ICS03.080.99CCSX00DeterminationofasparagineandglutamineinfruitsandvegetablesbyLC-MS/MSIT/SATA079—2024前言 2規范性引用文件 3術語和定義 4原理 5試劑與材料 6儀器和設備 27分析步驟 28結果計算 49靈敏度、精密度 4附錄A（資料性）天冬酰胺和谷氨酰胺標準溶液及其內標的液相色譜-串聯質譜圖 6T/SATA079—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由深圳市計量質量檢測研究院提出。本文件由深圳市分析測試協會歸口。本文件起草單位：深圳市計量質量檢測研究院、深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心、深圳深檢集團醫學檢驗實驗室。本文件主要起草人：肖偉敏、葉新玉、王奇、孫亮、李子櫻、楊國武、趙云霞、唐淑軍、孫麗萍、劉成文、陳欣、張玉鑫、黃城益、顏沁、朱澤超、林偉杰、孫勝男。1T/SATA079—2024果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺含量測定高效液相色譜-串聯質譜法本文件規定了果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺的高效液相色譜-串聯質譜測定方法。本文件適用于新鮮果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T32465-2015化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理試樣經灰色鏈霉菌蛋白酶酶解，并加入抗氧化劑丁基羥基苯甲醚處理，稀釋后用液相色譜-串聯質譜法測定，同位素內標法定量。5試劑與材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規定的一級水。5.1試劑5.1.1甲醇（CH3OH）：質譜純。5.1.2甲酸（CH2O2）：色譜純。5.1.3乙醇（CH3CH2OH）：分析純。5.1.4濃鹽酸（HCl）。5.1.5丁基羥基苯甲醚（C11H16O2，BHA）。5.1.6灰色鏈霉菌蛋白酶（XIV型；來源于灰色鏈霉菌）：酶活力≥3.5U/mg。5.1.7三羥甲基氨基甲烷（Tris堿，C4H11O3N）。5.2試劑配制5.2.10.02%甲酸水溶液：吸取0.2mL甲酸至1L容量瓶中，定容至刻度，混勻。臨用前配置。5.2.2丁基羥基苯甲醚溶液（40mg/mL）：稱取4.00gBHA，用乙醇溶解并轉移至100mL容量瓶中，定容至刻度。臨用前配置。5.2.3蛋白酶溶液（52.5U/mL稱取0.15g灰色鏈霉菌蛋白酶，用Tris緩沖液溶解并轉移至10mL容量瓶中，定容至刻度。臨用前配置。5.2.4鹽酸溶液（1.0mol/L）：移取8.3mL濃鹽酸至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。常溫保存，2T/SATA079—2024有效期1個月。5.2.5Tris緩沖液（0.05mol/L稱取6.06g三羥甲基氨基甲烷于1000mL燒杯中，加水800mL溶解，用1.0mol/L鹽酸溶液調節溶液pH至8.0±0.1，轉移至1L容量瓶中，用水定容至刻度。4℃保存，有效期1個月。5.3標準品5.3.1天冬酰胺標準品（C4H8N2O3，CAS號：70-47-3）：純度≥99%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。5.3.2谷氨酰胺標準品（C5H10N2O3，CAS號：56-85-9）：純度≥99%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。5.3.3天冬酰胺同位素內標（天冬酰胺水合物-15N2，C4H815N2O3·H2O，CAS：287484-32-6）：純度≥98%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。5.3.4谷氨酰胺同位素內標（谷氨酰胺-15N2，C5H1015N2O3，CAS：204451-48-9）：純度≥98%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。5.4標準溶液配制5.4.1天冬酰胺標準儲備液（2.00mg/mL）：準確稱取100mg（精確至0.0001g）天冬酰胺標準品，用20%甲醇溶液溶解并轉移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3個月。5.4.2谷氨酰胺標準儲備液（2.00mg/mL）：準確稱取100mg（精確至0.0001g）谷氨酰胺標準品，用20%甲醇溶液溶解并轉移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3個月。5.4.3外標混合標準中間液（20.0μg/mL）：分別移取標準儲備液各1.00mL至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。