肌細胞 心臟病發作、充血性心臟病產生胰島素的細胞糖尿病軟骨細胞 骨性關節炎血細胞

免疫缺乏癥、血液病、白血病肝細胞 肝炎、肝硬化皮膚細胞 燒傷骨細胞 骨質疏松癥視網(眼)細胞 黃斑癥骨骼肌細胞肌肉萎縮癥職業教育醫學生物技術專業教學資源庫干細胞治療優點明顯低毒性（或無毒性），一次藥有效；不需要完全了解疾病發病的確切機理；還可能應用自身干細胞移植，避免產生免疫排斥反應。用干細胞治療疾病已不再只是設想。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫革命性的機制轉變利用胚胎干細胞治療疾病有廣泛的應用前景，但是干細胞應用在歐美卻受到社會倫理學的制約，并且在實際應用中還不能避免免疫排斥。因此橫向分化的發現在干細胞研究中具有革命性意