紅象草中花青素提取技術規程1范圍本文件規定了紅象草中花青素提取技術的術語和定義、儀器設備、原料要求、提取工藝、檢驗方法、貯藏管理等技術。本文件適用于實驗室中紅象草中花青素的提取。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法NY/T2640植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法3術語和定義3.1紅象草PennisetumpurpureumSchumab紅象草(PennisetumpurpureumSchumab)為多年生禾本科狼尾草屬(Pennisetum)，莖葉為紫紅色，又叫紫狼尾草、紫象草。3.2花青素anthocyanins是深紅色、紫色或藍色植物中廣泛存在的一類水溶性黃酮類天然色素，是花色苷水解而得的有顏色的糖苷衍生物。4試劑除另有說明外，所用試劑均為分析純，提取用水應符合GB/T6682中三級水的要求。4.1無水乙醇。4.2鹽酸：優級純，純度為35%～37%。4.350%酸性乙醇（1%鹽酸酸化處理，pH=2）5儀器設備5.1天平（感量0.01g)。5.2組織搗碎機。5.3超聲波儀。5.4真空冷凍干燥機。5.5旋轉蒸發儀。6原料要求6.1原料刈割時期刈割高度為1.5m～2.5m的紅象草6.2原料管理6.2.1原料存儲過程中防止雨淋、霉變、污染和鼠（蟲）害。6.2.2原料儲存時間不超過1周，儲存條件應遮陽、通風。6.3原料預加工6.3.1清除原料中金屬、石塊、塑料等異物。6.3.2原料提取前應進行粉碎處理，長度不宜超過50mm。7提取工藝7.1工藝流程紅象草中花青素提取工藝流程，紅象草→粉碎→粗提→過濾→濃縮→凍干→花青素。7.2原料制備紅象草經組織搗碎機搗碎、混勻，置于-18°C以下密封保存備用。7.3提取按料液比49:1，稱取粉碎后的紅象草樣品，量取相應量的50%酸性乙醇，于50°C超聲波儀（功率480W，頻率50KHz）中超聲提取30min，過濾，4000rpm離心5min，上清液轉入圓底燒瓶，重復上述操作1次，合并提取液。7.4濃縮提取液于50°C水浴下旋轉蒸發儀上減壓濃縮，待冷凝器無液滴滴下，收集濃縮液。7.5純化用有機溶劑（如乙酸乙酯）萃取花青素，去除水溶性雜質。使用硅膠柱或C18反相柱，用不同極性的溶劑洗脫，分離花青素。7.6凍干將濃縮液置于冷凍干燥機中，在真空度100Pa，溫度-45°C條件下凍干24h，得到凍干物為紅象草花青素提取物。8檢驗方法應符合附錄A的規定。9貯藏管理干品應密封后置于-18°C下避光貯存或者在冷庫內避光貯存。貯藏場所應保持清潔、干燥，防蟲、防鼠。

附錄A（規范性）花青素的測定A.1范圍本文件規定了紅象草原料及提取液中飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素共6種花青素的高效液相色譜測定方法。本文件適用于紅象草原料及提取液中花青素含量的測定。本標準的檢出限：以稱樣量為1g，定容體積為50mL計，飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素5種花青素的方法定量限均為0.5mg/kg；矮牽牛色素的方法定量限為1.5mg/kg。A.2原理紅象草中的花青素主要以花色苷的形式存在。試樣經乙醇一水的強酸溶液超聲提取花色苷后，經水浴后將花色苷水解成花青素，用高效液相色譜法測定，以保留時間定性，外標法定量。A.3試劑和材料除另有說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水應符合GB/T6682中一級水的要求。A.3.1無水乙醇(C2H5OH)：色譜純。A.3.2甲酸(CH2O2)：色譜純。A.3.3甲醇(CH3OH)：色譜純。A.3.4鹽酸(HCl)：優級純，純度為35%～37%。A.3.5提取液：無水乙醇+水+鹽酸=1+1+0.01(V+V+V)，取100mL無水乙醇、100mL水和1mL鹽酸混勻。A.3.610%鹽酸甲醇溶液(體積比)：取10mL鹽酸、90mL甲醇混勻。A.3.7飛燕草色素(Delphinidin)：CAS號528-53-0，純度≥96%。A.3.8矢車菊色素(Cyanidin)：CAS號528-58-5，純度≥98%。A.3.9矮牽牛色素(Petunidinchloride)：CAS號1429-30-7，純度≥96%。A.3.10天竺葵色素(Pelargonidin)：CAS號134-04-3，純度≥96%。A.3.11芍藥素(Peonidin)：CAS號134-01-0，純度≥98%。A.3.12錦葵色素(Malvidin)：CAS號643-84-5，純度≥96%。A.3.13單標儲備溶液分別準確稱取飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素共6種花青素標準品5.0mg，用10%鹽酸甲醇溶液（A.3.6）溶解并分別定容至10mL容量瓶中，即為500mg/L的單標儲備液，于-18℃下，貯存于密閉的棕色玻璃瓶中，保存有效期為6個月。A.3.14混合標準工作溶液在使用中將單一標準儲備液進行混合后，用10%鹽酸甲醇溶液（A.3.6）作為溶劑，并逐級稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0mg/L或其他濃度的花青素混合標準工作溶液。在4℃條件下，有效期為6個月。A.3.15濾膜：0.45μm水相濾膜。A.4儀器和設備A.4.1高效液相色譜儀，配備紫外或二極管陣列檢測器。A.4.2天平：精度0.01mg，0.01g。A.4.3水浴鍋：精度±2°C。A.4.4組織搗碎機。A.4.5超聲波儀。A.4.650mL具塞比色管。A.5分析步驟A.5.1供試品溶液的制備紅象草：準確稱取1.00g樣品，加入50mL具塞比色管中，加入50mL提取液（A.3.5）定容至刻度，搖勻1min后，于50°C超聲波儀（功率480W，頻率50KHz）中超聲提取30min，放至室溫后，加入提取液（A.3.5）至刻度，搖勻，離心或放至澄清后取上清液作為供試品溶液。A.5.2測定A.5.2.1色譜參考條件色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm×5μm或性能相當者；b)流動相A為含1%甲酸水溶液，流動相B為含1%甲酸乙腈溶液；c)檢測波長：530nm;d)柱溫：35°C;e)進樣量：10μL;f)流速1.0mL/min，梯度洗脫條件，見表1。表1梯度洗脫表時間，min流動相A%流動相B%088122881258515108218128218158020168812208812A.5.3色譜分析分別將標準溶液和試樣溶液，注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以樣品溶液峰面積與標準溶液峰面積比較定量。色譜圖參見圖A.1。TT/min紫外吸收強度/mAU圖A.1花青素標準溶液（1.0mg/L）色譜圖A.6結果計算樣品中花青素含量為6種花青素含量之和。其含量以質量濃度X計，單位為毫克每千克(mg/kg)，按式(A.1)計算。……