基于噬菌體展示平臺挖掘尖吻蝮蛇毒抗炎多肽的關鍵技術與機制研究一、引言1.1研究背景炎癥，作為機體應對刺激的一種復雜防御反應，通常表現為紅、腫、熱、痛和功能障礙。在多數情況下，炎癥是有益的，是身體的自動防御機制，但在某些異常情況下，炎癥反應會失控，對人體自身組織發起攻擊，引發一系列炎癥相關疾病，嚴重影響人們的生活質量。常見的炎癥疾病如類風濕性關節炎，全球患者數量眾多，據統計，其在成年人中的發病率約為0.5%-1%，患者不僅關節疼痛、腫脹，還可能導致關節畸形，嚴重影響關節功能和日常生活。潰瘍性結腸炎也困擾著大量人群，它會引起腸道黏膜炎癥、潰瘍，導致腹痛、腹瀉、便血等癥狀，給患者帶來極大的痛苦。此外，像腸炎、敗血性休克等炎癥疾病，也對人類健康構成嚴重威脅。腫瘤壞死因子（TNF-α）在炎癥反應中扮演著關鍵角色，它是一種具有多種生物學功能的細胞因子，與多種自身免疫和炎癥疾病密切相關。許多炎癥疾病的發生發展過程中，都能觀察到TNF-α水平的異常升高，它通過與細胞表面的受體結合，激活一系列下游信號通路，引發炎癥級聯反應。目前，針對TNF-α的治療策略主要是使用小分子抑制劑，但這些藥物大多價格昂貴，且存在較大的副作用，如增加感染風險、引發過敏反應等。而且，TNF-α與其受體的結合面積較大，小分子難以有效阻斷其相互作用，限制了小分子抑制劑的療效。相比之下，多肽類物質由于其結構和功能的多樣性，在與大分子靶點結合方面具有獨特優勢，更適合作為拮抗TNF-α的候選藥物，為炎癥疾病的治療提供了新的思路和方向。蛇毒，作為一種復雜的生物活性混合物，含有多種蛋白質和多肽成分，在傳統醫學中，蛇被用作中藥材已有數百年歷史，然而，其有效成分和作用機制仍存在許多未知。現代科學研究表明，蛇毒中的某些成分具有抗腫瘤、抗炎、抗中風和止痛等生物學活性。尖吻蝮蛇毒已被證實具有抗炎作用，但其具體的抗炎活性成分尚不明確。尖吻蝮蛇毒是一種復雜的混合物，包含多種酶類、多肽和其他生物活性物質，這些成分相互作用，可能共同發揮抗炎效果，也可能存在特定的關鍵多肽成分起主要作用。深入研究尖吻蝮蛇毒的抗炎成分，不僅有助于解析其抗炎作用機制，還可能為開發新型抗炎藥物提供寶貴的先導化合物。噬菌體展示技術是一種強大的分子生物學工具，自20世紀80年代被發明以來，得到了廣泛的應用和發展。該技術利用噬菌體作為載體，將外源多肽或蛋白質的基因與噬菌體外殼蛋白基因融合，使表達的多肽或蛋白質展示在噬菌體表面。通過構建大容量的噬菌體展示文庫，結合親和篩選技術，可以從眾多的多肽序列中快速篩選出與目標分子具有高親和力和特異性結合的多肽。在多肽藥物研發領域，噬菌體展示技術已成功篩選出多種具有潛在藥用價值的多肽，如用于癌癥治療的靶向多肽、抗病毒多肽等。其優勢在于能夠在體外模擬體內的生物分子相互作用，快速、高效地篩選出具有特定功能的多肽，大大縮短了藥物研發周期，降低了研發成本。因此，利用噬菌體展示技術篩選尖吻蝮蛇毒中的抗炎多肽，具有重要的理論意義和實際應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在利用噬菌體展示技術，從尖吻蝮蛇毒中篩選出具有高親和力和特異性的抗炎多肽。通過對篩選得到的多肽進行結構和功能分析，明確其與TNF-α或其他炎癥相關靶點的相互作用機制，從而解析尖吻蝮蛇毒的抗炎作用機制。同時，期望篩選出的抗炎多肽能夠作為先導化合物，為開發新型、高效、低毒的抗炎藥物奠定基礎。炎癥疾病嚴重影響人類健康和生活質量，目前臨床上的治療藥物存在諸多局限性，如小分子抑制劑價格昂貴、副作用大且療效有限。本研究的成果具有重要的理論意義和實際應用價值。在理論方面，深入研究尖吻蝮蛇毒中的抗炎多肽，有助于揭示蛇毒抗炎的分子機制，豐富對天然生物活性物質抗炎作用的認識，為炎癥相關領域的研究提供新的思路和理論依據。在實際應用方面，篩選出的抗炎多肽有望成為新型抗炎藥物的先導化合物，通過進一步的結構優化和藥物研發，開發出具有自主知識產權、療效顯著、副作用小的新型抗炎藥物，滿足臨床治療炎癥疾病的迫切需求，為廣大炎癥患者帶來福音。此外，本研究還將推動噬菌體展示技術在天然產物活性成分篩選領域的應用，為其他天然產物的研究和開發提供技術參考和借鑒。1.3研究現狀與趨勢1.3.1噬菌體展示技術的研究現狀噬菌體展示技術自問世以來，在生命科學領域得到了廣泛應用和深入研究。目前，該技術在多肽藥物研發、抗體工程、疫苗開發等方面取得了顯著成果。在多肽藥物研發方面，通過構建各種類型的噬菌體展示文庫，如隨機肽庫、天然肽庫等，研究人員已成功篩選出眾多與疾病相關靶點具有高親和力的多肽。這些多肽在癌癥治療、心血管疾病治療、神經退行性疾病治療等領域展現出巨大的潛力。例如，在癌癥治療中，篩選出的靶向腫瘤細胞表面特異性標志物的多肽，可用于開發腫瘤靶向藥物，提高藥物的療效并降低副作用。在抗體工程領域，噬菌體展示技術是制備重組抗體的重要手段。利用該技術，可以從大容量的抗體文庫中篩選出具有高親和力、高特異性的抗體，為抗體藥物的研發提供了豐富的資源。目前，已有多個基于噬菌體展示技術開發的抗體藥物獲批上市，如阿達木單抗、英夫利昔單抗等，用于治療類風濕性關節炎、克羅恩病等多種疾病。在疫苗開發方面，噬菌體展示技術可用于篩選和設計新型疫苗抗原。通過展示病原體的關鍵抗原表位，能夠誘導機體產生特異性免疫反應，為開發高效、安全的新型疫苗提供了新的策略。例如，利用噬菌體展示技術篩選出的流感病毒抗原表位，可用于制備流感疫苗，提高疫苗的免疫原性和保護效果。此外，噬菌體展示技術在蛋白質相互作用研究、生物傳感器開發等領域也發揮著重要作用。隨著技術的不斷發展和完善，噬菌體展示文庫的容量和多樣性不斷提高，篩選方法和策略也日益多樣化和高效化。例如，結合高通量測序技術（NGS），可以對篩選得到的噬菌體進行深度測序，快速準確地鑒定出與目標分子結合的多肽序列，大大提高了篩選效率和準確性。同時，新型的篩選策略如負篩、競爭篩選、交叉淘選等的應用，進一步提高了篩選的特異性和靈敏度。1.3.2尖吻蝮蛇毒的研究現狀尖吻蝮蛇毒作為一種復雜的生物活性物質，其研究主要集中在化學成分分析、生物活性研究以及藥用價值開發等方面。在化學成分分析方面，研究人員通過多種技術手段，如液相色譜-質譜聯用（LC-MS）、凝膠電泳等，對尖吻蝮蛇毒的成分進行了深入分析。發現尖吻蝮蛇毒中含有多種酶類，如磷脂酶A2、蛋白酶、透明質酸酶等，這些酶在蛇毒的毒性發揮、生理功能調節等方面起著重要作用。此外，還含有多種多肽和蛋白質，其中一些多肽具有獨特的氨基酸序列和結構，可能具有重要的生物學活性。在生物活性研究方面，尖吻蝮蛇毒已被證實具有多種生物活性。除了本研究關注的抗炎活性外，還具有抗腫瘤、抗凝血、抗血小板聚集等活性。例如，有研究表明尖吻蝮蛇毒中的某些成分能夠抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，誘導腫瘤細胞凋亡，具有潛在的抗腫瘤應用價值。在抗凝血方面，尖吻蝮蛇毒中的一些酶和多肽可以作用于凝血因子，影響凝血過程，可用于開發抗凝血藥物。在藥用價值開發方面，尖吻蝮蛇毒在傳統中醫藥中已有應用，并且近年來越來越受到現代醫學的關注。目前，基于尖吻蝮蛇毒開發的藥物主要集中在抗凝血和溶栓領域，如尖吻蝮蛇毒血凝酶已被廣泛應用于臨床止血。然而，對于尖吻蝮蛇毒中其他生物活性成分的開發利用還相對較少，尤其是抗炎多肽的研究尚處于起步階段，有待進一步深入探索。1.3.3研究趨勢隨著生命科學和生物技術的不斷發展，噬菌體展示技術和尖吻蝮蛇毒的研究呈現出以下趨勢：在噬菌體展示技術方面，一是與其他先進技術的融合將更加緊密。例如，與人工智能（AI）、機器學習（ML）等技術結合，利用AI和ML算法對噬菌體展示文庫的篩選數據進行分析和預測，能夠更高效地篩選出具有特定功能的多肽，加速藥物研發進程。二是文庫的設計和構建將更加多樣化和智能化。通過合理設計文庫的結構和組成，引入更多的氨基酸多樣性和結構多樣性，提高篩選到高活性多肽的概率。同時，開發智能化的文庫構建技術，能夠根據目標靶點的特點和需求，定制化構建噬菌體展示文庫。三是在體內篩選和應用方面將取得更多突破。目前，噬菌體展示技術主要應用于體外篩選，未來有望實現體內篩選，直接在動物模型或人體中篩選與疾病相關靶點結合的多肽，為藥物研發提供更直接、更有效的手段。