關于酶類藥物的分析1第1頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日2

第一節(jié)

概述在生物體內，酶能降低生化反應活化能，加快可逆反應的進行速度，使之盡快達到平衡。一、酶的特性二、酶的分類三、酶的化學組成四、酶的催化反應機制五、酶催化反應動力學第2頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日3一、酶的特性

1．酶是高效催化劑。

2．酶對底物的結構具有嚴格的選擇性。

（1）相對專一性：（2）絕對專一性:（3）立體異構專一性:3．酶催化反應的反應條件溫和。4．酶的催化活性在生物體內受多種因素的調節(jié)。第3頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日4二、酶的分類氧化還原酶轉移酶水解酶裂合酶異構酶合成酶（或稱連接酶）第4頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日5三、酶的化學組成

分為簡單酶和結合酶兩大類。結合酶類中除含有蛋白外，還含有某種熱穩(wěn)定的非蛋白質的小分子物質，二者結合起來，稱為“全酶”，才呈現(xiàn)生物催化活性。結合酶=酶蛋白+輔助因子第5頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日6四、酶的催化反應機制

1．酶-底物復合物的形成

在酶促反應中，反應底物首先與酶分子上活性部位結合，形成酶-底物復合物，降低反應的活性能，使酶促反應順利進行。2．酶-底物復合物加速反應速率的原因（1）定向作用與底物濃縮

（2）酶使底物分子變形

（3）酸堿催化（4）共價催化

。第6頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日7五、酶催化反應動力學

酶的活力單位

酶活性單位（U）是酶活性高低的一種量度，用U/g或U/ml表示。酶活力單位定義：在規(guī)定的條件下，每分鐘能轉化1μmol底物所需要的酶量，稱一個酶的活力單位。酶的比活力

每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。

第7頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日8Michaelis-Menten快速平衡學說底物濃度的增加，反應速度上升呈雙曲線。在低底物濃度時，反應速度呈直線上升，表現(xiàn)為一級反應。在高濃度時，反應速度達到一個極限值，呈現(xiàn)零級反應。第8頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日9米氏方程酶反應動力學方程式：

V——反應初速度Vm——最大反應速度Ks—米氏常數(shù)，Ks=K－1/K1，Ks為ES的解離常數(shù)，表示酶與底物的親和力。Ks為反應速度V是最大反應速度Vm一半時所需底物濃度，即V=1/2Vm時，Ks=[S]。第9頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日10Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)學說

ES的形成速度與ES的解離速度相等，達到動態(tài)平衡，即“穩(wěn)態(tài)”，反應方程式：Km取代了Ks，當V=1/2Vm時，Km=[S]。Km也可表示為底物與酶的親和力。第10頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日11第二節(jié)

酶類藥物的鑒別與檢查鑒別方法常用蛋白質鑒別方法，如在堿性條件下的雙縮脲反應。專用于酶的鑒別方法：

酶活性試驗：與特異性底物反應（胰蛋白酶）。沉淀試驗：胃蛋白酶動物試驗：透明質酸酶水解粘多糖。

第11頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日12酶類藥物的檢查

酶類藥物是生化產品和微生物發(fā)酵產品，在生產過程中可能帶入微量的脂肪類物質、其他的酶類和大分子雜質，影響酶質量，需有含量限度。第12頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日13酶類藥物的檢查（一）脂肪含量限度檢查檢查方法，乙醚浸提，干燥，精密稱定，脂肪不得過規(guī)定的含量。（二）其他酶類含量限度檢查胰蛋白酶、糜蛋白酶均是從牛、豬的胰臟中提取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶時又易帶入微量的糜蛋白酶。（三）大分子活性物質含量限度檢查第13頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日14胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。糜蛋白酶專屬水解芳香氨基酸（L-酪氨酸、L-苯丙氨酸）的羧基形成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵。用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-TyrosineEthylester，ATEE）作底物，通過分光光度法測定此酶對底物的水解速率來檢查該酶的含量限度。第14頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日15第三節(jié)酶活力測定方法固定時間法

連續(xù)監(jiān)測法

（一）、需NAD+或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法：直接測定法

偶聯(lián)法三聯(lián)酶活測定（二）、不需NAD+或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法：固定濃度法

