中國出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《精米中谷蛋白含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法》（征求意見稿）編制說明江蘇蘇中健康產(chǎn)業(yè)有限公司南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心2025年02月精米中谷蛋白含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法》（草案）編制說明一、工作簡(jiǎn)況1．任務(wù)來源《精米中谷蛋白含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法》是根據(jù)《中國出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》的規(guī)定，經(jīng)立項(xiàng)評(píng)審和公示等程序獲得中國出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)批準(zhǔn)立項(xiàng)，“中檢協(xié)標(biāo)﹝2023﹞2號(hào)”發(fā)文批復(fù)的立項(xiàng)號(hào)（P/CIQA-129-2023）。本標(biāo)準(zhǔn)由中國出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)提出并歸口，由江蘇蘇中健康產(chǎn)業(yè)有限公司主持編寫，協(xié)作單位包括南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心和南京財(cái)經(jīng)大學(xué)。2．主要工作過程主持單位和協(xié)作單位共同完成標(biāo)準(zhǔn)的制定，主要包括以下幾個(gè)階段：（1）調(diào)研與立項(xiàng)：2022年11月-2022年12月，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)征求意見和論證工作，聯(lián)合提出對(duì)《精米中谷蛋白含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法》的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行制定的立項(xiàng)申請(qǐng)，并于2023年1月批準(zhǔn)立項(xiàng)。隨后成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，制定了詳細(xì)的工作計(jì)劃，開展本標(biāo)準(zhǔn)制定的各項(xiàng)工作。（2）資料收集與分析匯總：2023年1-2月，工作組對(duì)國標(biāo)、行標(biāo)、團(tuán)標(biāo)、地標(biāo)、CAC、ISO、EU、EC等標(biāo)準(zhǔn)全面收集，并在中國知網(wǎng)、維譜數(shù)據(jù)庫、WebofScience等進(jìn)行了文獻(xiàn)檢索。將搜集到的資料進(jìn)行了分析研究，目前谷蛋白檢測(cè)國內(nèi)外均無國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。工作組成員經(jīng)過多次分析討論，并在充分結(jié)合企業(yè)方法摸索結(jié)果的基礎(chǔ)之上，初步確定馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行含量測(cè)定。查詢的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)見下表。表相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)查詢匯總標(biāo)準(zhǔn)來源標(biāo)準(zhǔn)名稱相關(guān)內(nèi)容國內(nèi)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定GB5009.5-2016【第一法】凱氏定氮法和【第二法】分光光度法，【第三法】燃燒法，適用于蛋白質(zhì)含量在10g/100g以上固體試樣檢測(cè)稻谷GB/T1350-2009【質(zhì)量要求】中沒有蛋白質(zhì)的指標(biāo)和檢測(cè)方法大米GB/T1354-2810沒有蛋白質(zhì)的指標(biāo)和檢測(cè)方法五常大米GB/T19266沒有蛋白質(zhì)的指標(biāo)和檢測(cè)方法國外稻米CODEXSTAN198【質(zhì)量指標(biāo)】中沒有蛋白質(zhì)的指標(biāo)和檢測(cè)方法起草階段2023年3月，根據(jù)前期文獻(xiàn)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)查詢，設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案進(jìn)行探索性試驗(yàn)，對(duì)對(duì)照品制備方法和考馬斯亮藍(lán)染色操作步驟進(jìn)行細(xì)化，形成標(biāo)準(zhǔn)初稿。