在尖吻蝮蛇毒研究方面，一是深入挖掘其抗炎等生物活性的分子機制。通過蛋白質組學、代謝組學等多組學技術，全面解析尖吻蝮蛇毒中各種成分在抗炎過程中的作用靶點和信號通路，為開發新型抗炎藥物提供堅實的理論基礎。二是加強對尖吻蝮蛇毒中微量活性成分的研究。尖吻蝮蛇毒中可能存在一些含量較低但具有重要生物活性的成分，利用高靈敏度的分析技術和篩選方法，對這些微量成分進行分離、鑒定和功能研究，有望發現新的活性多肽和藥物先導化合物。三是推動尖吻蝮蛇毒的產業化開發。在深入研究其生物活性和作用機制的基礎上，結合現代制藥技術，開發更多基于尖吻蝮蛇毒的創新藥物和功能性產品，滿足臨床和市場的需求。綜上所述，將噬菌體展示技術應用于尖吻蝮蛇毒抗炎多肽的篩選，順應了當前生命科學和生物技術的發展趨勢，有望為炎癥疾病的治療帶來新的突破和發展。二、尖吻蝮蛇毒與抗炎研究基礎2.1尖吻蝮蛇毒的成分與特性2.1.1尖吻蝮蛇的生物學特征尖吻蝮蛇（Deinagkistrodonacutus），隸屬蝰科尖吻蝮屬，是一種具有重要生態和藥用價值的劇毒蛇類，在民間又被稱為五步蛇、白花蛇、百步倒、蘄蛇等。其起源可追溯至第三紀的始新世，歷經漫長的演化，逐漸形成了獨特的生物學特性。尖吻蝮蛇體型較為粗大，體長通常在0.9-1.2米之間，最長可達1.5米，體重約2.5千克。其最顯著的外觀特征是明顯翹起的吻尖以及呈三角形的頭部，這使得它在眾多蛇類中極易辨認。通體呈棕色與褐色，體背布有灰白或黃白色的菱形大斑塊，這些斑塊排列規則，宛如棋盤，腹部為白色，點綴著形態各異的黑斑，尾部長有一塊錐形大鱗片，這些獨特的色斑和鱗片特征，不僅有助于它在自然環境中進行偽裝，還可能在種內識別和交流中發揮作用。在地理分布上，尖吻蝮蛇主要分布于中國、越南和老撾。在中國，其分布范圍涵蓋了南部的多個省份，包括浙江、安徽、福建、江西、湖北、湖南、廣東、廣西、貴州、臺灣等地。它偏好棲息于海拔1200米以下潮濕陰暗的環境，如山區森林、山腳地帶、溪邊、石縫等。這些環境為尖吻蝮蛇提供了豐富的獵物資源和適宜的生存條件，使其能夠在其中繁衍生息。尖吻蝮蛇的生活習性獨特，具有明顯的季節性和晝夜活動規律。在氣溫較高的夏季，它的活動減少，多在陰涼處避暑；而在春秋季節，氣溫適宜，它的活動較為頻繁，積極覓食和尋找配偶。其冬眠期大致為12月初到翌年3月初，但不同地區的尖吻蝮蛇冬眠時間會存在一定差異。尖吻蝮蛇是肉食性動物，食性較為多樣，主要取食鼠類、鳥類、蛙類、蜥蜴類、蛇類以及昆蟲等。它利用頰窩和視覺進行獵物定位，頰窩是一種特殊的熱感應器官，能夠感知周圍環境中微小的溫度變化，幫助它準確地發現和捕捉獵物。在捕食時，尖吻蝮蛇通常采用伏擊的方式，隱藏在暗處，等待獵物靠近，然后迅速發動攻擊，用鋒利的牙齒咬住獵物，并注入毒液，使獵物迅速失去反抗能力。在生態系統中，尖吻蝮蛇扮演著重要的角色。作為捕食者，它能夠控制鼠類等小型哺乳動物的種群數量，維持生態平衡。同時，它也是其他動物的食物來源，其存在對于整個生態系統的能量流動和物質循環具有重要意義。然而，由于人類活動的影響，如棲息地破壞、過度捕獵等，尖吻蝮蛇的種群數量不斷減少，生存面臨嚴峻挑戰。2011年，尖吻蝮被IUCN列為易危（VU）物種，2023年被列入中國《有重要生態、科學、社會價值的陸生野生動物名錄》。因此，加強對尖吻蝮蛇的保護和研究，對于維護生態平衡和生物多樣性具有重要的現實意義。2.1.2蛇毒的組成成分分析尖吻蝮蛇毒是一種復雜的混合物，包含多種生物活性成分，主要由蛋白質、多肽、酶類以及其他小分子物質組成。這些成分的種類和含量因蛇的個體差異、地理分布、季節變化等因素而有所不同。蛋白質和多肽是尖吻蝮蛇毒的主要成分，占蛇毒干重的90%以上。通過先進的蛋白質組學技術，如液相色譜-質譜聯用（LC-MS）、凝膠電泳等分析手段，研究人員已鑒定出尖吻蝮蛇毒中含有多種蛋白質和多肽。其中，一些具有代表性的蛋白質和多肽包括：蛇毒金屬蛋白酶：是尖吻蝮蛇毒中含量較為豐富的一類蛋白質，具有降解細胞外基質、破壞血管基底膜等作用。例如，蛇毒金屬蛋白酶A和蛇毒金屬蛋白酶H1，它們在蛇毒的毒性發揮中起著關鍵作用，能夠導致組織損傷、出血等癥狀。磷脂酶A2：這是一類能夠水解磷脂的酶，在尖吻蝮蛇毒中也占有一定比例。磷脂酶A2具有多種生物學活性，如溶血、神經毒性、抗炎等。它可以通過水解細胞膜上的磷脂，破壞細胞膜的結構和功能，導致細胞損傷和死亡。凝血酶樣酶：尖吻蝮蛇毒中的凝血酶樣酶能夠作用于血液中的凝血因子，影響凝血過程。蘄蛇類凝血酶-2就是其中的一種，它可以促進血液凝固，在臨床上可用于治療某些出血性疾病。其他多肽：除了上述蛋白質和酶類，尖吻蝮蛇毒中還含有許多其他具有獨特功能的多肽。這些多肽可能具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎等多種生物活性。一些多肽能夠抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，誘導腫瘤細胞凋亡；還有一些多肽可能參與調節機體的免疫反應，發揮抗炎作用。酶類也是尖吻蝮蛇毒的重要組成部分，除了前面提到的磷脂酶A2和凝血酶樣酶外，還包括蛋白酶、透明質酸酶、磷酸二酯酶等。這些酶在蛇毒的毒性機制和生理功能中發揮著各自獨特的作用。蛋白酶可以水解蛋白質，破壞組織細胞的結構和功能；透明質酸酶能夠降解細胞間質中的透明質酸，增加血管通透性，促進蛇毒的擴散；磷酸二酯酶則參與調節細胞內的信號傳導通路。此外，尖吻蝮蛇毒中還含有一些其他小分子物質，如生物胺、核苷酸、糖類等。這些小分子物質雖然含量相對較少，但可能在蛇毒的生物學活性中起到輔助或調節作用。生物胺可以影響神經系統的功能，導致疼痛、瘙癢等癥狀；核苷酸和糖類可能參與細胞的代謝過程，對蛇毒的毒性發揮和機體的生理反應產生影響。尖吻蝮蛇毒的組成成分復雜多樣，這些成分相互作用，共同決定了蛇毒的性質和生物學活性。深入研究蛇毒的組成成分，對于揭示其毒性機制、開發藥用價值以及治療蛇傷具有重要的理論和實踐意義。2.1.3蛇毒的抗炎相關研究進展近年來，尖吻蝮蛇毒的抗炎作用逐漸受到研究人員的關注，相關研究取得了一定的進展。已有研究表明，尖吻蝮蛇毒中的某些成分具有顯著的抗炎活性，能夠通過多種途徑調節炎癥反應，減輕炎癥相關的病理損傷。在細胞實驗中，研究人員發現尖吻蝮蛇毒的提取物或某些純化的成分能夠抑制炎癥細胞的活化和炎癥介質的釋放。巨噬細胞作為炎癥反應的關鍵細胞，在受到脂多糖（LPS）等刺激時，會分泌大量的炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等，引發炎癥反應。而尖吻蝮蛇毒中的一些成分能夠抑制LPS誘導的巨噬細胞活化，減少這些炎癥介質的分泌，從而發揮抗炎作用。有研究報道，尖吻蝮蛇毒中的一種多肽能夠顯著降低LPS刺激的巨噬細胞中TNF-α和IL-6的表達水平，其作用機制可能與抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活有關。NF-κB是一種重要的轉錄因子，在炎癥反應中起著關鍵的調控作用，它的激活能夠促進炎癥介質的基因轉錄和表達。該多肽可能通過抑制NF-κB的活化，阻斷炎癥信號的傳導，從而減少炎癥介質的產生。在動物實驗中，尖吻蝮蛇毒的抗炎效果也得到了驗證。研究人員通過建立多種炎癥動物模型，如小鼠耳廓腫脹模型、大鼠足跖腫脹模型、結腸炎模型等，評估尖吻蝮蛇毒的抗炎作用。在小鼠耳廓腫脹模型中，給予尖吻蝮蛇毒提取物能夠顯著減輕二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹程度，表明其具有抑制急性炎癥的作用。在大鼠足跖腫脹模型中，尖吻蝮蛇毒也能夠有效抑制角叉菜膠誘導的大鼠足跖腫脹，降低炎癥部位的腫脹度和炎癥細胞浸潤。在結腸炎模型中，尖吻蝮蛇毒能夠改善小鼠的結腸炎癥癥狀，減輕結腸組織的病理損傷，降低炎癥相關指標的水平。在作用機制方面，除了上述提到的抑制NF-κB信號通路外，尖吻蝮蛇毒的抗炎作用還可能涉及其他信號通路和分子機制。一些研究表明，尖吻蝮蛇毒中的成分可能通過調節絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來發揮抗炎作用。