GB/TXXXXX—XXXX

酶聯免疫試劑盒檢測通則

1范圍

本文件描述了酶聯免疫試劑盒的檢測一般要求和檢測過程。

本文件適用于酶聯免疫試劑盒的檢測。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T4889數據的統計處理和解釋正態分布均值和方差的估計與檢驗

GB/T27404實驗室質量控制規范食品理化檢測

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4一般要求

產品

酶聯免疫試劑盒應附產品說明書，或等同的指導性文件。

實驗室

實驗室的生物安全管理應符合GB19489中的相應要求。

檢測人員

檢測人員應熟悉相關法律法規、檢測方法原理，掌握質量檢測操作規范、技術標準、質量管理和實

驗安全等專業知識和技能。

檢測指標

標準曲線相關系數、靈敏度、精密度、正確度和特異性。

5檢測過程

檢測樣品的選擇及制備

1

GB/TXXXXX—XXXX

5.1.1陰性樣品與待分析樣品應來源于同一物種，并具有相似的結構特性，包括不含有或方法學未能

檢出目標分析物的樣品，以及含有或添加其他與目標分析物結果類似物質（易產生交叉反應）的樣品，

按酶聯免疫試劑盒說明書的步驟進行前處理。

5.1.2陽性樣品是指含有目標分析物的待測樣品，按酶聯免疫試劑盒說明書的步驟進行前處理。

5.1.3陰性樣品和陽性樣品應具有基質符合性，以及與實際樣品所含除目標分析物外其他成分的相似

性，重點考慮典型樣品基質或相似基質，綜合考慮蛋白、脂肪、水分、糖分、高聚物或多聚體物質、色

澤、酸堿性等影響檢測的組分進行區分選擇。

5.1.4對于多種目標分析物的檢測，盡可能對全部目標分析物進行檢測，若因客觀條件限制不能檢測

全部目標分析物，宜對所有目標分析物進行分類（如結構類似程度、危害程度等），每一類至少選擇一

種目標分析物進行檢測。

5.1.5陽性樣品或陰性樣品宜采用國家有證標準物質、參考物質或者質量控制品等，選擇適宜的實驗

室標準分析方法或經典方法對樣品中的目標分析物進行儀器測定，確認所有陰性樣品不能檢出目標分

析物，確認所有陽性樣品中目標分析物的濃度。測定完成后的各類樣品應進行隨機編號處理，形成盲樣，

可自行制備。

試劑準備

將試劑盒從冷藏環境中取出，在室溫平衡15-30分鐘后，按照酶聯免疫試劑盒說明書配制標準品、

洗滌緩沖液、樣本稀釋液、抗體工作液、酶標抗體工作液、底物、終止液等相關試劑。

操作步驟

根據待測樣本數量、系列標準溶液、空白對照孔的數量決定所需的酶標板板條數，每個樣本及標準

溶液重復測定2次或3次。記錄實際加樣情況，按照酶聯免疫試劑盒說明書中的步驟進行操作。

結果計算

5.4.1標準曲線

按照酶聯免疫試劑盒說明書的程序操作，讀取各孔的吸光值并取平均值，通過系列標準濃度與針對

每個濃度獲得的平均吸光值繪制標準曲線。得到四參數擬合標準曲線或其他規定的標準曲線。

以標準品吸光度值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，進行四參數曲線擬合，按式（1）建立方程，

并計算相關系數。

???

y=?+?······································································(1)

1+()?

??50

式中：

y—吸光度值；

a—最大吸光度值；

b—吸光度增加速率參數，即曲線在EC50處的斜率；

EC50—半數抑制濃度；

d—最小吸光度值；

相關系數的計算：利用數據統計處理軟件計算相關系數。

2

GB/TXXXXX—XXXX

5.4.2數據計算

通過標準曲線計算得到每個樣本的測定濃度值。若樣本吸光度值超出標準曲線范圍，則先稀釋至合

適倍數，重新進行檢測，其分析結果為標準曲線計算獲得的濃度乘以稀釋倍數。

數據分析

5.5.1靈敏度

重復測定空白樣本或陰性樣本不少于10次，通過標準曲線計算得到對應濃度的平均值（??0）和標準

偏差（s），計算??0+3s，即為檢出限。計算??0+10s，即為定量限。

5.5.2精密度

使用同一批次的試劑盒，選取低、中、高3個濃度水平的陽性樣本重復測定10次，計算得到批內變

異系數。使用3個不同批次的同一試劑盒，選取低、中、高3個濃度水平的陽性樣本每個批次重復測定3

次，計算得到批間變異系數。

按式（2）計算變異系數：

?

CV=×100%·········································································(2)

??

