一、酶（Enzyme）的概念酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有催化功能的生物分子，所以又稱為生物催化劑Biocatalysts。酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱為酶促反應(yīng)Enzymaticreaction。在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱為底物substrate。2H2O22H2O+O2過(guò)氧化氫酶酶的化學(xué)本質(zhì)：大都是蛋白質(zhì)第三章茶葉酶工程酶具有一般催化劑的特征：1.只能進(jìn)行熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)；2.可以縮短化學(xué)反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)；3.能加快化學(xué)反應(yīng)的速度

。酶的化學(xué)本質(zhì)和催化特點(diǎn)

一、酶的催化特點(diǎn)：

1、酶具有很高的催化效率

通常要高出非生物催化劑催化活性的106-1013倍。2H2O22H2O+O21mol過(guò)氧化氫酶6×106mol.s-11mol離子鐵6×10-4mol.s-1

2、酶具有高度的專一性

3、酶易失活

4、酶活性受到調(diào)節(jié)和控制

二、酶的化學(xué)本質(zhì)

1926年J.Sumner

脲酶結(jié)晶

1930－1936年Northrop

胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶結(jié)晶

1982年T.Cech＆Altman

“Ribozyme”，即核酶。

酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的主要依據(jù)是：

（1）．酶經(jīng)酸、堿水解后的最終產(chǎn)物是氨基酸。

（2）．酶能被蛋白酶水解而失活。

（3）．酶是具有空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，凡能使蛋白質(zhì)變性的因素都可以使酶變性失活。

（4）．酶是兩性電解質(zhì)，各具有特定的PI。

（5）．酶是膠體溶液。

（6）．酶也有蛋白質(zhì)具有的化學(xué)呈色反應(yīng)。

酶單純蛋白酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。綴合蛋白酶酶蛋白（脫輔酶）輔因子（簡(jiǎn)單蛋白酶）

（apoenzyme）（cofacter)輔酶（coenzyme)輔基(prostheticgroup)全酶(holoenzyme）=酶蛋白+輔因子透析法能除去透析法不易除去三、酶的化學(xué)組成1、根據(jù)酶的組成，可把酶分為單純蛋白質(zhì)和綴合蛋白質(zhì)兩類。2、根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可將酶分為三類：

（1）．單體酶：由一條多肽鏈組成，相對(duì)分子質(zhì)量在13000－35000。屬于這一類的酶很少，一般是水解酶。

（2）．寡聚酶：由兩個(gè)或兩個(gè)以上的亞基組成，亞基間靠次級(jí)鍵結(jié)合，很容易分開(kāi)。相對(duì)分子質(zhì)量在35000－上百萬(wàn)。大多數(shù)寡聚酶其聚合形式是活性型，解聚形式是失活型。它們一般都是調(diào)節(jié)酶，在代謝的調(diào)節(jié)控制過(guò)程中起重要的作用。

（3）．多酶復(fù)合體：由幾種或更多的酶靠非共價(jià)鍵彼此嵌合而成的復(fù)合體，它有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行。相對(duì)分子質(zhì)量很大，一般在幾百萬(wàn)以上。如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、脂肪酸合成酶復(fù)體。

（4）核酶

一、酶的分類1961年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（EnzymeCommittee,EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：氧化還原酶類：主要是催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞的氧化還原反應(yīng)。（1）氧化酶類：催化底物脫氫，并氧化生成H2O2或H2OAH2+O2A+BH2（H2O2，H2O）（2）脫氫酶類：催化直接從底物上脫氫的反應(yīng)。AH2+BA+BH2（需輔酶Ⅰ或輔酶Ⅱ）酶的分類和命名2.轉(zhuǎn)移酶類：催化化合物中某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。A·X+BA+B·X根據(jù)X分成8個(gè)亞類：轉(zhuǎn)移碳基、酮基或醛基、?；?、糖基、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶類：催化加水分解作用。AB+H2OAOH+BH4.裂合酶類：催化從底物移去一個(gè)基團(tuán)而形成雙鍵的反應(yīng)。C—O鍵CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OA·BA+BC—N鍵COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH35.異構(gòu)酶：催化各種同分異構(gòu)體（分子式相同而分子構(gòu)造不同）之間的互變。AB常見(jiàn)的有醛酮異構(gòu)如：丙醛和丙酮、順?lè)串悩?gòu)和變位酶類。6.合成酶類：催化有ATP參加的合成反應(yīng)。A+B+ATPA·B+ADP+Pi二、國(guó)際系統(tǒng)分類法及酶的編號(hào)序號(hào)酶類反應(yīng)性質(zhì)反應(yīng)通式1氧化還原酶催化氧化還原反應(yīng)AH2+B?A+BH2A3＋

+B2＋?A2＋+B3＋2轉(zhuǎn)移酶催化分子間基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)AR+B?BR+A3水解酶催化水解反應(yīng)AB+H2O?AH+BOH4裂合酶催化非水解地移去底物上的一個(gè)基團(tuán)而形成雙鍵及其逆反應(yīng)AB?B＋A5異構(gòu)酶催化同分異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)變的反應(yīng)A?B6合成酶催化兩分子物質(zhì)的相互結(jié)合并偶聯(lián)ATP水解的反應(yīng)A＋B＋ATP?AB＋ADP＋PiA＋B＋ATP?AB＋AMP＋PPi1、多酚氧化酶銅離子作為輔基，在茶葉生產(chǎn)的過(guò)程中，通過(guò)抑制或有序的激發(fā)PPO的活性而加工出風(fēng)味迥異的各大茶產(chǎn)品，楊子威等研究指出PPO還與茶樹(shù)的抗蟲(chóng)、抗旱、抗寒等抗逆性密切相關(guān)。（1）具有5-15條同工酶帶，各同工酶比整個(gè)酶復(fù)合體對(duì)底物的專一性更強(qiáng)（2）茶葉PPO的最適pH偏酸性，一般在5.0-6.5，最適溫度為30-40℃。（3）最佳底物為鄰位酚，如鄰苯二酚、兒茶素、聯(lián)苯三酚，對(duì)間苯二酚、對(duì)苯二酚，對(duì)三酚類物質(zhì)中的焦性沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸也有一定的催化作用，但對(duì)單酚類物質(zhì)不起作用。