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，它們在細胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應中起著重要的調節作用。尖吻蝮蛇毒中的某些成分可能通過抑制MAPK信號通路的激活，減少炎癥介質的產生和細胞凋亡，從而減輕炎癥損傷。此外，尖吻蝮蛇毒還可能通過調節免疫細胞的功能、抗氧化應激等途徑來發揮抗炎作用。然而，目前對于尖吻蝮蛇毒抗炎的研究仍存在一些不足之處。雖然已經證實了尖吻蝮蛇毒具有抗炎活性，但其具體的抗炎活性成分尚未完全明確。蛇毒是一種復雜的混合物，其中可能存在多種具有抗炎作用的成分，這些成分之間的相互作用以及協同效應也有待進一步研究。此外，尖吻蝮蛇毒抗炎的作用機制還需要深入探討，現有的研究只是初步揭示了一些可能的信號通路和分子機制，仍有許多未知的環節需要進一步探索。而且，大部分研究還停留在細胞和動物實驗階段，離臨床應用還有一定的距離，需要進行更多的臨床試驗來驗證其安全性和有效性。盡管如此，尖吻蝮蛇毒在抗炎領域展現出了巨大的潛力。深入研究尖吻蝮蛇毒的抗炎成分和作用機制，不僅有助于揭示其抗炎的分子奧秘，還可能為開發新型的抗炎藥物提供豐富的資源和重要的理論依據。未來的研究可以進一步利用現代生物技術，如蛋白質組學、代謝組學、噬菌體展示技術等，深入挖掘尖吻蝮蛇毒中的抗炎活性成分，明確其作用機制，為炎癥相關疾病的治療提供新的策略和方法。2.2炎癥的發生機制與相關靶點2.2.1炎癥的生理病理過程炎癥是機體對各種刺激，如病原體感染、組織損傷、異物侵入等所產生的一種復雜的防御反應。其過程涉及多種細胞和分子的參與，是一個動態的、有序的生理病理過程，可大致分為炎癥啟動、炎癥發展和炎癥消退三個階段。當機體受到損傷或病原體入侵時，炎癥啟動階段隨即開始。受損組織或免疫細胞會釋放一系列炎癥介質，如組胺、前列腺素、白三烯、細胞因子等。這些炎癥介質能夠作用于血管內皮細胞，使血管擴張，血流加快，導致局部組織充血，從而出現發紅、發熱的癥狀。同時，炎癥介質還會增加血管的通透性，使得血漿蛋白和液體滲出到組織間隙，引起局部腫脹。此外，炎癥介質還能激活疼痛感受器，產生疼痛感覺。在這一階段，免疫細胞，如中性粒細胞、單核細胞等，會被趨化因子吸引，開始向炎癥部位遷移。隨著炎癥的發展，免疫細胞在炎癥部位大量聚集，進一步加劇炎癥反應。中性粒細胞是最早到達炎癥部位的免疫細胞，它們具有強大的吞噬能力，能夠吞噬和殺滅病原體、清除組織碎片和死亡細胞。單核細胞在炎癥部位分化為巨噬細胞，巨噬細胞不僅能吞噬病原體，還能分泌更多的細胞因子和炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些細胞因子和炎癥介質會進一步激活其他免疫細胞，吸引更多的免疫細胞向炎癥部位趨化，形成一個正反饋調節機制，導致炎癥反應不斷放大。在炎癥發展階段，炎癥部位會出現明顯的紅腫、疼痛、功能障礙等癥狀，嚴重時可能會影響整個機體的生理功能。在炎癥反應的后期，當病原體被清除，組織損傷得到修復后，炎癥進入消退階段。在這一階段，機體啟動一系列抗炎機制，使炎癥反應逐漸減弱并最終消退。抗炎細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）等的分泌增加，它們能夠抑制炎癥細胞的活化和炎癥介質的產生，促進炎癥的消退。同時，炎癥部位的巨噬細胞會轉變為抗炎表型，吞噬和清除殘留的病原體、細胞碎片和炎癥介質。此外，機體還會啟動組織修復機制，促進受損組織的再生和修復，使炎癥部位逐漸恢復正常結構和功能。然而，當炎癥反應失衡時，就會導致各種炎癥相關疾病的發生。如果炎癥反應過度強烈或持續時間過長，炎癥介質的大量釋放會對機體自身組織造成損傷，引發組織器官的功能障礙。在類風濕性關節炎中，炎癥細胞持續活化，分泌大量的TNF-α、IL-1β等炎癥介質，導致關節滑膜炎癥、增生，軟骨和骨組織破壞，最終引起關節畸形和功能喪失。在潰瘍性結腸炎中，腸道黏膜的炎癥反應失控，導致腸道黏膜潰瘍、出血，影響腸道的正常消化和吸收功能。相反，如果炎癥反應過弱，機體無法有效地清除病原體和修復組織損傷，也會導致感染擴散、傷口愈合緩慢等問題。因此，維持炎癥反應的平衡對于機體的健康至關重要。2.2.2與炎癥相關的關鍵靶點在炎癥發生發展過程中，涉及多個關鍵靶點，它們在炎癥信號通路中發揮著重要作用，成為抗炎藥物研發的重要靶點。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及其受體（TNFR1、TNFR2）：TNF-α是一種具有多種生物學功能的細胞因子，在炎癥反應中起著核心作用。它主要由巨噬細胞、單核細胞、T細胞等免疫細胞分泌。TNF-α可以通過與細胞表面的兩種受體，即腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）和腫瘤壞死因子受體2（TNFR2）結合，激活下游信號通路。TNFR1在大部分細胞上結構性表達，而TNFR2則是可誘導表達的，且只在某些特定細胞表面表達。當TNF-α與TNFR1結合后，會招募TNFR相關死亡結構域蛋白（TRADD）等接頭蛋白，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，導致炎癥介質如IL-1、IL-6、IL-8等的產生和釋放，引發炎癥反應。在類風濕性關節炎患者體內，TNF-α的表達水平顯著升高，通過與TNFR1結合，持續激活炎癥信號通路，導致關節炎癥和損傷。TNFR1還可以通過招募Fas相關死亡結構域蛋白（FADD），激活半胱天冬酶（caspase）級聯反應，誘導細胞凋亡。而TNFR2主要參與細胞的增殖、存活和免疫調節等過程，其信號通路與TNFR1有所不同，但在某些情況下也能參與炎癥反應的調節。緩激肽2型受體（B2R）：B2R是一種G蛋白偶聯受體，在炎癥反應中發揮著重要的調節作用。緩激肽是一種內源性的血管活性肽，它與B2R結合后，能夠激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解為三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3可以促使細胞內鈣離子釋放，激活蛋白激酶C（PKC），進而激活MAPK信號通路和NF-κB信號通路，導致炎癥介質的釋放和炎癥細胞的活化。在炎癥部位，緩激肽的生成增加，與B2R結合后，會引起血管擴張、通透性增加、疼痛等炎癥癥狀。B2R還可以與其他受體或信號分子相互作用，調節炎癥反應的強度和持續時間。在糖尿病視網膜病變小鼠模型中，抑制B2R的活性可以減輕視網膜的炎癥反應，減少炎癥細胞浸潤和炎癥介質的產生，表明B2R在糖尿病視網膜病變的炎癥過程中起著重要作用。補體成分5a受體1（C5aR1）：C5a是補體系統激活過程中產生的一種具有強烈炎癥活性的多肽，C5aR1是其特異性受體。當C5a與C5aR1結合后，會激活一系列信號通路，包括G蛋白依賴的信號通路和β-arrestin依賴的信號通路。在G蛋白依賴的信號通路中，C5aR1激活后會導致PLC的活化，產生IP3和DAG，進而引起細胞內鈣離子濃度升高，激活PKC和MAPK信號通路，促進炎癥介質的釋放和炎癥細胞的趨化。C5aR1還可以通過激活β-arrestin依賴的信號通路，調節細胞的遷移、增殖和存活。在炎癥反應中，C5aR1的激活會導致中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的聚集和活化，釋放大量的炎癥介質，如活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）等，加重炎癥損傷。在濕性老年性黃斑變性的研究中發現，抑制C5aR1的活性可以減少炎癥細胞的浸潤和新生血管的形成，表明C5aR1在濕性老年性黃斑變性的發病機制中與炎癥和新生血管形成密切相關。三、噬菌體展示平臺技術解析3.1噬菌體展示技術的原理與發展3.1.1技術的基本原理噬菌體展示技術是一種將外源蛋白或多肽的DNA序列巧妙插入到噬菌體外殼蛋白結構基因適當位置的生物技術。