第15頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日16一、固定時間法

在適宜的條件下，使酶和底物共同保溫一定時間，然后測定產物生成的量或底物消耗的量從而間接推算出酶的含量（或活力）。

[E]表示酶濃度，[P]為反應產物濃度，t表示酶作用時間，K為常數(shù)。第16頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日17注意事項缺點：無法了解整個反應過程是否都是零級反應。注意事項：1、底物飽和2、時間第17頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日18二、連續(xù)監(jiān)測法

在酶反應過程中，連續(xù)記錄不同時間的底物消耗量或產物生成量。

（一）、需NAD+或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法（二）、不需NAD+或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法第18頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日19（一）、需NAD+或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法：還原型輔酶（NADH和NADPH）在340nm處有紫外吸收，氧化型輔酶（NAD+和NADP+）在340nm處無紫外吸收.利用340nm處每分鐘吸收度升高或降低的速率與酶活性成正比的關系，推算出酶的活力單位。包括：直接測定法

偶聯(lián)法三聯(lián)酶活測定

第19頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日20直接測定法大多數(shù)需NADH（NADPH）參加的脫氫酶，可利用紫外分光光度法直接測定反應體系在340nm處吸收度的變化，計算酶活力單位。丙酮酸＋NADH＋H+ 乳酸＋NAD+340nm處吸收度降低的速率與NADH的氧化速率成正比，與LDH的活力成正比。第20頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日21偶聯(lián)法此類酶催化反應不需NAD+或NADP+，但當與需NAD+或NADP+的脫氫酶反應偶聯(lián)以后，能用紫外分光光度法測定.由脫氫酶引起的反應為指示反應，脫氫酶是指示酶，指示酶活力要比測定酶活力至少大100倍。例如：谷草轉氨酶的測定：第21頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日22三聯(lián)酶活測定引入一個輔助酶反應，將被測酶反應系統(tǒng)與指示酶反應系統(tǒng)聯(lián)系起來，組成一個“三合一”酶反應系統(tǒng)，使底物轉化率、輔助酶反應和NADH（NADPH）氧化速率之間成正比函數(shù)關系，輔助酶和指示酶的活力必須大大超過測定酶活力。例如：磷酸肌酸+ADP肌酸＋ATP……(1)葡萄糖＋ATPG-6-P＋ADP……(2)G-6-P+NADP+

葡萄糖酸-6-磷酸＋

NADPH＋H+

…(3)(1)被測反應，(2)輔助反應，HK（己糖激酶）輔助酶，(3)指示反應，

G-6-PDH（6—磷酸葡萄糖脫氫酶）指示酶。第22頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日23（二）不需NAD+或NADP+指示的連續(xù)監(jiān)測法：酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身無色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應產物。根據(jù)反應過程中吸收度增高速率，算出酶活力單位。例如：磷酸對硝基苯酚酯對硝基苯酚第23頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日24三、固定濃度法根據(jù)酶催化反應，使反應產物達到額定的濃度時其反應時間與酶濃度成反比的原理進行設計的。

[P]=K[E]t測定時間.以所需時間的倒數(shù)（1/t）對酶濃度作圖即可制備標準曲線。優(yōu)點：1、記錄時間。2、準確第24頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日25二、底物與產物的測定方法（酶反應的檢測方法）1、化學方法：用化學法測定其中某一底物或產物的變化值。2、分光光度法：

常用的有比色法和紫外分光光度法。3、熒光測定法：

簡單、靈敏、快速。4、電化學分析法（1）

離子選擇性電極分析法（2）

微電流法5、其他方法如測定氣體的測壓法，測定產物旋光度變化值的旋光測定法。第25頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日26第五節(jié)