臨用前配置。5.4.4外標混合標準工作液（1.00μg/mL）：移取0.50mL外標混合標準中間液（5.4.3）至10mL容量瓶中，用水定容至刻度。臨用前配置。5.4.5天冬酰胺-15N2內標標準儲備液（2.00mg/mL準確稱取114mg（精確至0.0001g）天冬酰胺水合物-15N2標準品，用20%甲醇水溶解并轉移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3個月。5.4.6谷氨酰胺-15N2內標標準儲備液（2.00mg/mL準確稱取100mg（精確至0.0001g）谷氨酰胺-15N2標準品，用20%甲醇水溶解并轉移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3個月。5.4.7同位素內標混合溶液（天冬酰胺-15N22.00μg/mL和谷氨酰胺-15N22.00μg/mL）：分別準確移取1.00mL天冬酰胺-15N2和1.00mL谷氨酰胺-15N2儲備液于1L容量瓶中，用水定容至刻度。臨用前配置。5.4.8混合標準系列工作液：分別準確移取適量的外標混合標準工作液（5.4.4）和1.00mL同位素內20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL的混合標準系列工作液。臨用前配置。6儀器和設備6.1液相色譜-串聯質譜儀：配置電噴霧電離源。6.2分析天平：感量0.000lg。6.3漩渦混合器。6.4恒溫水浴鍋。6.5廚房機械料理機。7分析步驟7.1樣品前處理3T/SATA079—2024選取新鮮蔬菜或水果樣品500g并粉碎均勻，準確稱取混合均勻的試樣1.00g（精確至0.0001g）于20mL螺紋帶蓋玻璃瓶中，依次加入0.5mL蛋白酶溶液（5.2.3）、3.0mLTris緩沖液（5.2.5）、750μL（蔬菜）或250μL（水果）40mg/mLBHA溶液（5.2.2）和200μL甲醇，渦旋混勻。樣品溶液于37℃恒溫水浴酶解16h～18h。取出樣品溶液，冷卻至室溫，將酶解液全部轉移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。離心或者過濾得到試樣清液。準確吸取1.0mL試樣清液，稀釋5倍獲得試樣溶空白試驗：除不加試樣外，均按上述樣本分析步驟操作。7.2儀器參考條件7.2.1色譜條件液相參考色譜條件如下：a)色譜柱：五氟苯基柱（4.6mm×250mm，1.7μm）或性能相當者;b)流動相A：0.02%甲酸溶液；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序見表1;c)流速：0.5mL/min;d)柱溫：35℃;e)進樣體積：5μL。表1超高效液相色譜洗脫梯度參考條件7.2.2質譜條件a)離子化模式：電噴霧正離子電離（ESI+）；b)掃描方式：多反應監測模式（MRM）；c)霧化器溫度：300℃;d)離子傳輸毛細管溫度：250℃;e)噴霧電壓：3500V；f)鞘氣流速：12.6L/min；g)輔助氣流速：3.0L/min；h)監測離子對和定量離子對等信息詳見表2。表2質譜參數天冬酰胺-N4T/SATA079—2024谷氨酰胺-N7.3標準曲線的制作將標準混合系列工作液分別注入液相色譜-串聯質譜儀中，以目標化合物與其同位素內標的峰面積比值為縱坐標，以標準系列工作液中目標化合物的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。標準溶液多反應監測（MRM）色譜圖見附錄A中圖A.17.4定性和定量7.4.1保留時間被測試樣中目標色譜峰與相應標準色譜峰的保留時間相比較，相對誤差應在±2.5%之內。7.4.2離子豐度比在相同測試條件下，試樣中的天冬酰胺和谷氨酰胺色譜峰保留時間與標準工作溶液相比，偏差范圍在±2.5%以內，且檢測到的離子的相對豐度，應當與濃度相當的標準工作液相對豐度一致，其允許偏差不超過表3規定的范圍。表3定性時離子豐度比的最大允許偏差7.4.3試樣溶液的測定將處理完畢的試樣（7.1）按儀器參考條件（7.2）進行測定，得到相應的樣品溶液的色譜峰面積。根據標準曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數不少于兩次。8結果計算將液相色譜-質譜測得濃度代入下式計算含量：式中：X——試樣中天冬酰胺、谷氨酰胺的含量，單位為毫克每百克（mg/100gP——由標準曲線得到的試樣溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的濃度，單位為納克每毫升（ng/mLP0——由標準曲線得到的空白試驗溶液中被測化合物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——試樣定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質量，單位為克（gf——試樣上清液稀釋倍數；100——單位換算系數；1000——單位換算系數。結果保留三位有效數字。9靈敏度、精密度5T/SATA079—20249.1靈敏度以3倍信噪比（S/N=3）對應的目標物濃度