其核心原理在于，使外源基因能夠隨外殼蛋白的表達而同步表達，與此同時，外源蛋白會隨著噬菌體的重新組裝，精準地展示到噬菌體表面。在噬菌體展示系統中，當多肽或蛋白質的編碼基因或目的基因片段被成功克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的合適位置時，且閱讀框準確無誤，同時不會對其他外殼蛋白的正常功能產生影響，外源多肽或蛋白就會與外殼蛋白以融合蛋白的形式表達出來。這種融合蛋白在子代噬菌體重新組裝的過程中，被展示于噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白能夠保持相對獨立的空間結構和生物活性，這一特性對于靶分子的識別和結合至關重要。以單鏈絲狀噬菌體展示系統中的PⅢ展示系統為例，絲狀噬菌體屬于單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，處于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所不可或缺的部分。每個病毒顆粒通常含有3-5個拷貝的PⅢ蛋白，其結構可細分為N1、N2和CT3個功能區域，這3個區域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2相連。其中，N1和N2主要負責噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛以及穿透細胞膜，而CT則構成噬菌體外殼蛋白結構的一部分，將整個PⅢ蛋白的C端結構域錨定于噬菌體的一端。PⅢ存在2個位點可供外源序列插入，當外源的多肽或蛋白質融合于PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和N1之間時，噬菌體仍具備感染性；然而，若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結構域相連，噬菌體則會喪失感染性，此時重組噬菌體的感染性需由輔助噬菌體表達的完整PⅢ蛋白來維持。再看PⅧ展示系統，PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側，C端與DNA緊密結合，N端伸出噬菌體外，每個病毒顆粒大約含有2700個PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近理論上可融合五肽，但無法融合更長的肽鏈，原因在于較大的多肽或蛋白會造成空間阻礙，嚴重影響噬菌體裝配，致使其失去感染力。不過，當有輔助噬菌體參與時，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價數，此時便能夠融合多肽甚至抗體片段。當構建好噬菌體展示文庫后，其中包含了大量攜帶不同外源多肽或蛋白的噬菌體。利用靶蛋白進行篩選時，將文庫與固相化的靶蛋白分子進行孵育，經過一段時間后，未結合的游離噬菌體可通過洗滌去除，而與靶分子特異性結合的噬菌體則會被保留下來。隨后，使用競爭受體或酸性條件將結合的噬菌體洗脫下來，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后，通過繁殖擴增，再進行下一輪洗脫。通常經過3-5輪的“吸附-洗脫-擴增”循環后，與靶分子特異結合的噬菌體能夠得到高度富集。最后，對富集后的噬菌體制劑進行深入分析，如通過ELISA檢測其結合活性、測定其特異性、測序確定其展示的多肽序列、評估其親和力以及檢測其相關活性等，從而篩選出具有期望特性的目標噬菌體。3.1.2技術的發展歷程與重要突破噬菌體展示技術的發展歷程充滿了創新與突破，為生命科學研究帶來了革命性的變化。1985年，Smith首次通過基因工程手段，將EcoRⅠ的部分基因片段與噬菌體的fd-tet基因Ⅲ連接，驚奇地發現前者編碼的多肽能以融合蛋白的形式出現在噬菌體表面，并且可與特定的抗體相結合，這一開創性的實驗標志著噬菌體展示技術的誕生。1988年，Parmley和Smith成功將B-Gal表達于噬菌體的表面，并且證實該蛋白具有生物活性，能夠被相應的抗體識別。基于此，他們提出了通過構建隨機肽庫來深入了解抗體識別的抗原決定簇表位的設想，為后續的研究開辟了新的方向。1990年，Scott將隨機短肽與絲狀噬菌體的表面蛋白PⅢ融合，并展示在噬菌體表面，首次成功建立了噬菌體隨機肽庫。同年，McCafferty運用噬菌體展示技術篩選溶酶菌的單鏈抗體取得成功，這一成果具有里程碑意義，使得噬菌體展示技術進入了一個廣泛應用的嶄新時代。此后，眾多有功能的蛋白，包括分泌性蛋白（如抗體、生長激素）、細胞內蛋白和酶類等，都得以表達于噬菌體的表面，為這些蛋白的基因工程改造奠定了堅實的基礎。在噬菌體展示技術的發展進程中，展示系統也在不斷地豐富和完善。目前，已開發出多種類型的噬菌體展示系統，如單鏈絲狀噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統等。單鏈絲狀噬菌體展示系統中，除了前面提到的PⅢ和PⅧ展示系統外，還有PⅥ展示系統，其PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌體表面，可作為外源蛋白的融合位點，主要用于cDNA表面展示文庫的構建，并取得了不錯的篩選效果。λ噬菌體展示系統包括PV展示系統和D蛋白展示系統。PV展示系統中，λ噬菌體的PV蛋白構成了它的尾部管狀部分，該管狀結構由32個盤狀結構組成，每個盤又由6個PV亞基組成。PV有兩個折疊區域，C端的折疊結構域（非功能區）可供外源序列插入或替換。利用PV系統，已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。D蛋白展示系統中，D蛋白的分子質量為11ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。當突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝既可以在體內進行，也可以在體外進行。體外組裝是將D融合蛋白結合到λD-噬菌體表面，而體內組裝則是將含D融合基因的質粒轉化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，通過熱誘導進行組裝。該系統的獨特之處在于，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對于展示那些可能對噬菌體裝配造成損害的蛋白質時特別有用。T4噬菌體展示系統是20世紀90年代中期建立起來的一種新型展示系統。其顯著特點是能夠將兩種性質完全不同的外源多肽或蛋白質，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合，直接展示于T4噬菌體的表面。這種展示方式使得表達的蛋白無需復雜的蛋白純化過程，有效避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失。T4噬菌體在宿主細胞內裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質，很少受到限制。吳健敏等成功地將大小約215aaSOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面，進一步驗證了該系統的優勢。此外，SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖，這為其在疫苗開發等領域的應用提供了廣闊的前景。隨著技術的不斷發展，噬菌體展示技術在多個領域取得了重要突破。在藥物研發領域，通過構建噬菌體展示文庫，能夠快速篩選出與藥物靶點具有高親和力的多肽或抗體，為新藥的研發提供了豐富的先導化合物。在蛋白質相互作用研究方面，該技術能夠幫助研究人員深入了解蛋白質之間的相互作用機制，揭示生命過程中的關鍵分子事件。在疾病診斷領域，利用噬菌體展示技術篩選出的特異性抗體或多肽，可用于開發高靈敏度、高特異性的診斷試劑，實現疾病的早期診斷和精準檢測。