標(biāo)準(zhǔn)修改與完善2023年4-12月，工作組對(duì)標(biāo)準(zhǔn)初稿進(jìn)行研究討論和提出修改意見，尤其是針對(duì)提取方法等研究，并根據(jù)提出的方法，進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步修改和完善。2023年12月-2025年1月，對(duì)前期提出的方法進(jìn)行研究并驗(yàn)證，進(jìn)一步修改和完善，以確保標(biāo)準(zhǔn)具有實(shí)用性。二、標(biāo)準(zhǔn)編制的基本原則和確定標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容確定團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》進(jìn)行編寫。其主要內(nèi)容包括：封面：按中國出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)對(duì)封面的格式要求編寫。前言：按國標(biāo)規(guī)定的格式編寫。前言表明：①本標(biāo)準(zhǔn)的提出并歸口單位為中國出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)；②本標(biāo)準(zhǔn)的起草單位為江蘇蘇中健康產(chǎn)業(yè)有限公司、南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心。標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容：封面、前言、范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、方法提要、設(shè)備和試劑、分析步驟、結(jié)果計(jì)算、精密度和附錄。標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于精米中谷蛋白含量的測(cè)定。樣品的制備及提取方法優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)品本標(biāo)準(zhǔn)使用的標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白：純度≥99.0%樣品的制備考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)原理是考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色化合物，在595nm有最大吸收峰，且藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索過程中，發(fā)現(xiàn)精米和小麥在脫脂過程中溶液呈黃色，且顏色與脂肪含量有關(guān)，見下圖，未脫脂的精米在谷蛋白提取過程中會(huì)掛壁嚴(yán)重，各分級(jí)蛋白不易分離，且可能會(huì)干擾蛋白質(zhì)的含量檢測(cè)。為避免脂肪干擾蛋白質(zhì)的提取及后續(xù)采用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白質(zhì)的含量，在樣品前處理時(shí)需進(jìn)行脫脂。圖樣品脫脂過程圖（左邊：小麥；右邊：大米）樣品和石油醚按照1:4（w/v）混合后室溫下脫脂6h，如下表所示，該步驟脫脂率為93.10%，已能去除樣品中的大部分脂肪，因此在樣品脫脂過程，采用樣品和石油醚1:4（w/v）比例可有效去除樣品中脂肪，避免對(duì)蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的影響。表脫脂前后樣品脂肪含量對(duì)比接收瓶質(zhì)量/g試樣質(zhì)量/g恒重后接收瓶+脂肪/g脂肪含量/g/100g均值脫脂率/%未脫脂米粉86.15074.024686.17230.540.5893.1087.40134.256687.42880.6587.29034.317387.31420.55脫脂米粉87.19914.514187.20060.030.0487.52724.286587.52990.0685.86994.490985.8710.02谷蛋白的提取精米中蛋白質(zhì)可分為溶于水的清蛋白、溶于鹽的球蛋白、溶于醇的醇溶蛋白和溶于稀酸或稀堿的谷蛋白四類，在谷蛋白的提取過程中，一般可直接提取，即去除其他三種分級(jí)蛋白后提取獲得谷蛋白，也可先提取總蛋白后再分別去除其他三種分級(jí)蛋白獲得谷蛋白，在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)探索中，發(fā)現(xiàn)堿提總蛋白，提取不完全，因此本標(biāo)準(zhǔn)采用直接提取法，將脫脂后樣品根據(jù)四種蛋白的性質(zhì)分別去除其他三種蛋白后，再用稀堿提取谷蛋白。