2、過(guò)氧化物酶是催化過(guò)氧化氫分解而使其他氫供體氧化并生成水的一類酶。（1）以鐵卟啉為輔基，屬亞鐵血紅素蛋白質(zhì)類，分子量為50000左右，具有9-10條同工酶。（2）最適pH4.1-6.2，最適溫度27-30℃（3）其作用的底物范圍較廣，對(duì)單酚中的酪氨酸、二酚中的兒茶素和三酚中的焦性沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸等物質(zhì)均有催化作用。（4）乙烯和吲哚乙酸對(duì)POD活性有促進(jìn)作用，但POD活性受CN-、S2-、羥胺和氟化物的抑制。

3、糖苷酶糖苷酶(Glycosidase)又稱為糖基水解酶，是一大類催化糖苷鍵水解的酶，這類酶在酸存在的條件下能催化由半縮醛羥基與醇羥基反應(yīng)而形成的糖苷鍵的斷裂。（1）茶樹(shù)中的糖苷是茶葉香氣形成的前體物質(zhì)，通常是以單糖苷和雙糖苷形式存在，單糖苷以β-葡萄糖苷為主，二糖苷以β-櫻草糖苷為主，而糖苷酶水解這些糖苷后生成游離態(tài)的香氣成分。（2）茶樹(shù)中糖苷酶種類較多，最主要的糖苷酶為β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶，其他還有β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶等。（3）β-葡萄糖苷酶屬于水解酶類，多以單體酶或二聚體形式存在，可以催化含有β-糖苷鍵化合物的水解反應(yīng)，如水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖

4、脂肪氧化酶是一種含非血紅素的蛋白質(zhì)，定位于葉綠體的片狀結(jié)構(gòu)中。（1）LOX具有很強(qiáng)的底物專一性，作用的底物必須是含順,順-1,4-戊二烯的直鏈脂肪酸，且對(duì)C18氫過(guò)氧化物催化效果最好，對(duì)三烯酸氫過(guò)氧化物比二烯酸的反應(yīng)活性高4-10倍。（2）相對(duì)分子量為73kDa，至少存在2條同工酶，最適pH6.0-7.0，最適溫度40-45℃，具有較強(qiáng)的耐熱能力，因而在干茶樣中仍可檢測(cè)出部分活性。（3）可被Ca2+激活，而有機(jī)溶劑、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Co2+等金屬離子可抑制其活性，但存在濃度效應(yīng)。

5、茶氨酸合成酶又稱谷氨酸-乙胺合成酶，可催化由谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的反應(yīng)。（1）茶氨酸合成酶在茶樹(shù)根部和新梢中均有分布，盡管分布的部位不同，但其酶學(xué)性質(zhì)基本相同。（2）茶氨酸合成酶在Tris-HCl緩沖液中最適pH為7.5左右。（3）酶促反應(yīng)速度依賴于Mg2+濃度，而Mn2+影響較小6、兒茶素合成的關(guān)鍵酶兒茶素合成過(guò)程中包括苯丙氨酸解氨酶、二氫黃酮醇4-還原酶、無(wú)色花色素還原酶、花青素還原酶等多種酶，這些酶類物質(zhì)將多條兒茶素代謝途徑相連而形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。（1）以鐵卟啉為輔基，屬亞鐵血紅素蛋白質(zhì)類，分子量為50000左右，具有9-10條同工酶。（2）最適pH4.1-6.2，最適溫度27-30℃（3）其作用的底物范圍較廣，對(duì)單酚中的酪氨酸、二酚中的兒茶素和三酚中的焦性沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸等物質(zhì)均有催化作用。（4）乙烯和吲哚乙酸對(duì)POD活性有促進(jìn)作用，但POD活性受CN-、S2-、羥胺和氟化物的抑制。

7、單寧酶單寧酶因具有水解沒(méi)食子酸酯類化合物生成沒(méi)食子酸和葡萄糖的特性，而在茶飲料澄清工藝中發(fā)揮著重要作用。（1）單寧酶專一性強(qiáng)，對(duì)不含酚羥基的底物類似物不起催化作用，且底物中苯環(huán)上酚羥基的位置對(duì)其催化活性也有影響。（2）微生物所產(chǎn)單寧酶的最適反應(yīng)溫度一般為30-60°C。來(lái)源于真菌和植物的單寧酶最適pH偏酸，一般為4.0-6.0。而細(xì)菌所產(chǎn)單寧酶的最適pH偏中性。（3）金屬離子和EDTA（乙二胺四乙酸）對(duì)不同微生物來(lái)源的單寧酶活性影響差異很大。KenjiAoki等（1976）發(fā)現(xiàn)Zn2+、Cu2+等金屬離子以及EDTA對(duì)單寧酶活性沒(méi)有明顯影響，而RajakumarGS和NancySC（1983）認(rèn)為Cu2+、Zn2+以及Mg2+對(duì)單寧酶具有明顯的抑制作用。8、果膠酶是一類能夠分解果膠的多種酶的總稱。根據(jù)催化底物類型可分為果膠酯酶、果膠解聚酶和果膠裂解酶三大類。（1）果膠酯酶是指以高甲酯化果膠為底物，促使其脫去甲基基團(tuán)的酶；果膠解聚酶是指在水分子參與下，斷裂果膠內(nèi)的多聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷鍵的酶；（2）果膠裂解酶又稱果膠反式消去酶，作用于C-4位置上斷開(kāi)糖苷鍵，同時(shí)從C-5處消去一個(gè)H原子從而產(chǎn)生一個(gè)不飽和產(chǎn)物。（3）目前市售的食品級(jí)果膠酶主要來(lái)源于黑曲霉，其產(chǎn)生的果膠酶酶系較為健全。