在疫苗開發領域，噬菌體展示技術可用于篩選和設計新型疫苗抗原，提高疫苗的免疫原性和保護效果。近年來，噬菌體展示技術與其他先進技術的融合也成為了研究的熱點。與高通量測序技術（NGS）結合，能夠對篩選得到的噬菌體進行深度測序，快速準確地鑒定出與目標分子結合的多肽序列，大大提高了篩選效率和準確性。與人工智能（AI）、機器學習（ML）等技術的融合，利用AI和ML算法對噬菌體展示文庫的篩選數據進行分析和預測，有望更高效地篩選出具有特定功能的多肽，加速藥物研發進程。3.2常用的噬菌體展示系統3.2.1絲狀噬菌體展示系統絲狀噬菌體展示系統是目前應用最為廣泛的噬菌體展示系統之一，其主要代表為M13噬菌體展示系統。在絲狀噬菌體展示系統中，PⅢ展示系統和PⅧ展示系統具有重要地位。PⅢ展示系統中，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，處于病毒顆粒的尾端，對于噬菌體感染大腸埃希菌起著不可或缺的作用。每個病毒顆粒通常包含3-5個拷貝的PⅢ蛋白，其結構可細分為N1、N2和CT3個功能區域，這些區域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2相連。其中，N1和N2負責噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛以及穿透細胞膜，而CT則構成噬菌體外殼蛋白結構的一部分，將整個PⅢ蛋白的C端結構域錨定于噬菌體的一端。PⅢ存在2個位點可供外源序列插入，當外源的多肽或蛋白質融合于PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和N1之間時，噬菌體仍具備感染性；然而，若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結構域相連，噬菌體則會喪失感染性，此時重組噬菌體的感染性需由輔助噬菌體表達的完整PⅢ蛋白來維持。PⅢ蛋白容易被蛋白水解酶水解，當有輔助噬菌體超感染時，可使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白，即形成所謂的“單價”噬菌體。這種“單價”展示方式在一些需要精確控制展示蛋白數量和活性的研究中具有獨特優勢，比如在研究蛋白質-蛋白質相互作用時，單價展示可以避免多價展示可能帶來的空間位阻和非特異性結合問題，更準確地模擬天然狀態下蛋白質之間的相互作用。PⅧ展示系統中，PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側，C端與DNA緊密結合，N端伸出噬菌體外，每個病毒顆粒大約含有2700個PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近理論上可融合五肽，但無法融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間阻礙，嚴重影響噬菌體裝配，致使其失去感染力。不過，當有輔助噬菌體參與時，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價數，此時便能夠融合多肽甚至抗體片段。PⅧ展示系統由于其高拷貝數的特點，在一些需要高親和力配體篩選的研究中表現出色。在篩選與特定受體具有高親和力的多肽時，PⅧ展示系統可以展示大量的多肽拷貝，增加了與受體結合的機會，從而更有可能篩選到高親和力的配體。絲狀噬菌體展示系統在多個領域有著廣泛的應用。在抗體工程領域，通過PⅢ展示系統可以將抗體片段展示在噬菌體表面，構建噬菌體抗體庫，用于篩選和制備具有高親和力和特異性的抗體。已有研究利用該系統成功篩選出針對腫瘤標志物的特異性抗體，為腫瘤的診斷和治療提供了新的工具。在藥物研發方面，利用PⅧ展示系統篩選與藥物靶點結合的多肽，為新藥的開發提供先導化合物。有研究從PⅧ展示的隨機肽庫中篩選出與G蛋白偶聯受體結合的多肽，這些多肽有望成為治療相關疾病的潛在藥物。3.2.2λ噬菌體展示系統λ噬菌體展示系統也是一種重要的噬菌體展示系統，它在展示大分子蛋白和對宿主細胞有毒性的蛋白方面具有獨特的優勢。該系統主要包括PV展示系統和D蛋白展示系統。PV展示系統中，λ噬菌體的PV蛋白構成了它的尾部管狀部分，該管狀結構由32個盤狀結構組成，每個盤又由6個PV亞基組成。PV有兩個折疊區域，C端的折疊結構域（非功能區）可供外源序列插入或替換。利用PV系統，已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。這表明PV展示系統能夠有效地展示大分子蛋白，為研究大分子蛋白的結構和功能提供了有力的工具。由于λ噬菌體的裝配在細胞內進行，所以該系統可以展示難以分泌的肽或蛋白質。然而，該系統展示的外源蛋白質的拷貝數為平均1個分子/噬菌體，這可能是因為外源蛋白質或多肽干擾了λ噬菌體的尾部裝配。D蛋白展示系統中，D蛋白的分子質量為11ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝既可以在體內進行，也可以在體外進行。體外組裝是將D融合蛋白結合到λD-噬菌體表面，而體內組裝則是將含D融合基因的質粒轉化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，通過熱誘導進行組裝。該系統的一個顯著特點是，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對于展示那些可能對噬菌體裝配造成損害的蛋白質時特別有用。在展示一些具有特殊結構或功能的蛋白質時，通過調節融合蛋白和D蛋白的比例，可以避免蛋白質對噬菌體裝配的負面影響，確保展示的順利進行。λ噬菌體展示系統在蛋白質結構與功能研究、疫苗開發等領域有著重要的應用。在蛋白質結構與功能研究中，利用PV展示系統展示大分子蛋白，有助于深入了解大分子蛋白的結構和功能關系。通過分析展示的大分子蛋白與其他分子的相互作用，可以揭示其在生物過程中的作用機制。在疫苗開發方面，D蛋白展示系統可以展示病原體的抗原蛋白，制備新型疫苗。將病原體的關鍵抗原蛋白通過D蛋白展示系統展示在λ噬菌體表面，能夠誘導機體產生特異性免疫反應，為開發高效、安全的疫苗提供了新的策略。3.2.3T4噬菌體展示系統T4噬菌體展示系統是20世紀90年代中期建立起來的一種新型展示系統，它具有許多獨特之處，在特殊蛋白展示方面發揮著重要作用。T4噬菌體展示系統的顯著特點是能夠將兩種性質完全不同的外源多肽或蛋白質，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合，直接展示于T4噬菌體的表面。這種展示方式使得表達的蛋白無需復雜的蛋白純化過程，有效避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失。而且，T4噬菌體在宿主細胞內裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質，很少受到限制。吳健敏等成功地將大小約215aaSOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面，進一步驗證了該系統的強大展示能力。此外，SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖，這為其在疫苗開發等領域的應用提供了廣闊的前景。在特殊蛋白展示方面，T4噬菌體展示系統具有獨特的優勢。對于那些難以通過其他展示系統展示的復雜蛋白質，如膜蛋白、具有多個結構域的蛋白質等，T4噬菌體展示系統能夠有效地進行展示。膜蛋白由于其特殊的結構和性質，在傳統的展示系統中往往難以正確折疊和展示，而T4噬菌體展示系統無需分泌途徑，能夠在細胞內直接裝配，從而避免了膜蛋白在分泌過程中可能遇到的問題，成功展示膜蛋白。在疫苗開發領域，T4噬菌體展示系統可以將病原體的多種抗原蛋白分別展示在SOC和HOC上，構建多價疫苗。這種多價疫苗能夠同時激發機體對多種抗原的免疫反應，提高疫苗的免疫效果。