式中：

CV—變異系數，單位為%；

s—標準偏差；

??—重復測定的平均值。

實驗室內的變異系數范圍可參考附錄A。

5.5.3正確度

5.5.3.1與參比方法的一致性

采用試劑盒與已知的國際或國家認可的參考方法對同一份樣本進行重復測定10次，按GB/T4889中

的F檢驗和T-檢驗進行評價，具體參見附錄B。

5.5.3.2采用有證標準物質

對有證標準物質進行10次重復檢測，計算10次重復檢測的平均值、標準偏差和變異系數，按照公式

（3）計算正確度。

檢測值

正確度(%)=×100%·····························································(3)

認定值

5.5.3.3回收率

選用試劑盒適用的每種基體，添加低、中、高3個濃度水平的目標分析物，每個水平重復測定10次，

計算檢測結果的平均值與理論值的偏差。3個濃度水平的偏差范圍可參考附錄C。

5.5.4特異性

按照酶聯免疫試劑盒說明書的程序操作，測定與目標物的結構類似物或功能類似物的交叉反應。

3

GB/TXXXXX—XXXX

對于夾心法試劑盒，配制一定濃度（C）的結構類似物，采用試劑盒檢測計算得到相應的濃度(C′)，

按照公式（4）計算交叉反應率（CR）。

?′

CR=×100%·······································································(4)

?

式中：

CR—交叉反應率，單位為%；

C—結構類似物的配制濃度；

C′—結構類似物的測定濃度；

對于競爭法試劑盒，將結構類似物稀釋至系列濃度，按照4.4.1步驟得到相應的半數抑制濃度，按

照公式（4）計算交叉反應率。

目標物的??

CR=50×100%·································································(5)

類似物的??50

式中：

CR—交叉反應率，%；

EC50—半數抑制濃度，根據標準曲線計算得到。

4

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附錄A

（資料性）

實驗室內部的變異系數范圍

被測組分含量實驗室內變異系數（CV）/%

0.1μg/kg43

1μg/kg30

10μg/kg21

100μg/kg15

1mg/kg11

10mg/kg7.5

100mg/kg5.3

1000mg/kg3.8

1%2.7

10%2.0

100%1.3

本表引自GB/T27404-2008的附錄F.2。

5

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附錄B

（資料性）

與參比方法一致性評價

先采用F檢驗，考察酶聯免疫試劑盒與已知的國際或國家認可的參考方法所取得的兩組數據的標準

偏差是否一致；若一致，再采用配對T檢驗，考察兩組數據的平均值是否存在顯著性差異，若不存在顯

著性差異，說明兩種方法測定結構具有較好的一致性。

B.1F檢驗

按照公式B.1進行F檢驗，考察兩組檢測數據的標準偏差是否一致，若一致按B.2執行；若不一致，

則兩組檢測結果不一致。

?2

F=大·················(B.1)

?2

小

式中：

S大—兩組數據中標準偏差大的數值；

S小—兩組數據中標準偏差小的數值；

B.2T檢驗

按照公式B.2進行T檢驗，

|???|??

t=12√12·································································(B.2)

??1+?2

式中：

x1—第1組測定結果的平均值；

x2—第2組測定結果的平均值；

s—兩組等精度測定結果的合并實驗標準偏差；

n1—第1組測定的平行測定次數；

n2—第2組測定的平行測定次數。

其中，兩組等精度測定結果的合并實驗標準偏差s按公式B.3計算：

(??1)?2+(??1)?2

s=√1122······························································(B.3)

?1+?2?2

式中：

s1—第1組測定結果的標準偏差；

s2—第2組測定結果的標準偏差。

6

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附錄C

（資料性）

回收率偏差范圍

濃度水平范圍回收率范圍

mg/kg%

>10095-105

1-10090-110

0.1-180-110

<0.160-120

本表引自GB/T27404-2008的附錄F.1。

7

ICS點擊此處添加ICS號

CCS點擊此處添加CCS號

中華人民共和國國家標準

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`

酶聯免疫試劑盒檢測通則

Guidelinesforenzymeimmunoassayskittest

(點擊此處添加與國際標準一致性程度的標識)

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

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酶聯免疫試劑盒檢測通則

1范圍

本文件描述了酶聯免疫試劑盒的檢測一般要求和檢測過程。

本文件適用于酶聯免疫試劑盒的檢測。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

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GB/T4889數據的統計處理和解釋正態分布均值和方差的估計與檢驗

GB/T27404實驗室質量控制規范食品理化檢測

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4一般要求

產品

酶聯免疫試劑盒應附產品說明書，或等同的指導性文件。

實驗室

實驗室的生物安全管理應符合GB19489中的相應要求。

檢測人員

檢測人員應熟悉相關法律法規、檢測方法原理，掌握質量檢測操作規范、技術標準、質量管理和實

驗安全等專業知識和技能。

檢測指標

標準曲線相關系數、靈敏度、精密度、正確度和特異性。

5檢測過程

檢測樣品的選擇及制備

1

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5.1.1陰性樣品與待分析樣品應來源于同一物種，并具有相似的結構特性，包括不含有或方法學未能

檢出目標分析物的樣品，以及含有或添加其他與目標分析物結果類似物質（易產生交叉反應）的樣品，

按酶聯免疫試劑盒說明書的步驟進行前處理。

5.1.2陽性樣品是指含有目標分析物的待測樣品，按酶聯免疫試劑盒說明書的步驟進行前處理。

5.1.3陰性樣品和陽性樣品應具有基質符合性，以及與實際樣品所含除目標分析物外其他成分的相似

性，重點考慮典型樣品基質或相似基質，綜合考慮蛋白、脂肪、水分、糖分、高聚物或多聚體物質、色

澤、酸堿性等影響檢測的組分進行區分選擇。

5.1.4對于多種目標分析物的檢測，盡可