9、纖維素酶是一類能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶（又稱纖維二糖酶）3種組分。（1）內(nèi)切葡聚糖酶能夠水解纖維素分子內(nèi)的β-1,4-糖苷鍵；外切葡聚糖酶可從纖維素的非還原末端水解β-1.4-糖苷鍵產(chǎn)生纖維二糖；而β-葡萄糖苷酶能夠水解纖維二糖或纖維寡糖產(chǎn)生葡萄糖。3種組分相互協(xié)作共同完成纖維素的降解過(guò)程。（2）纖維素酶的最適pH一般為4.0-6.0，最適反應(yīng)溫度為40-65°C，在50-70°C較為穩(wěn)定。二、酶的命名法1、習(xí)慣命名法：只取較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。

（1）．根據(jù)酶作用的底物命名如水解淀粉的酶叫淀粉酶；水解蛋白質(zhì)的酶叫蛋白酶。有時(shí)還加上來(lái)源以區(qū)分不同來(lái)源的同一類酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。（2）．根據(jù)酶催化反應(yīng)的性質(zhì)命名如水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、脫氫酶等。有的酶的命名結(jié)合以上（1）、（2）原則。如蘋(píng)果酸脫氫酶、氨基酸氧化酶、ATP合成酶等。2、系統(tǒng)命名法：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型

系統(tǒng)名稱應(yīng)當(dāng)明確標(biāo)明酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)。如有兩個(gè)底物，則兩個(gè)底物的名稱都應(yīng)標(biāo)明，并用“：”將它們隔開(kāi)。若底物之一是水時(shí)，則可將其略去。習(xí)慣名稱系統(tǒng)名稱催化的反應(yīng)乙醇脫氫酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶乙醇：NAD＋氧化還原酶丙氨酸：α－酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶乙醇＋NAD＋→乙醛＋NADH丙氨酸＋α－酮戊二酸→谷氨酸＋丙酮酸酶的系統(tǒng)編號(hào)：4位數(shù)字第一位：代表六大類反應(yīng)類型第二位：亞類（底物作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)）第三位：亞亞類（精確表示受體的性質(zhì)）第四位：在亞亞類中的序號(hào)乳酸脫氫酶

EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，受氫體為NAD+該酶在亞亞類中的編號(hào)注：前面三個(gè)編號(hào)表明酶的特性：反應(yīng)性質(zhì)、底物性質(zhì)（鍵的類型）及電子或基團(tuán)的受體，第四個(gè)編號(hào)用于區(qū)分不同的底物。

絕對(duì)專一性結(jié)構(gòu)專一性鍵專一性相對(duì)專一性基團(tuán)專一性

酶作用專一性

旋光異構(gòu)專一性立體異構(gòu)專一性幾何異構(gòu)專一性酶的專一性1.鍵專一性：只作用于一種鍵，而對(duì)鍵兩端的基團(tuán)無(wú)嚴(yán)格要求。RCOO-+ROH+H+′酯酶：R—C—O—R′+H2OOOCH2OHOHOHOH15α-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH3.絕對(duì)專一性：只能作用于某一底物。脲酶：H2N—C—NH2+H2OO2NH3+CO22.基團(tuán)專一性：要求一定的鍵，對(duì)鍵一端的基團(tuán)有要求HH要求α-糖苷鍵，并且要求α-糖苷鍵的一端須有葡萄糖殘基4.旋光異構(gòu)專一性

例如，淀粉酶只能選擇性地水解D－葡萄糖形成的1，4－糖苷鍵；L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化；乳酸脫氫酶只對(duì)L-乳酸是專一的。5.幾何異構(gòu)專一性如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸即反－丁烯二酸水合生成蘋(píng)果酸，對(duì)馬來(lái)酸（順－丁烯二酸）則不起作用；酶活力的測(cè)定

一、酶活力：

又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速率來(lái)表示。酶促反應(yīng)的速率用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。V=dp/dt反應(yīng)初速度Vo用哪一個(gè)速度來(lái)表示酶促反應(yīng)的速度特征呢？反應(yīng)初速度表示酶活力的大小即底物轉(zhuǎn)化量<5%時(shí)的反應(yīng)速度。產(chǎn)物濃度變化曲線二、酶活力的表示方法及計(jì)算P1011、酶活力單位U

酶活力單位（習(xí)慣單位U）的基本定義為：在最適條件下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的酶量。據(jù)不同情況有幾種酶活力單位（activityunit）或又稱酶單位（enzymeunit）。在實(shí)際使用中，為方便起見(jiàn)，經(jīng)常使用不同的酶活力單位。如：①α-淀粉酶活力單位：每小時(shí)分解1g可溶性淀粉的酶量為一個(gè)酶單位。

②胰蛋白酶：每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量。國(guó)際單位：一般用IU（Unit）表示，其定義為在最佳條件下，每分鐘將1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶國(guó)際單位。