在制備流感疫苗時，將流感病毒的多個關鍵抗原蛋白分別展示在T4噬菌體的SOC和HOC上，可增強疫苗對不同亞型流感病毒的免疫保護作用。3.3噬菌體展示肽庫的構建與優化3.3.1肽庫構建的基本流程構建噬菌體展示肽庫是利用噬菌體展示技術篩選尖吻蝮蛇毒抗炎多肽的關鍵起始步驟，其基本流程涵蓋多個嚴謹且精細的環節。基因合成是構建肽庫的首要環節，需根據研究目的與需求，精心設計編碼多肽的基因序列。這一過程中，要充分考慮多肽的長度、氨基酸組成以及序列多樣性。對于尖吻蝮蛇毒抗炎多肽的篩選，可參考已有的蛇毒多肽序列信息，結合炎癥相關靶點的結構與功能特點，運用生物信息學工具進行合理設計。為了增加序列的多樣性，可引入隨機化的氨基酸位點，通過隨機化部分密碼子來實現。在設計編碼七肽的基因序列時，可對其中的幾個密碼子進行隨機化處理，使合成的基因序列能夠編碼多種不同氨基酸組成的七肽。隨后，通過化學合成的方法獲得這些基因序列。隨著合成技術的不斷發展，目前已能夠高精度、高效率地合成所需的基因片段。載體構建是將合成的基因序列巧妙地插入噬菌體載體中。常見的噬菌體載體包括M13、T7等，需根據實驗需求和噬菌體的特性進行恰當選擇。以M13噬菌體載體為例，其具有獨特的生命周期和蛋白質表達系統。M13噬菌體是單鏈DNA病毒，其基因Ⅲ編碼的次要外殼蛋白PⅢ位于病毒顆粒尾端，在噬菌體感染大腸桿菌過程中發揮關鍵作用。每個病毒顆粒通常含有3-5個拷貝的PⅢ蛋白，PⅢ蛋白在結構上可分為N1、N2和CT3個功能區域，由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2相連。N1和N2負責噬菌體吸附大腸桿菌菌毛及穿透細胞膜，CT則構成噬菌體外殼蛋白結構的一部分。當將外源多肽的基因序列插入PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和N1之間時，噬菌體仍保留感染性；若直接與PⅢ蛋白的CT結構域相連，則噬菌體喪失感染性，此時需輔助噬菌體表達完整的PⅢ蛋白來維持重組噬菌體的感染性。在構建載體時，需要使用限制性內切酶對噬菌體載體和基因序列進行切割，使其產生互補的粘性末端或平末端，然后利用DNA連接酶將兩者連接起來。這一過程中，要確保連接的準確性和高效性，避免出現連接錯誤或連接效率低下的情況。轉化細菌是讓攜帶外源基因的噬菌體載體進入宿主細菌，實現基因的表達與噬菌體的組裝。通常選用大腸桿菌作為宿主細菌，因其具有生長迅速、易于培養和轉化等優點。在轉化過程中，可采用化學轉化法或電轉化法。化學轉化法是利用化學試劑處理大腸桿菌，使其細胞膜通透性增加，從而便于噬菌體載體進入細胞。常用的化學試劑有氯化鈣、氯化鎂等。電轉化法則是通過高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上形成瞬間小孔，使噬菌體載體得以進入細胞。轉化后的大腸桿菌在含有相應抗生素的培養基中進行培養，只有成功轉化了攜帶抗生素抗性基因噬菌體載體的細菌才能生長繁殖。在培養過程中，要嚴格控制培養條件，如溫度、pH值、營養成分等，以確保細菌的正常生長和噬菌體的高效表達。隨著細菌的生長，噬菌體載體在細菌內進行復制和表達，外源多肽與噬菌體外殼蛋白融合，進而組裝成完整的噬菌體展示肽庫。3.3.2提高肽庫質量與多樣性的策略提高噬菌體展示肽庫的質量與多樣性對于篩選出高親和力的尖吻蝮蛇毒抗炎多肽至關重要，可從多個方面采取有效策略。增加肽庫容量是提高肽庫質量的關鍵策略之一。肽庫容量越大，包含的多肽序列種類就越多，篩選到具有特定功能多肽的概率也就越高。為了增加肽庫容量，在基因合成階段，可擴大隨機化氨基酸的范圍和數量。在設計編碼多肽的基因序列時，增加隨機化密碼子的數量，使更多的氨基酸位點可以隨機變化。在構建載體時，要確保轉化效率的最大化。優化轉化條件，如調整化學轉化法中化學試劑的濃度和處理時間，或者優化電轉化法中的電脈沖參數等，以提高噬菌體載體進入宿主細菌的效率。同時，在細菌培養過程中，要保證細菌的高密度生長，為噬菌體的大量繁殖提供充足的宿主。通過優化培養基的配方、控制培養溫度和通氣量等條件，使細菌在短時間內達到較高的密度，從而增加噬菌體的產量，進一步擴大肽庫容量。優化序列設計也是提高肽庫質量與多樣性的重要策略。在設計多肽序列時，應充分考慮目標靶點的結構和功能特點。對于以TNF-α為靶點篩選尖吻蝮蛇毒抗炎多肽，需深入了解TNF-α的三維結構、活性位點以及與其他分子的相互作用方式。通過生物信息學分析，預測可能與TNF-α結合的多肽序列特征，如氨基酸的組成、電荷分布、親疏水性等。在設計的多肽序列中引入具有特定功能的氨基酸殘基或結構基序，如富含脯氨酸的結構域可能有助于增強多肽與靶點的結合親和力。同時，避免設計過于相似或冗余的序列，以增加肽庫的多樣性。可以利用計算機輔助設計軟件，對設計的多肽序列進行分析和篩選，去除相似度較高的序列，保留具有獨特結構和功能的序列。此外，還可以引入一些特殊的氨基酸，如非天然氨基酸，進一步拓展多肽序列的多樣性和功能。非天然氨基酸具有獨特的化學性質和結構，能夠賦予多肽新的功能，如增強多肽的穩定性、改變其與靶點的結合特異性等。通過化學合成的方法將非天然氨基酸引入到多肽序列中，可構建具有更高質量和多樣性的噬菌體展示肽庫。3.3.3肽庫質量的評估指標與方法準確評估噬菌體展示肽庫的質量是確保篩選出有效尖吻蝮蛇毒抗炎多肽的重要前提，可通過多種指標和方法進行全面評估。測序分析是評估肽庫質量的重要方法之一，能夠直接獲取肽庫中多肽序列的信息。通過高通量測序技術，對肽庫中的噬菌體進行大規模測序，可以快速準確地確定展示的多肽序列。分析測序結果，可評估肽庫的多樣性。計算肽庫中不同多肽序列的數量和種類，以及它們的分布情況。若肽庫中存在大量重復的序列，說明肽庫的多樣性較低，可能影響篩選效果。還可以通過測序分析評估肽庫中是否存在突變或錯誤序列。在基因合成和載體構建過程中，可能會出現堿基錯配、缺失或插入等情況，導致多肽序列發生突變。通過測序分析，能夠及時發現這些問題，對肽庫進行優化和改進。對測序結果進行生物信息學分析，如構建系統發育樹、分析氨基酸序列的保守性等，有助于深入了解肽庫中多肽序列的進化關系和功能特征，為后續的篩選工作提供參考。結合實驗是評估肽庫與靶分子結合能力的重要手段。將肽庫與固相化的靶分子，如TNF-α蛋白進行孵育，使噬菌體展示的多肽與靶分子充分接觸。經過一段時間的孵育后，洗去未結合的游離噬菌體，然后通過競爭受體或酸性條件將與靶分子結合的噬菌體洗脫下來。對洗脫的噬菌體進行擴增和分析，可評估肽庫中與靶分子具有結合能力的噬菌體比例。通過ELISA等方法，定量檢測洗脫噬菌體與靶分子的結合活性。將洗脫的噬菌體與包被有靶分子的酶標板進行孵育，加入相應的酶標抗體和底物，通過檢測吸光度值來定量分析噬菌體與靶分子的結合強度。結合實驗還可以用于評估肽庫的特異性。將肽庫與非靶分子進行孵育，檢測是否有噬菌體與之結合。若肽庫與非靶分子也有較高的結合率，說明肽庫的特異性較差，可能存在非特異性結合的噬菌體，需要進一步優化篩選條件或對肽庫進行處理。四、基于噬菌體展示平臺篩選尖吻蝮蛇毒抗炎多肽的實驗設計與實施4.1實驗材料與準備4.1.1尖吻蝮蛇毒樣本的采集與處理尖吻蝮蛇毒樣本的采集需嚴格遵循科學規范的操作流程。在采集季節方面，通常選擇5-10月份，此階段毒蛇較為活躍，且氣溫適宜，蛇毒分泌量較多。我國北方或亞溫帶地區可在6-9月份進行采毒。采毒時，常用的方法為咬膜皿法，該方法具有操作簡單、成功率高且能減少毒液污染等優點。其取毒工具為特制的玻璃膜皿，玻璃皿口牢固綁蓋著一層透明且具一定彈性的尼龍薄膜，底部一邊連接末端封閉的玻璃管，玻璃管略為彎曲向上與玻璃皿底部約呈120度左右的傾斜度，皿底略向管口傾斜。玻璃管用于盛集毒液，同時可作為取毒時的把手，沿著玻璃皿的環口邊緣有一條稍微向內凹陷的淺溝，以便固定尼龍薄膜。操作時，左手輕輕提起蛇的頸部，讓蛇身自然放置在工作臺面上，盡量減少對蛇身的刺激，防止其扭動。右手握著玻璃膜皿的管部，皿口向上，將皿邊輕放蛇嘴，當蛇張口之際，順勢將玻璃皿送入蛇口內，并盡可能深入達到蛇的口角處。待毒蛇緊咬玻璃皿，毒牙咬穿尼龍薄膜，即可看到毒液流入玻璃皿中。待毒液排完后，稍為扭動一下管子，促使毒蛇把口松開，順勢取出玻璃膜皿，完成取毒。