豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究

研究背景 老年性癡呆即阿爾茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是老年人最常見的以進行性癡呆為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病。目前臨床上治療老年癡呆缺乏有效的措施。近年來流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，單純生活方式的改變可以影響AD的發(fā)生和進展，但機理不清楚。

豐富環(huán)境（EE）干預(yù)作為生活方式改變的一種形式，可促進腦損傷及神經(jīng)變性疾病的恢復(fù)，包括外傷性顱腦損傷，癲癇持續(xù)狀態(tài)，帕金森病等。豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4

豐富環(huán)境：1947年美國人Hebb提出豐富環(huán)境的概念，這一模式被廣泛用來研究環(huán)境對腦功能的影響，包括對正常動物模型以及各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型的研究。1978年豐富環(huán)境首次被定義為：復(fù)雜的無生命物與社會刺激的復(fù)合體。即動物的飼養(yǎng)環(huán)境空間增大，內(nèi)置物體豐富而新奇,成員較多，不僅提供了多感官刺激和運動的機會，而且賦予了相互間社交行為的可能。豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4

突觸可塑性：突觸可塑性是神經(jīng)可塑性的主要表現(xiàn)，可分為結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性。突觸結(jié)構(gòu)可塑性指突觸形態(tài)的改變以及新的突觸連接形成和傳遞功能的建立，是一種持續(xù)時間較長的可塑性。突觸功能可塑性指突觸的反復(fù)活動引致突觸傳遞效率的增加或降低豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4突觸的數(shù)密度(Nv)、平均面積(S)、面密度(Sv)被認(rèn)為是突觸可塑性形態(tài)學(xué)研究的可靠參數(shù)突觸素的表達(dá)和突觸的形成是一致的，突觸素是突觸發(fā)生的一個重要標(biāo)志，突觸重建時突觸素含量明顯增多

老年性癡呆最主要的病理改變是腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損傷及膽堿能神經(jīng)元丟失，也是造成學(xué)習(xí)記憶能力下降的直接原因，因此本實驗應(yīng)用鵝膏蕈氨酸基底前腦注射，破壞模型動物腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，造成膽堿能神經(jīng)元丟失，可模擬老年性癡呆

本課題采用鵝膏蕈氨酸基底核前腦注射破壞模型動物，造成膽堿能神經(jīng)元丟失，以模擬老年性癡呆，從神經(jīng)行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)角度探討豐富環(huán)境對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響，旨在揭示豐富環(huán)境干預(yù)AD作用機制，為豐富環(huán)境治療AD臨床推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)技術(shù)路線研究方法1、材料及豐富環(huán)境準(zhǔn)備Wistar大鼠，40只，雄性，體重160～180g,清潔級,隨機分為標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境正常組、標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組，豐富環(huán)境模型組，豐富環(huán)境正常組各10只豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4豐富環(huán)境模型參照文獻加以改進，鼠籠規(guī)格為120cm×100cm×60cm，籠內(nèi)設(shè)有金屬制小橋和斜架、直徑3cm隧道(聚氯乙烯樹脂材料制成)、塑料跑籠、金屬鏈條、各種形狀及顏色的塑料玩具(球、盒、鈴檔等)和木制積木，每2-3d清潔并更換1次?；\內(nèi)安裝有L形隧道、塑料轉(zhuǎn)輪、小球等玩具，每籠5只，持續(xù)時間為28d。豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境正常組、標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組大鼠飼養(yǎng)于普通鼠籠中，籠內(nèi)有墊料。環(huán)境溫度保持23-25?C，維持12h照明、12h黑暗的光照周期，實驗動物自由進食、飲水。在豐富環(huán)境與正常環(huán)境條件下培養(yǎng)8周2、動物模型制作 將大鼠用10%水合氯醛麻醉，腦立體定位儀固定平顱頭位，參照大鼠腦定位圖譜,在前囟前(AP)0.8mm、中線旁開(ML)3.0mm處，距顱骨表面深度(DV)7.5mm雙側(cè)各注鵝膏蕈氨酸（購自sigma公司）1μl(10g/L溶于0.5MPBS中)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境對照組注射等量PBS3指標(biāo)檢測3.1采用物體識別實驗（ORT）和物體位置實驗(OLT)評價大鼠的非空間學(xué)習(xí)、記憶能力，兩種測試任務(wù)沒有任何刺激源，不會影響動物的自主活動物體識別實驗是利用嚙齒類動物喜歡對新的物體進行探測的行為來判斷動物是否記住了先前遇過的物體，如果記住了舊的物體，則動物應(yīng)對舊的物體的探索時間少于新的物體豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4物體辨識實驗（ORT）示意圖物體位置辨識實驗（OLT）示意圖豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4結(jié)果以辨識指數(shù)表示，越高即表示動物的學(xué)習(xí)記憶能力越好，反之學(xué)習(xí)記憶能力差。辨識指數(shù)（DI）計算公式：DI=(Tn?Tf)/(Tf+Tn)其中Tn代表大鼠在識別期探索新物體的時間，Tf代表大鼠在識別期探索舊物體的時間。3.2海馬突觸形態(tài)可塑性檢測（1）電鏡標(biāo)本制備及觀察3%戊巴比妥麻醉→斷頭剝腦取海馬→固定→丙酮梯度脫水→浸透→包埋→切片(厚600A0)→230目銅網(wǎng)撈片→3%檸檬酸鉛+0.1%醋酸鈾雙重電子染色→觀察突觸Nv、Sv，S

豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4突觸的數(shù)密度(NV)即單位參照系體積中突觸的數(shù)目，是揭示參與某一神經(jīng)活動過程的神經(jīng)元接點數(shù)目的直接指標(biāo)。突觸的面密度(SV)為單位參照系體積中的突觸面積，突觸數(shù)量和大小的綜合性指標(biāo)，反映的是突觸連接帶表面積在組織中的密度平均面積(S)為突觸連接帶的平均面積豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4（2）組織切片制備麻醉→取左側(cè)大腦半球→福爾馬林固定→脫水→透明→石蠟包埋→切片豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4取腦：每組隨機取7只大鼠麻醉，斷頭處死，在冰臺上快速取出腦組織，分離出左側(cè)大腦半球，將附著在腦組織上的腦膜剝離干凈后，從前額開始冠狀位將腦組織切成從前至后切成4部分豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4（3）免疫組織化學(xué)反應(yīng)滴加3%過氧化氫甲醇溶液，室溫孵育10min,PBS沖洗→加非免疫性動物血清，室溫孵育30min→加突觸素抗體，4C孵育24h,PBS沖洗→滴加第二抗體，室溫孵育30min,PBS沖洗→加鏈親和素—過氧化物酶溶液，室溫孵育30min,PBS洗3次→DAB顯色3-10min→貼片、常規(guī)脫水、透明→封片

豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4

陰性對照組省去第一抗體，其余步驟相同。在全自動圖像分析系統(tǒng)測定海馬突觸素免疫反應(yīng)物的光密度值(OD值)，同時在相同的光學(xué)條件下測定相應(yīng)每張切片胼胝體OD值作背景，免疫反應(yīng)物的OD值減去背景OD值得到校正OD值，即免疫反應(yīng)物的光密度值豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4預(yù)期目標(biāo)

豐富環(huán)境可能會改善擬老年癡呆(AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶，增強海馬突觸的可塑性，促進突觸結(jié)構(gòu)重建。豐富環(huán)境可成為AD重要治療手段。豐富環(huán)境對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響研究-4研究進度2011年3月—2011年6月模型制作