Katal

一個(gè)“Katal”單位是指在最適條件下，1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。

Kat和IU的換算關(guān)系：1Kat=60×106IU，

1Kat=106μKat=109nKat1IU=1／60μKat=16.7nKat

在實(shí)際使用中，為方便起見(jiàn)，經(jīng)常使用不同的酶活力單位。三、比活力（specificactivity）

酶的比活力是每單位（一般是mg）蛋白質(zhì)中的酶活力單位數(shù)（如：酶單位/mg蛋白）

比活力=IU數(shù)/mg蛋白=Kat數(shù)/kg蛋白=μKat數(shù)/mg蛋白對(duì)同一種酶來(lái)說(shuō)，比活力越大，表示酶的純度越高。酶的作用機(jī)理

酶作為生物催化劑的最大特點(diǎn)：具有高效性、專一性、。那么酶是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)這一特點(diǎn)的呢？酶的催化機(jī)理一、酶與活化能碰撞、有效碰撞、活化分子、活化能：分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需要的能量稱為活化能。也就是在一定溫度下，1摩爾底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需的自由能。反應(yīng)所需的活化能越高，相對(duì)活化分子就越少，反應(yīng)速度就越慢。酶的作用機(jī)制

酶是一種高效催化劑，與一般催化劑比較，大大降低了反應(yīng)分子所需的活化能，因此，同樣初態(tài)的分子所需要的活化能就更低，活化分子數(shù)也就更多，大大加快了反應(yīng)速度。舉例：過(guò)氧化氫酶催化過(guò)氧化氫的分解mov酶催化機(jī)理過(guò)氧化氫酶催化過(guò)氧化氫的分解75.4KJ/mol48.9KJ/mol8.4KJ/mol酶的催化機(jī)理二、酶與底物作用機(jī)理催化機(jī)理目前較滿意的解釋是：中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)又叫

過(guò)渡態(tài)學(xué)說(shuō)酶如何降低化學(xué)反應(yīng)的活化能?中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)酶與底物通過(guò)形成中間產(chǎn)物使反應(yīng)沿一個(gè)低活化能的途徑進(jìn)行。E+S

ESE+P酶的催化機(jī)理二、酶與底物作用機(jī)理中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)酶的催化機(jī)理二、酶與底物作用機(jī)理底物S與酶E結(jié)合形成中間產(chǎn)物ES

S與E的結(jié)合導(dǎo)致分子中某些敏感的化學(xué)鍵發(fā)生變化，呈不穩(wěn)定狀態(tài)，亦即活化態(tài)，使反應(yīng)活化能降低。中間產(chǎn)物ES不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)變成酶與產(chǎn)物的復(fù)合物EP，EP裂解，生成產(chǎn)物P，這一過(guò)程使所需的活化能低Sumary-中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)酶的催化機(jī)理二、酶與底物作用機(jī)理mov酶催化機(jī)理酶催化機(jī)理

中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)認(rèn)為：酶在催化化學(xué)反應(yīng)時(shí)，酶與底物首先形成不穩(wěn)定的中間物，然后分解酶與產(chǎn)物。即酶將原來(lái)活化能很高的反應(yīng)分成兩個(gè)活化能較低的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行，因而加快了反應(yīng)速度。

S+E→ESPE→P+E底物酶中間產(chǎn)物復(fù)合物產(chǎn)物

實(shí)驗(yàn)依據(jù)1.間接證據(jù)：如：用吸光法證明了含鐵卟啉的過(guò)氧化物酶參加反應(yīng)時(shí)，單純的酶的吸收光譜與加入了第一個(gè)底物H2O2后確實(shí)產(chǎn)生了變化。2.直接證據(jù)：

過(guò)渡態(tài)中間復(fù)合物ES，是一種極不穩(wěn)定的物質(zhì)，壽命只有10-12秒，正常情況下是找不到的，通過(guò)低溫處理（-50℃），使ES的壽命延長(zhǎng)至2天，彈性蛋白酶切片的電鏡照片以及X光衍射圖都證明了ES的存在。

二、酶的活性部位酶分子上直接和底物結(jié)合，并和酶催化作用直接相關(guān)的部位，這一部位就稱為酶的活性中心(activecenter)。

已糖激酶的活性中心

結(jié)合部位(Bindingsite)：酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。催化部位(Catalyticsite):

酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。

通常將酶的結(jié)合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。結(jié)合部位決定酶的專一性，催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。

在酶分子中有一些基團(tuán)對(duì)維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象及發(fā)揮正常的催化活性是必需的，若將這些基團(tuán)改變后會(huì)導(dǎo)致酶的催化活性減弱甚至喪失，稱為必需基團(tuán)。

結(jié)合基團(tuán)活性中心內(nèi)必需基團(tuán)催化基團(tuán)活性中心外必需基團(tuán)：維持酶的空間構(gòu)象底物活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)活性中心酶活性中心的特點(diǎn)

酶的活性中心只有幾個(gè)氨基酸組成，多為極性氨基酸。酶的活性中心形成一個(gè)能與底物結(jié)合并催化底物形成產(chǎn)物的，位于酶蛋白分子表面的，特定化空間區(qū)域。酶的活性中心與底物的結(jié)合通過(guò)次級(jí)鍵。酶的活性中心具有柔性，可與底物誘導(dǎo)契合發(fā)生相互作用。酶的活性中心位于酶分子表面的”空穴“中，為非極性疏水環(huán)境。三、誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)與酶的專一性(1)鎖鑰假說(shuō)(lockandkeyhypothesis)：1894年，F(xiàn)isher提出“鎖與鑰匙”假說(shuō)，該假說(shuō)認(rèn)為酶表面具有特定的形狀，像一把鎖，底物分子或底物分子的一部分像鑰匙那樣，專一地插入酶的特定部位，底物分子與酶分子在結(jié)構(gòu)上具有緊密的互補(bǔ)關(guān)系。