采集后的蛇毒需妥善保存，以維持其生物活性。將采集的新鮮蛇毒立即置于低溫環境下，如-80℃的冰箱中進行冷凍保存。在這種低溫條件下，蛇毒中的蛋白質和多肽等生物活性成分的結構能夠保持相對穩定，減少其降解和失活的可能性。同時，為避免反復凍融對蛇毒活性造成損害，可將蛇毒分成小份進行保存，每次使用時取出一份，避免多次凍融循環。在進行實驗前，需要對蛇毒樣本進行預處理。將冷凍保存的蛇毒從冰箱中取出，置于冰上緩慢解凍。解凍后的蛇毒可通過離心等方法去除其中可能存在的雜質，如細胞碎片、微生物等。以10000r/min的轉速離心10-15分鐘，使雜質沉淀在離心管底部，然后小心吸取上清液，即得到相對純凈的蛇毒樣本。為了進一步確定蛇毒的純度和活性，可采用蛋白質定量分析方法，如Bradford法、Lowry法等，測定蛇毒中蛋白質的含量。還可通過酶活性測定等方法，檢測蛇毒中某些關鍵酶的活性，以評估蛇毒的質量和活性。4.1.2噬菌體展示肽庫的選擇與準備根據本實驗旨在篩選尖吻蝮蛇毒抗炎多肽的目的，選擇絲狀噬菌體展示肽庫中的M13噬菌體展示肽庫較為適宜。M13噬菌體展示肽庫具有成熟的表達系統和較高的穩定性，能夠有效地展示外源多肽。在PⅢ展示系統中，PⅢ蛋白位于病毒顆粒尾端，每個病毒顆粒通常含有3-5個拷貝的PⅢ蛋白，其結構可分為N1、N2和CT3個功能區域，由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2相連。N1和N2負責噬菌體吸附大腸桿菌菌毛及穿透細胞膜，CT則構成噬菌體外殼蛋白結構的一部分。這種結構特點使得外源多肽能夠在噬菌體表面得到有效展示，并且在與靶分子相互作用時，能夠保持相對獨立的空間結構和生物活性。在準備噬菌體展示肽庫時，首先要確保其質量和多樣性。對購買的商業化M13噬菌體展示肽庫，需進行嚴格的質量檢測。通過測序分析，檢測肽庫中展示的多肽序列的多樣性和準確性。隨機選取一定數量的噬菌體克隆進行測序，分析其插入的外源多肽序列，評估肽庫中不同多肽序列的數量和分布情況。若肽庫中存在大量重復的序列，說明其多樣性不足，可能影響篩選效果，需進一步優化或更換肽庫。還要檢測肽庫的滴度，即單位體積內噬菌體的數量。采用雙層平板法或其他合適的方法測定肽庫的滴度，確保其滴度達到實驗要求。一般來說，高質量的噬菌體展示肽庫滴度應在10^10-10^12pfu/mL以上，以保證在篩選過程中有足夠數量的噬菌體與靶分子相互作用。若自行構建噬菌體展示肽庫，需按照嚴格的流程進行。首先進行基因合成，根據實驗需求設計編碼多肽的基因序列。在設計時，充分考慮多肽的長度、氨基酸組成以及序列多樣性。為增加序列的多樣性，可引入隨機化的氨基酸位點，通過隨機化部分密碼子來實現。隨后，通過化學合成的方法獲得這些基因序列。將合成的基因序列插入噬菌體載體中，構建重組噬菌體。選用合適的限制性內切酶對噬菌體載體和基因序列進行切割，使其產生互補的粘性末端或平末端，然后利用DNA連接酶將兩者連接起來。將重組噬菌體轉化到宿主細菌中，如大腸桿菌。可采用化學轉化法或電轉化法，使噬菌體載體進入宿主細菌。轉化后的大腸桿菌在含有相應抗生素的培養基中進行培養，只有成功轉化了攜帶抗生素抗性基因噬菌體載體的細菌才能生長繁殖。隨著細菌的生長，噬菌體載體在細菌內進行復制和表達，外源多肽與噬菌體外殼蛋白融合，進而組裝成完整的噬菌體展示肽庫。對構建好的肽庫同樣要進行質量檢測，包括測序分析和滴度測定等，確保其質量符合實驗要求。4.1.3靶標分子的確定與制備基于炎癥發生機制和相關研究，確定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為本實驗的關鍵靶標分子。TNF-α在炎癥反應中起著核心作用，其表達水平的異常升高與多種炎癥相關疾病密切相關。在類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎等疾病患者體內，TNF-α的含量顯著高于正常水平，通過與細胞表面的受體結合，激活一系列下游信號通路，引發炎癥級聯反應。制備靶標分子TNF-α時，可采用基因工程表達與純化的方法。首先，獲取TNF-α的基因序列。可從基因數據庫中檢索TNF-α的基因序列，然后通過PCR擴增或化學合成的方法獲得該基因。將TNF-α基因克隆到合適的表達載體中，如pET系列載體。選用限制性內切酶對載體和基因進行切割，利用DNA連接酶將兩者連接，構建重組表達載體。將重組表達載體轉化到大腸桿菌表達菌株中，如BL21（DE3）。在含有相應抗生素的培養基中培養轉化后的大腸桿菌，當細菌生長到一定密度后，加入誘導劑IPTG誘導TNF-α的表達。誘導后，收集細菌，通過超聲破碎等方法使細胞裂解，釋放出包含TNF-α的蛋白溶液。對裂解后的蛋白溶液進行純化，可采用親和層析、離子交換層析等方法。利用His-Tag親和層析柱對含有His-Tag標記的TNF-α進行純化。將蛋白溶液上樣到親和層析柱中，TNF-α會與柱上的鎳離子結合，而其他雜質則會流出。通過洗滌去除未結合的雜質，然后用含有咪唑的洗脫緩沖液將TNF-α洗脫下來。對洗脫得到的TNF-α進行純度檢測，可采用SDS-PAGE凝膠電泳等方法。若檢測到的TNF-α純度不夠高，可進一步采用離子交換層析等方法進行純化，直至獲得高純度的TNF-α。為了后續篩選實驗的進行，需要將純化后的TNF-α固定在固相載體上。可選用酶標板、磁珠等作為固相載體。以酶標板為例，將TNF-α用合適的緩沖液稀釋到適當濃度，如1-5μg/mL，然后加入到酶標板的孔中，4℃孵育過夜，使TNF-α吸附在酶標板表面。孵育后，用含有BSA等封閉劑的緩沖液對酶標板進行封閉，以減少非特異性結合。封閉后的酶標板即可用于噬菌體展示肽庫的篩選實驗。4.2篩選實驗的具體步驟與方法4.2.1生物淘選過程生物淘選是從噬菌體展示肽庫中篩選與靶標分子特異性結合的噬菌體的關鍵過程，其步驟嚴謹且相互關聯。包被靶標是生物淘選的起始步驟。將之前制備好的靶標分子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）固定在固相載體上，這里選用酶標板作為固相載體。把濃度為1-5μg/mL的TNF-α用合適的緩沖液稀釋后，加入到酶標板的孔中，每孔加入100-200μL，4℃孵育過夜，使TNF-α充分吸附在酶標板表面。孵育后，用含有0.5%-1%BSA（牛血清白蛋白）的緩沖液對酶標板進行封閉，以減少非特異性結合。封閉時，每孔加入200-300μL封閉液，37℃孵育1-2小時，然后棄去封閉液，用洗滌緩沖液（如PBST，含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液）洗滌酶標板3-5次，每次洗滌3-5分鐘，確保去除未結合的TNF-α和雜質。孵育肽庫是使噬菌體展示肽庫中的噬菌體與固相化的靶標分子充分接觸。將準備好的M13噬菌體展示肽庫用稀釋緩沖液（如PBST）稀釋至合適的濃度，一般為10^10-10^12pfu/mL。取適量稀釋后的肽庫加入到包被有TNF-α的酶標板孔中，每孔加入100-200μL，37℃孵育1-2小時，期間輕輕振蕩，使噬菌體與TNF-α充分結合。在孵育過程中，噬菌體表面展示的多肽與TNF-α分子相互作用，那些具有高親和力和特異性的多肽會與TNF-α結合，形成噬菌體-靶標復合物。洗滌步驟旨在去除未結合的游離噬菌體。孵育結束后，棄去酶標板孔中的液體，用洗滌緩沖液PBST洗滌酶標板10-15次，每次洗滌5-10分鐘。通過多次洗滌，可有效去除未與TNF-α結合的噬菌體，減少背景干擾，提高篩選的特異性。在洗滌過程中，要注意洗滌的力度和方式，避免將已結合的噬菌體洗脫下來。洗脫是將與靶標分子結合的噬菌體從固相載體上分離下來。用酸性緩沖液（如pH2.2-2.5的甘氨酸-HCl緩沖液）進行洗脫，每孔加入100-200μL，室溫孵育5-10分鐘。酸性條件會破壞噬菌體與TNF-α之間的結合力，使結合的噬菌體被洗脫下來。為了中和酸性洗脫液，可立即向洗脫液中加入適量的中和緩沖液（如1MTris-HCl，pH9.0-9.5）。擴增是為了增加洗脫噬菌體的數量，以便進行下一輪篩選。將洗脫得到的噬菌體感染對數生長期的大腸桿菌宿主菌，如TG1。