酶類藥物的檢測

肽鍵水解酶

1、胰蛋白酶2、彈性蛋白酶3、尿激酶（氣泡上升法）脂鍵水解酶——胰脂肪酶

糖苷鍵水解酶——溶菌酶其它（超氧化物歧化酶）第26頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日27一、肽鍵水解酶1、胰蛋白酶2、彈性蛋白酶3、尿激酶第27頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日281、胰蛋白酶—比色法胰蛋白酶：由牛、羊、豬等動物的胰臟中提取的一種蛋白水解酶。牛胰蛋白酶：233個氨基酸，分子量24000，等電點10.1。豬胰蛋白酶：214個氨基酸，分子量23400，等電點10.8。胰蛋白酶最適pH為7.6~8.0，電泳純的胰蛋白酶的比活為8000單位/mg。第28頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日29原理胰蛋白酶專一作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，水解速度為酯鍵>酰胺鍵>肽鍵。BAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)BAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)苯甲酰－L－精氨酸乙酯（BAEE）在胰蛋白酶的作用下，酯鍵被水解生成苯甲酰－L－精氨酸，在253nm波長處的吸收度隨酶促反應遞增，根據(jù)活力單位定義計算酶活力。第29頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日30測定法：取呈直線的吸收度，按下式計算：P為每mg供試中含胰蛋白酶的量，U；A1為直線上終止的吸收度；A2為直線上開始的吸收度；T為A1至A2讀數(shù)的時間，min；W為測定液中供試品的量，mg；吸收度每分鐘改變0.003，即相當于1個胰蛋白酶單位。第30頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日31

2、胰彈性蛋白酶胰彈性蛋白酶：為肽鏈內斷酶，存在于哺乳動物胰臟。彈性酶用于治療高血脂癥、動脈粥樣硬化和脂肪肝。胰彈性蛋白酶是由240個氨基酸組成的單一肽鏈，有四對二硫鍵。分子量為25900，等電點為pH9.5。胰彈性蛋白酶除水解彈性蛋白外，還可以水解血紅蛋白、酪蛋白等蛋白。剛果紅－彈性蛋白。第31頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日32原理剛果紅－彈性蛋白法：以剛果紅－彈性蛋白為底物，由于剛果紅－彈性蛋白酶結合的共價鍵能被彈性酶水解，根據(jù)剛果紅在495nm處有最大吸收，由標準曲線即可查得彈性酶單位數(shù)。單位：20分鐘水解1mg剛果紅－彈性蛋白所需的酶量為一個彈性酶活力單位。第32頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日33方法:

第33頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日343、尿激酶由人尿中分離提純后制得的一種堿性蛋白水解酶。主要作用是激活人體內纖維蛋白溶解酶原使其成為有活性的纖維蛋白溶酶，從而解聚血纖維蛋白，溶解血栓。天然尿激酶的分子量為54000，其作用于纖維蛋白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維蛋白溶解酶。第34頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日35效價測定原理(氣泡上升法)尿激酶激活人體內纖維蛋白溶解酶原使其轉化成纖維蛋白溶酶；纖維蛋白原在凝血酶的作用下，轉變成纖維蛋白凝塊，此凝塊在纖維蛋白溶酶作用下，水解為可溶性小分子多肽。在纖維蛋白溶酶原過量的情況下，尿激酶量與纖維蛋白凝塊的溶解時間的對數(shù)成直線關系。第35頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日36操作試管中加纖維蛋白原溶液0.3ml（37℃水浴）標準品溶液1.0ml加混合溶液0.4ml立即搖勻計時，反應系統(tǒng)應在30～45秒內凝結，當凝塊內小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時作為反應終點。以尿激酶的濃度為橫坐標，以反應時間的對數(shù)為縱坐標。第36頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日37二、脂鍵水解酶－胰脂肪酶胰脂肪酶是一種水解酶，在一定條件下把甘油三脂類脂肪逐步水解，最后生成甘油及相應的脂肪酸。底物:橄欖油pH指示連續(xù)滴定法：穩(wěn)定pH條件下避免因pH值改變而引起酶活力的改變。用已知濃度的標準堿溶液滴定，可定量地測定脂肪酸的量，從而得知脂肪酶活力。第37頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日38測定

第38頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日39計算每分鐘水解橄欖油產生1μmol脂肪酸的酶量，為1個活力單位。每克含有的胰脂肪酶單位A:供試品消耗NaOH（0.1mol/L）的體積B:空白消耗NaOH（0.1mol/L）的體積W:供試品取樣量（g）N:供試品稀釋倍數(shù)。第39頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日40三、糖苷鍵水解酶－溶菌酶蛋清中提取的能分解粘多糖的堿性水解酶。主要作用于革蘭氏陽性菌，使胞壁中的肽聚糖分解導致細菌溶解。溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。溶菌酶分子量為14000～15000，由129個氨基酸殘基組成，等電點為10.0~11.1。溶菌酶屬糖苷水解酶，能以某些細菌細胞中的多糖為底物。第40頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日41效價測定－比濁法以溶酶小球菌為底物，主要成分為粘多糖，粘多糖由NAG和NAM重復而成。溶菌酶水解專屬性強，它只能水解NAMC1和NAGC4之間的β－1，4糖苷鍵。溶酶小球菌胞壁中的粘多糖經(jīng)過溶菌酶的水解作用后，菌體因滲透壓不平衡，導致溶菌，溶液的吸收度下降。在一定的條件下，每分鐘吸收度下降0.001為一個酶活力單位。第41頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日42比濁法測定計算：酶活力單位（u/mg）=W為測試液中供試品的重量（μg）第42頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日43比色法測定溶菌酶活性