認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣酶的催化機(jī)理

此學(xué)說(shuō)很好地解釋了酶的立體異構(gòu)專一性，但不能解釋酶的活性中心既適合于可逆反應(yīng)的底物，又適合于產(chǎn)物，也不能解釋酶專一性中的所有現(xiàn)象。（二）誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)(InducedfitHypothesis)1958年D.E.Koshland提出酶分子活性中心的結(jié)構(gòu)原來(lái)并非和底物的結(jié)構(gòu)互相吻合，但酶的活性中心是柔性的而非剛性的。酶的催化機(jī)理

當(dāng)?shù)孜锱c酶相遇時(shí)，可誘導(dǎo)酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)的變化，其上有關(guān)的各個(gè)基團(tuán)達(dá)到正確的排列和定向，因而使底物和酶能完全契合。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束產(chǎn)物從酶分子上脫落下來(lái)后，酶的活性中心又恢復(fù)成原來(lái)的構(gòu)象。二、酶與底物作用機(jī)理酶的催化機(jī)理

二、酶與底物作用機(jī)理四、影響酶催化效率的因素1、底物與酶的鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)2、底物分子的形變和誘導(dǎo)契合3、酸堿催化4、共價(jià)催化5.金屬離子的作用6.活性部位的微環(huán)境的影響對(duì)于雙分子反應(yīng)，底物結(jié)合到酶的活性中心兩個(gè)底物分子相鄰近，大大提高了底物的有效濃度——鄰近效應(yīng)底物分子還在活性中心“定向”排布，有利于原子軌道的重疊——軌道定向，使分子間反應(yīng)近似于分子內(nèi)反應(yīng)

四、酶催化的高效性的機(jī)理酶催化的高效性1.鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)酶AB鄰近效應(yīng)與定向作用（proximityeffect&orientationarrange）酶將2個(gè)底物拉近，以準(zhǔn)確的方向碰撞。實(shí)際上是將分子間的反應(yīng)變成類似于分子內(nèi)的反應(yīng)2、“張力”和“形變”：底物與酶結(jié)合誘導(dǎo)酶的分子構(gòu)象變化，變化的酶分子又使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”甚至“形變”，從而促使酶－底物中間產(chǎn)物進(jìn)入過(guò)渡態(tài)。3、酸堿催化：狹義的酸-堿催化：H+和OH-的催化廣義的酸-堿催化：化學(xué)上把酸定義為質(zhì)子的供體，堿定義為質(zhì)子的受體。質(zhì)子受體和質(zhì)子供體形成的酸堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸－堿催化方式。細(xì)胞內(nèi)的酸堿催化是指組成酶活性中心的氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)，在底物的變化中起質(zhì)子的供體或受體的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過(guò)程，從而加快反應(yīng)的速度。具有酸堿催化特征的酶促反應(yīng)，酶與底物結(jié)合成的中間產(chǎn)物是離子型絡(luò)合物。舉例：His殘基的咪唑基是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個(gè)催化功能團(tuán)。His是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個(gè)催化功能團(tuán)。(pK=6)半壽期小于10

10秒酸堿催化His57

4、共價(jià)催化：1）酶活性中心親電基團(tuán)或親核基團(tuán)分別吸取電子或放出電子作用于底物的缺電子中心，迅速形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過(guò)渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過(guò)程，稱為共價(jià)催化。2）親電基團(tuán)(電子受體)——H+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、羰基碳原子（有空軌道）；親核（親質(zhì)子）基團(tuán)(電子供體)——OH、SH、咪唑基（帶負(fù)電荷）親核基團(tuán)親電子的基團(tuán)

—CH2—OH

絲氨酸羥基

—CH2

—SH

半胱氨酸巰基

—CH2—C=CHHNNCH

組氨酸咪唑基蛋白質(zhì)中三種主要的親核基團(tuán)共價(jià)催化His57酶活性中心處于一個(gè)非極性環(huán)境中，從而有利于同底物的結(jié)合。（能夠減弱極性基團(tuán)間的相互作用。）5.微環(huán)境的影響（酶活性中心是低介電區(qū)域）結(jié)合區(qū)可避免水分子干擾在避開(kāi)水分子的干擾下，分子間的離子鍵才容易產(chǎn)生。-+小結(jié)

酶與底物結(jié)合時(shí)，由于酶的變形（誘導(dǎo)契合）或底物變形（張力學(xué)說(shuō)）使二者相互結(jié)合，并依靠離子鍵、氫鍵、范德華力的作用和水的影響，結(jié)合為中間產(chǎn)物，在酶分子的非極性區(qū)域內(nèi)，由于酶與底物的鄰近，定向，使二者可以通過(guò)親核\親電催化、酸堿催化方式進(jìn)行的多元催化，從而大大降低反應(yīng)所需的活化能，使酶促反應(yīng)迅速進(jìn)行。第2節(jié)茶葉酶的來(lái)源與生產(chǎn)1茶產(chǎn)業(yè)中重要酶的來(lái)源名稱來(lái)源多酚氧化酶E.C.1.10.3.1茶葉、梨等植物單寧酶E.C.3.1.1.20黑曲霉、黃曲霉、米曲霉果膠酶E.C.3.2.1.15綠色木霉其及其近緣的菌株纖維素酶E.C.3.2.1.4黑曲霉、青霉、根霉、木霉β-葡萄糖苷酶黑曲霉木瓜蛋白酶E.C.3.4.22.2木瓜蛋白酶E.C.3.4.22.4