將噬菌體與大腸桿菌按一定比例混合，37℃孵育30-60分鐘，使噬菌體感染大腸桿菌。然后將感染后的大腸桿菌接種到含有相應抗生素（如氨芐青霉素）的LB培養基中，37℃振蕩培養4-6小時，使噬菌體在大腸桿菌內大量繁殖。培養結束后，收集菌液，通過離心等方法分離噬菌體，得到擴增后的噬菌體懸液。4.2.2篩選條件的優化篩選條件的優化對于提高從噬菌體展示肽庫中篩選尖吻蝮蛇毒抗炎多肽的效率和特異性至關重要，需對多個關鍵因素進行深入探討和調整。鹽濃度是影響噬菌體與靶標分子結合的重要因素之一。在孵育和洗滌過程中，鹽濃度的變化會改變溶液的離子強度，從而影響噬菌體表面多肽與靶標分子之間的靜電相互作用。過高或過低的鹽濃度都可能導致非特異性結合增加或特異性結合減弱。為了確定最佳鹽濃度，進行一系列的對比實驗。設置不同的鹽濃度梯度，如0.05M、0.1M、0.15M、0.2M的氯化鈉（NaCl）溶液，在其他條件相同的情況下，分別用不同鹽濃度的緩沖液進行噬菌體展示肽庫與靶標分子TNF-α的孵育和洗滌。通過檢測洗脫噬菌體的滴度和結合活性，評估不同鹽濃度對篩選效果的影響。研究發現，在0.15MNaCl的條件下，洗脫噬菌體的滴度和結合活性相對較高，說明此時噬菌體與靶標分子的特異性結合較好，非特異性結合較少。因此，在后續的篩選實驗中，選擇0.15MNaCl作為孵育和洗滌緩沖液的鹽濃度。溫度對噬菌體與靶標分子的結合也有顯著影響。溫度的變化會影響分子的熱運動和蛋白質的構象，進而影響噬菌體表面多肽與靶標分子之間的結合親和力和特異性。為了探究最佳溫度，設置不同的溫度條件進行實驗，如25℃、30℃、37℃、42℃。將噬菌體展示肽庫與靶標分子在不同溫度下進行孵育，然后按照相同的洗滌和洗脫步驟進行操作，檢測洗脫噬菌體的滴度和結合活性。實驗結果表明，在37℃時，噬菌體與靶標分子的結合活性較高，可能是因為這個溫度接近生物體內的生理溫度，有利于維持蛋白質的天然構象和相互作用。所以，在后續的篩選過程中，選擇37℃作為孵育溫度。pH值同樣是影響篩選效果的關鍵因素。溶液的pH值會影響蛋白質的電荷分布和構象，從而影響噬菌體與靶標分子的結合。進行不同pH值條件下的篩選實驗，設置pH值梯度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。用不同pH值的緩沖液進行噬菌體展示肽庫與靶標分子的孵育、洗滌和洗脫，檢測洗脫噬菌體的滴度和結合活性。研究發現，在pH7.5的條件下，洗脫噬菌體的結合活性較好，說明此時噬菌體與靶標分子的相互作用較為穩定。因此，在后續的實驗中，將緩沖液的pH值調整為7.5。4.2.3多輪篩選策略多輪篩選是從噬菌體展示肽庫中富集與靶標分子高親和力噬菌體的重要策略，通過多次重復篩選過程，能夠逐步提高特異性噬菌體的比例和親和力。在第一輪篩選時，主要目的是從龐大的噬菌體展示肽庫中初步捕獲與靶標分子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）有結合能力的噬菌體。由于初始肽庫中與靶標分子特異性結合的噬菌體比例較低，因此在這一輪篩選中，采用相對寬松的篩選條件。在孵育步驟中，適當延長孵育時間，如將孵育時間設置為2小時，以增加噬菌體與靶標分子的接觸機會，盡量多地捕獲陽性克隆。在洗滌步驟中，減少洗滌次數，如洗滌10次，以避免過度洗滌導致一些與靶標分子結合較弱但具有潛在特異性的噬菌體被洗脫。經過第一輪篩選后，雖然得到的噬菌體中可能包含較多非特異性結合的噬菌體，但也初步富集了一些與靶標分子有結合能力的噬菌體。從第二輪篩選開始，隨著特異性噬菌體的逐漸富集，需要逐步提高篩選條件的嚴格性，即增加選擇壓。在孵育時間上，適當縮短至1.5小時，減少非特異性結合的機會。在洗滌次數上，增加到15次，更徹底地去除未結合或弱結合的噬菌體。通過這樣的方式，篩選出與靶標分子具有更高親和力和特異性的噬菌體。在每一輪篩選后，對洗脫得到的噬菌體進行滴度測定和結合活性分析，監測特異性噬菌體的富集情況。隨著篩選輪數的增加，洗脫噬菌體的滴度會逐漸降低，但結合活性會逐漸提高，這表明特異性噬菌體在不斷富集，非特異性噬菌體被逐漸去除。一般經過3-5輪的篩選，能夠得到與靶標分子高親和力和特異性結合的噬菌體。多輪篩選的意義在于，通過逐步增加選擇壓，不斷優化篩選條件，能夠從復雜的噬菌體展示肽庫中高效地富集出與靶標分子特異性結合的噬菌體。這為后續對這些噬菌體進行深入分析，如測序確定展示的多肽序列、評估其親和力和活性等，進而篩選出具有潛在抗炎活性的尖吻蝮蛇毒多肽奠定了堅實的基礎。4.3篩選結果的分析與鑒定4.3.1噬菌體克隆的挑選與培養經過多輪篩選后，從富集的噬菌體群體中挑選出陽性克隆進行深入分析。在挑選時，依據噬菌體與靶標分子結合的活性和特異性，通常選擇與靶標分子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）結合活性較高的噬菌體克隆。通過ELISA（酶聯免疫吸附測定）初步篩選出具有較高吸光度值的噬菌體克隆，吸光度值越高，表明噬菌體與靶標分子的結合活性越強。隨機挑選10-20個這樣的噬菌體克隆，以確保篩選結果的多樣性和代表性。將挑選出的噬菌體克隆接種到對數生長期的大腸桿菌宿主菌中進行培養，如TG1。將噬菌體與大腸桿菌按一定比例混合，37℃孵育30-60分鐘，使噬菌體感染大腸桿菌。然后將感染后的大腸桿菌接種到含有相應抗生素（如氨芐青霉素）的LB培養基中，37℃振蕩培養4-6小時，使噬菌體在大腸桿菌內大量繁殖。在培養過程中，要密切觀察細菌的生長狀態和培養液的渾濁度。當培養液變得渾濁，說明細菌生長良好，噬菌體也在大量擴增。培養結束后，收集菌液，通過離心等方法分離噬菌體，得到純化的噬菌體懸液。將得到的噬菌體懸液進行保存，可置于4℃短期保存，或加入適量的甘油后置于-80℃長期保存，以備后續實驗使用。4.3.2基因測序與多肽序列分析對挑選出的噬菌體克隆進行基因測序，以確定其展示的多肽序列。將純化的噬菌體懸液進行處理，提取其中的噬菌體DNA。可采用酚-氯仿抽提法或商業DNA提取試劑盒進行DNA提取。將提取的噬菌體DNA送至專業的測序公司，利用Sanger測序或高通量測序技術進行測序。對測序結果進行分析，確定多肽的氨基酸序列。通過生物信息學工具，如BLAST（基本局部比對搜索工具），將獲得的多肽序列與已知的蛋白質和多肽數據庫進行比對，分析其與已知序列的相似性。若發現與已知的抗炎多肽或具有特定功能的多肽序列相似，可進一步推測其可能的功能和作用機制。還可以分析多肽的氨基酸組成、電荷分布、親疏水性等特征。富含堿性氨基酸的多肽可能具有較強的電荷特性，影響其與靶標分子的結合方式。親水性較強的多肽可能更容易在水溶液中與靶標分子相互作用。通過分析這些特征，有助于初步評估多肽與靶標分子結合的可能性和親和力。對多肽序列進行結構預測，如利用在線的蛋白質結構預測工具，預測多肽可能形成的二級結構和三級結構，為進一步研究多肽與靶標分子的相互作用機制提供結構基礎。4.3.3多肽與靶標結合特性的驗證利用ELISA技術驗證多肽與靶標分子TNF-α的結合能力。將TNF-α包被在酶標板上，每孔加入100-200μL濃度為1-5μg/mL的TNF-α溶液，4℃孵育過夜。孵育后，用含有0.5%-1%BSA的緩沖液封閉酶標板，37℃孵育1-2小時，然后棄去封閉液，用洗滌緩沖液（如PBST，含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液）洗滌酶標板3-5次。將篩選得到的噬菌體展示的多肽或合成的多肽用稀釋緩沖液稀釋至合適濃度，加入到包被有TNF-α的酶標板孔中，每孔加入100-200μL，37℃孵育1-2小時。孵育后，棄去孔內液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標板5-10次。加入酶標二抗，如辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗噬菌體抗體，37℃孵育1-2小時。孵育后，再次洗滌酶標板，然后加入底物溶液，如TMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺），室溫避光反應10-15分鐘。最后加入終止液，如2M