用染料艷紅K－2BP標記的M.Lysodeikticus為底物，酶催化細胞壁分解時游離出染色碎片（產物）反應后離心除去未分解底物，上清液比色，吸收度為溶菌酶活力的函數(shù)。第43頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日44溶菌酶效價測定－比色法

第44頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日45四、超氧化物歧化酶由哺乳動物紅細胞分離而得的金屬酶，能催化超氧化物游離基轉化成過氧化氫和氧。來源于牛、豬、人紅血球的超氧化物歧化酶（SOD）含銅和鋅，分子量32000左右。SOD對熱較穩(wěn)定，在pH5.3~9.5范圍內對酶活性影響不大。牛紅細胞SODPI為4.95。第45頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日46效價測定SOD測定方法：直接法：直接測定反應過程中

O2-

的變化。間接法：同時使用氧自由基指示清除劑，SOD與指示劑清除劑競爭O2-，從而抑制指示劑清除劑與O2-

的結合，根據(jù)指示劑清除劑與O2-

反應速度的變化可間接測定SOD的活性。間接法包括：黃嘌呤氧化酶－細胞色素C法和聯(lián)苯三酚法。第46頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日47黃嘌呤氧化酶－細胞色素C法原理：在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤成尿酸，與此同時產生O2-，氧化型細胞色素C被O2-

還原為還原型細胞色素C，后者在550nm有最大吸收，因此測定氧化性細胞色素C在加入SOD前后的光吸收變化可間接計算酶活性。第47頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日48方法

第48頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日49注意點在特定條件下，25℃（pH7.8）每分鐘抑制細胞色素C還原速率達50％所需要的酶量為一個活力單位。注意事項：重金屬離子易使黃嘌呤氧化酶失活，因此反應體系中必須添加EDTA。反應體系中含過氧化氫酶可引起還原型細胞色素C發(fā)生過氧化作用，從而干擾檢測的正確。第49頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日50聯(lián)苯三酚法原理：在堿性條件下，聯(lián)苯三酚會發(fā)生自氧化生成紅酚，同時生成O2-。定義:在一定條件下，每分鐘抑制聯(lián)苯三酚自氧化速率達50％的酶量為一個酶活力單位。第50頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日51操作定義:在一定條件下，每分鐘抑制聯(lián)苯三酚自氧化速率達50％的酶量為一個酶活力單位。第51頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日52實例：尿激酶（urokinase）

本品系從新鮮人尿中提取的一種激活纖維蛋白溶酶原的酶。由高分子量54000和低分子量33000組成的混合物，高分子量含量不得少于90%，每1mg蛋白中尿激酶活力不得少于12萬U，蛋白分解藥物。第52頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日53尿激酶（一）性狀本品為白色非結晶狀粉末（二）鑒別取比活力測定項下的供試品溶液，用巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）稀釋成每1ml中含20U的溶液，吸取1ml，加纖維蛋白原溶液0.3ml，再依次加入纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml，凝血酶溶液0.2ml，迅速搖勻，立即置37±0.5℃恒溫水浴中保溫，記時，反應系統(tǒng)應在30～45s內凝結，且凝塊在15min內重新溶解。以0.9%氯化鈉溶液作空白，同法操作，凝塊在2h內不溶。第53頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日54（三）檢查

1．溶液的澄清度與顏色，

應澄清無色。2．分子組分比

取本品，加水制成每1ml中含2mg的溶液后，加入等體積的緩沖液（取濃縮膠緩沖液2.5ml，20%十二烷基磺酸鈉溶液2.5ml，20%十二烷基磺酸鈉溶液的10ml），置水浴中3min，放冷，作為供試品溶液；取供試品溶液10μl，加至樣品孔，照電泳法測定，按下式計算高分子尿激酶相對含量（%）。第54頁，共58頁，星期日，2025年，2月5日55（三）檢查3．干燥失重

取本品，以五氧化二磷為干燥劑，在60