菠蘿一個(gè)良好的產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：（1）菌株安全，不是致病菌，不產(chǎn)生有毒物質(zhì)或是其他生理活性物質(zhì)，以保證茶葉酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的安全；（2）菌株不易變異和退化，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定；（3）不易感染噬菌體；（4）微生物繁殖快，產(chǎn)酶量高；（5）酶的性質(zhì)符合應(yīng)用的需要，最好是胞外酶；（6）產(chǎn)生的酶便于分離和提取，得率高；（7）微生物的營(yíng)養(yǎng)要求低。2茶產(chǎn)業(yè)中酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶的發(fā)酵生產(chǎn)是在人工控制的條件下，有目的的通過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)微生物，以獲得微生物合成的酶，主要包括培養(yǎng)基制備、發(fā)酵方式的選擇與優(yōu)化等方面。（1）培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基為微生物的生長(zhǎng)、繁殖、代謝及酶的生產(chǎn)提供所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)素是培養(yǎng)基的五要素，這些成分的比例并不是一成不變的，可根據(jù)菌種的更新、發(fā)酵條件的變化而做出相應(yīng)的調(diào)整。a.在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中所用的水一般為自來(lái)水b.考慮原料價(jià)格以及來(lái)源，通常使用農(nóng)副產(chǎn)物、各種淀粉以及水解物作為碳源。c.蛋白胨、豆餅、花生餅粉、魚(yú)粉等農(nóng)副產(chǎn)物是常用的有機(jī)氮源，而常用的無(wú)機(jī)氮源主要為硫酸銨和尿素。氮源的選擇因微生物菌種以及酶蛋白的不同而異，如利用綠色木霉生產(chǎn)纖維素酶時(shí)，因有機(jī)氮促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖而不利于纖維素酶的合成，應(yīng)選用硫酸銨等無(wú)機(jī)氮作為其氮源。d.無(wú)機(jī)鹽在微生物發(fā)酵生產(chǎn)中具有濃度效應(yīng)，即低濃度的無(wú)機(jī)鹽有利于提高酶產(chǎn)量，而高濃度則會(huì)抑制生產(chǎn)。e.生長(zhǎng)因子是微生物代謝活動(dòng)所必須的微量有機(jī)物，包括維生素、氨基酸、嘌呤堿等構(gòu)成輔酶所必須的物質(zhì)。大部分的生長(zhǎng)因子是酶蛋白的誘導(dǎo)物或是表面活性劑。pH值也是培養(yǎng)基制備過(guò)程中需要著重考慮的一個(gè)因素，霉菌、酵母菌偏好微酸性的環(huán)境，而多數(shù)的細(xì)菌、放線菌適合在中性至微堿性的環(huán)境中生長(zhǎng)。（2）酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式多酚氧化酶多是通過(guò)植物材料中分離純化獲得，其他酶類多是由微生物發(fā)酵制備的。主要有固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵兩種。固體發(fā)酵法是指在固體、半固體或富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的惰性載體上培養(yǎng)微生物和生產(chǎn)酶的一種方法。固體發(fā)酵接近于微生物的生長(zhǎng)環(huán)境而有利于菌株生長(zhǎng)與酶的合成，后期的酶蛋白提取方便，有的甚至不需要提取，直接作為粗酶制劑。與液體發(fā)酵相比，在發(fā)酵過(guò)程中固體發(fā)酵不產(chǎn)生廢水，一定程度上減少了環(huán)境污染。此外，培養(yǎng)基多使用麩皮、米糠等農(nóng)副產(chǎn)品，來(lái)源廣泛，可選擇性大。雖然固體發(fā)酵方式較為簡(jiǎn)便，但操作條件不易控制、易染菌、缺乏高效的發(fā)酵反應(yīng)器是制約其發(fā)展的瓶頸。液體深層發(fā)酵法是以液體培養(yǎng)基為原料進(jìn)行的微生物繁殖和產(chǎn)酶的方法。液體發(fā)酵的條件較好控制，不易污染雜菌，生產(chǎn)效率較高，且能隨時(shí)檢測(cè)酶活力，成為現(xiàn)在多數(shù)酶蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)方式。根據(jù)操作方式，液體深層發(fā)酵可分為分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)及連續(xù)培養(yǎng)。分批培養(yǎng)一次投放、一次產(chǎn)出，操作簡(jiǎn)單且不易染菌，是最常用的發(fā)酵方式，但是分批培養(yǎng)發(fā)酵的時(shí)間較短、生產(chǎn)效率低。連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)酶的時(shí)間長(zhǎng)，但是極易染菌。補(bǔ)料分批發(fā)酵介于二者之間，是工業(yè)普遍使用的液體發(fā)酵方式。相對(duì)于固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵技術(shù)成熟，但其存在酶蛋白濃度低、需要濃縮處理、分離提取困難、耗能大、產(chǎn)生廢液等缺點(diǎn)。（3）酶的發(fā)酵條件優(yōu)化酶的發(fā)酵條件優(yōu)化是指在已有的常規(guī)菌種或基因工程菌的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)生物反應(yīng)器操作條件的改進(jìn)，或發(fā)酵設(shè)備的選型改造，以降低生產(chǎn)成本，提高酶生產(chǎn)能力和產(chǎn)品質(zhì)量。發(fā)酵溫度、pH、溶氧量是影響微生物生長(zhǎng)以及分泌酶蛋白的重要因素，在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行適度調(diào)整是提高酶產(chǎn)量及其品質(zhì)的重要措施。微生物在低于最適溫度時(shí)生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶能力低；而過(guò)高的發(fā)酵溫度又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞熱休克，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量蛋白酶而使目的酶蛋白的產(chǎn)量下降。一般情況下，微生物發(fā)酵初期需要保溫，在生長(zhǎng)過(guò)程中則需要降低發(fā)酵溫度。發(fā)酵溫度的選定，需結(jié)合菌種特性、發(fā)酵方式等進(jìn)行優(yōu)化。pH是另一影響微生物產(chǎn)酶的因素。微生物新陳代謝的過(guò)程中不斷產(chǎn)生代謝產(chǎn)物并釋放到培養(yǎng)基中，而使發(fā)酵培養(yǎng)基中pH發(fā)生改變。因此發(fā)酵過(guò)程需要對(duì)培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。溶解氧濃度是影響發(fā)酵效果的又一重要因素。多數(shù)產(chǎn)酶微生物為好氧微生物，需要在溶解有大量氧氣的培養(yǎng)基中生產(chǎn)。由于氧氣微溶于水，因此在生產(chǎn)過(guò)程中必須以無(wú)菌空氣的形式向培養(yǎng)基中通氣以滿足微生物生長(zhǎng)需要。但如果直接向發(fā)酵罐中通氣又會(huì)產(chǎn)生氣泡，因而發(fā)酵過(guò)程中不僅需要監(jiān)測(cè)發(fā)酵液的溶解氧水平，還需適時(shí)對(duì)氣泡進(jìn)行消除處理。此外，培養(yǎng)基的C/N比、生長(zhǎng)因子、濕度等也是影響微生物產(chǎn)酶的重要因素。對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，還需在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物以促進(jìn)產(chǎn)量，如纖維素二糖可作為纖維素酶的誘導(dǎo)物，提高其產(chǎn)量。第3節(jié)茶葉酶的分離純化細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。胞內(nèi)酶胞外酶1.酶的分離純化策略2.細(xì)胞破碎3.酶的提取4.酶的分離方法5.酶的濃縮、干燥與結(jié)晶1、酶的分離純化策略1、基本原則1）首要原則：防止酶變性失活2）預(yù)防蛋白質(zhì)變性的方法和措施：（1）所有操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行。（2）pH合適。（3）減少泡沫產(chǎn)生。（4）加少量重金屬螯合劑。（5）添加特異性物質(zhì)，采用親和層析方法。（6）減少微生物及雜蛋白的存在。（7）適當(dāng)添加其他抑制蛋白質(zhì)降解的試劑。2、

細(xì)胞破碎通過(guò)各種方法使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞的技術(shù)過(guò)程。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿、表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理一種從植物中提取超氧物歧化酶的方法：ａ．稱取，加入0.05mol/LＫ2ＨPO4溶液，搗碎勻漿，并壓榨過(guò)濾；ｂ．濾液中加入1/4體積4:4的乙醇:氯仿混合溶液，攪拌均勻，2000rpm離心20分鐘；ｃ．取上清液按15g/L加入K2HPO4攪勻，再加入0.6體積的丙酮，2000rpm離心20分鐘；ｄ．取上清液，加入1體積的丙酮，2200rpm離心20分鐘；ｅ．棄上清液，沉淀溶于于3mmol/L的磷酸緩沖液（pH7.5）中，并透析；ｆ．透析液用Sephadex-G75或G100進(jìn)行凝膠過(guò)濾，收集活性部分。方法舉例霉菌：較容易，通過(guò)機(jī)械剪切、研磨或者加入細(xì)胞壁溶解酶。細(xì)菌：少量采用超聲波破碎和溶菌酶處理，大量用丙酮干粉法，或用自溶法。酵母菌：細(xì)胞壁溶解酶處理法、稀鹽溶液振蕩法、冷熱破壁法。酶的提?。阂卜Q為酶的抽提，指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過(guò)程。提取目標(biāo)：將目的酶最大限度地溶解出來(lái)。保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但要防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。提取原則：相似相溶。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。酶的提取提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶1、酶的主要提取方法2、影響酶提取的主要因素1）溫度2）pH值3）提取液的體積酶的分離方法1、沉淀分離（溶解度）2、離心分離（分子量，密度）3、過(guò)濾與膜分離（分子大小、形狀）4、層析分離（分子形狀、大小、分子量、電荷、吸附力等）5、電泳分離（電荷、分子量）6、萃取分離（溶解度）1、沉淀分離

通過(guò)改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法（中性鹽沉淀）利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過(guò)在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離。等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。復(fù)合沉淀法（有機(jī)聚合物沉淀）在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離。選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離。（1）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度）鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。硫酸銨優(yōu)點(diǎn)：這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。缺點(diǎn)：緩沖能力較差，銨離子的存在會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。

溶液中飽和硫酸銨的體積飽和度＝溶液的總體積（2）等電點(diǎn)沉淀（isoelectricprecipitation）

原理：蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低；不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)。使用方法：?jiǎn)为?dú)使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度。（3）有機(jī)溶劑沉淀法（降低介電常數(shù)）有機(jī)溶劑沉淀原理：主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對(duì)于具有水膜的分子來(lái)說(shuō)，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用的有機(jī)溶劑：丙酮、乙醇、甲醇、異丙醇等（2倍，70%）優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：

1）分辨率比鹽析法高。

2）沉淀不需脫鹽。

3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心。缺點(diǎn)：

1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活。

2）有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。影響有機(jī)溶劑沉淀的因素（1）溫度：低溫（0℃）操作。（2）pH值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。（3）離子強(qiáng)度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度目的防止蛋白質(zhì)變性（4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為5?20mg/ml（4）復(fù)合沉淀法（有機(jī)聚合物沉淀法）原理：與有機(jī)溶劑類似

。沉淀劑：多用聚乙二醇。優(yōu)點(diǎn)：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。（5）選擇性變性沉淀法定義：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。方法：①熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。②pH變性等電點(diǎn)沉淀法是pH變性法中的一種變體。③有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。2、離心分離離心分離：借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。（1）離心機(jī)的選擇名稱轉(zhuǎn)速(r/min)注意事項(xiàng)酶分離純化中的用途低速離心機(jī)

6000常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x高速離心機(jī)6000?25000冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡沉淀細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等超速離心機(jī)>25000冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化離心機(jī)操作平衡、定溫、定速、定時(shí)。（2）離心方法的選擇

差速離心法沉降速度法密度梯度離心沉降平衡法等密度梯度離心①差速離心（differentialcentrifugation）定義：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。

2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。

3）沉降的顆粒受到擠壓。②密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）定義：樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。常用密度梯度溶液：蔗糖溶液。特點(diǎn)：

1）區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。

2）適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。③等密度梯度離心定義：又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。離心時(shí)，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時(shí)不再移動(dòng)，形成區(qū)帶。

常用梯度介質(zhì)：氯化銫溶液。特點(diǎn)：

1）介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。

2）適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。密度梯度離心等密度梯度離心梯度介質(zhì)通常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降樣品通常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降樣品離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間，高速度分離依據(jù)密度相近，但沉降系數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度不同沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)過(guò)濾非膜過(guò)濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過(guò)濾介質(zhì)膜過(guò)濾：采用各種高分子膜為過(guò)濾介質(zhì)3、過(guò)濾與膜分離過(guò)濾是借助于過(guò)濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜過(guò)濾的分類及其特性

(根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同)膜分離加壓膜分離微濾超濾反滲透電場(chǎng)膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴(kuò)散膜分離透析納濾（NF，Nanofiltration）：是一種介于反滲透和超濾之間的壓力驅(qū)動(dòng)膜分離過(guò)程，流體靜壓差電場(chǎng)正負(fù)極小分子擴(kuò)散顆粒大小膜四種常用膜分離過(guò)程的截留特性根據(jù)膜材料和不同進(jìn)料液的特性，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。4、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的（稱為固定相），另一個(gè)相則流過(guò)此固定相（稱為流動(dòng)相）并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。分子的大小和形狀分子極性吸附力分子親和力分配系數(shù)……層析法的分類按兩相所處的狀態(tài)分類：按操作形式分類：按層析過(guò)程機(jī)理分類：液相層析液-固層析液-液層析氣相層析氣-固層析氣-液層析柱層析紙層析薄層層析

層析方法分離依據(jù)吸附層析吸附力分配層析分配系數(shù)離子交換層析離子交換凝膠層析相對(duì)分子質(zhì)量與形狀親和層析親和力層析聚焦等電點(diǎn)疏水層析疏水作用層析分離方法1）吸附層析（adsorptionchromatography）是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。吸附：被吸附物吸附到吸附劑的表面上。解吸：被吸附物離開(kāi)吸附劑表面。

吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過(guò)程。溶劑洗脫法：采用單一或混合的溶劑進(jìn)行洗脫的方法。置換洗脫法：采用置換洗脫液進(jìn)行洗脫的方法。置換洗脫液：含有一種吸附力比被吸附組分更強(qiáng)的溶液。前緣洗脫法：又稱前緣分析法，連續(xù)向吸附層析柱中加入欲分離的混合溶液。分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)：指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，分配系數(shù)是一常數(shù)。紙上層析分配薄層層析分配氣相層析2）分配層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。3）離子交換層析（ionexchangechromatography，IEC）

按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽(yáng)離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。

陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì))

陽(yáng)離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽(yáng)離子交換劑：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3離子交換層析Ion-exchangechromatography凝膠層析又稱為凝膠過(guò)濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。4）凝膠層析Size-exclusionchromatography酶分離純化的方法1、沉淀分離2、離心分離3、過(guò)濾與膜分離4、層析分離鹽析沉淀法等電點(diǎn)沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法復(fù)合沉淀法選擇性變性沉淀法差速離心密度梯度離心等密度梯度離心粗濾微濾超濾納濾反滲透吸附層析分配層析離子交換層析凝膠層析親和層析層析聚焦凝膠對(duì)溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi——內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve——某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時(shí)的洗脫液體積（ml）凝膠過(guò)濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時(shí),即Ve=Vo,說(shuō)明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1時(shí),即Ve=Vo+Vi，說(shuō)明該組分能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)空隙，最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。Ve-VoKd=————Vi

分配系數(shù)Kd的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，

Kd差異小，分離效果差。常用的凝膠：

葡聚糖凝膠 瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠

凝膠型號(hào)顆粒大小/μm溶脹體積/(ml/g)分離范圍（Mr）SephadexG-10SephadexG-15SephadexG-25SephadexG-50SephadexG-75SephadexG-100SephadexG-150SephadexG-2004～1204～12050～15050～15040～12040～12040～12040～1202～32.5～3.54～69～1112～1515～2020～3020～30小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

型號(hào)使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）含瓊脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～1500001086421類型說(shuō)明功能基反離子DEAE-SephadexA-25，A-50弱堿性陰離子交換劑二乙氨基己基氯QAE-SephadexA-25，A-50強(qiáng)堿性陰離子交換劑二乙氨基己基——2-羥丙基氯CM-SephadexC-25，C-50弱酸性陽(yáng)離子交換劑羧甲基鈉SP-SephadexC-25，C-50強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑磺丙基鈉離子交換葡聚糖5）親和層析親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物，酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，酶與輔助因子，抗原與抗體，酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段，RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等親和層析親和層析的四個(gè)要素根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性，親和層析可以分為：共價(jià)親和層析疏水層析金屬離子親和層析免疫親和層析染料親和層析凝集素親和層析生物大分子中的功能基團(tuán)與配基形成可逆共價(jià)鍵酶蛋白與配基發(fā)生疏水結(jié)合酶蛋白表面的某些氨基酸殘基與金屬離子親和結(jié)合抗原與抗體的特異結(jié)合需要核苷酸類物質(zhì)的某些輔酶與有些染料特異結(jié)合凝集素能與糖蛋白的殘基專一而又可逆結(jié)合6）層析聚焦（chromatofocusing）層析聚焦：將酶等兩性物質(zhì)的