①去除清蛋白對(duì)清蛋白的提取過程主要優(yōu)化了提取時(shí)間、溫度和料液比三個(gè)參數(shù)。各條件下提取的清蛋白含量結(jié)果見下圖。如圖a所示，當(dāng)清蛋白提取時(shí)間為0.5h和1.5h時(shí)，清蛋白含量沒有顯著性差異，為節(jié)約時(shí)間成本，清蛋白最佳提取條件為0.5h；如圖b所示，當(dāng)提取溫度為60℃、70℃、80℃時(shí)，清蛋白含量沒有顯著性差異，避免高溫使蛋白質(zhì)變性，清蛋白最佳提取溫度為60℃；如圖c所示，當(dāng)料液比超過1:20時(shí)，清蛋白含量增加不顯著，清蛋白最佳提取料液比為1:20。因此用去離子水去除清蛋白最佳條件為料液比1:20，溫度60℃，時(shí)間0.5h。abc圖不同提取時(shí)間、溫度、料液比對(duì)清蛋白含量的影響②去除球蛋白對(duì)球蛋白的提取過程主要優(yōu)化了提取時(shí)間、溫度和料液比三個(gè)參數(shù)。各條件下提取的球蛋白含量結(jié)果見下圖。如圖a所示，當(dāng)球蛋白提取時(shí)間為0.5h和1.0h時(shí)，球蛋白含量沒有顯著性差異，為節(jié)約時(shí)間成本，球蛋白最佳提取條件為0.5h；如圖2b所示，當(dāng)提取溫度為60℃、70℃時(shí)，球蛋白含量沒有顯著性差異，避免高溫使蛋白質(zhì)變性，球蛋白最佳提取溫度為60℃；如圖2c所示，當(dāng)料液比超過1:40時(shí)，球蛋白含量增加不顯著，球蛋白最佳提取料液比為1:40。因此去除球蛋白最佳條件為提取液5%氯化鈉與樣品料液比為1:40，溫度60℃，時(shí)間0.5h。abc圖不同提取時(shí)間、溫度、料液比對(duì)球蛋白含量的影響③去除醇溶蛋白對(duì)醇溶蛋白的提取過程主要優(yōu)化了提取時(shí)間、溫度和料液比三個(gè)參數(shù)。各條件下提取的醇溶蛋白含量結(jié)果見下圖。如圖a所示，當(dāng)醇溶蛋白提取時(shí)間為10min時(shí)，醇溶蛋白含量最高；如圖b所示，當(dāng)提取溫度為60℃、70℃時(shí)，醇溶蛋白含量沒有顯著性差異，避免高溫使蛋白質(zhì)變性，醇溶蛋白最佳提取溫度為60℃；如圖3c所示，當(dāng)料液比為1:30時(shí)，醇溶蛋白含量最高。因此去除醇溶蛋白條件為70%乙醇與樣品料液比為1:30，溫度60℃，提取時(shí)間10min。abc圖3不同提取時(shí)間、溫度、料液比對(duì)醇溶蛋白含量的影響④谷蛋白的提取對(duì)谷蛋白的提取過程主要優(yōu)化了提取時(shí)間、溫度、料液比和堿液濃度四個(gè)參數(shù)。各條件下提取的谷蛋白含量結(jié)果見下圖。如圖a所示，當(dāng)谷蛋白提取時(shí)間為1h時(shí)，谷蛋白含量最高；如圖b所示，當(dāng)提取溫度為40℃、50℃時(shí)，谷蛋白含量沒有顯著性差異，避免高溫使蛋白質(zhì)變性，谷蛋白最佳提取溫度為40℃；如圖c所示，當(dāng)料液比為1:25時(shí)，谷蛋白含量最高；如圖d所示，當(dāng)堿液濃度為0.03mol/L時(shí)，谷蛋白含量最高。因此谷蛋白提取條件為0.03mol/L氫氧化鈉提取，料液比為1:25，提取溫度40℃，提取時(shí)間1h。abcd圖不同提取時(shí)間、溫度、料液比、堿液濃度對(duì)谷蛋白含量的影響⑤補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)-提取次數(shù)優(yōu)化上述單因素試驗(yàn)分別優(yōu)化各分級(jí)蛋白料液比、提取溫度和提取時(shí)間，為進(jìn)一步優(yōu)化谷蛋白提取條件，對(duì)分級(jí)蛋白提取次數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化。由下表可知，清蛋白第三次提取上清液和球蛋白、醇溶蛋白第二次提取上清液吸光度值小于0.2，不在0.2-0.8線性范圍內(nèi)，不具有參考價(jià)值，故清蛋白提取次數(shù)為2次，球蛋白和醇溶蛋白提取次數(shù)為1次。表兩次提取分級(jí)蛋白含量對(duì)比上清液名稱+稀釋倍數(shù)吸光度吸光度均值備注第一次提取清蛋白2×0.4530.4300.4420.4160.4100.4130.4260.4120.419球蛋白2×0.3740.4010.3880.3650.4100.3880.3650.4070.386醇溶蛋白3×0.2510.2580.2550.2420.2530.2480.2540.2780.266第二次提取清蛋白1×0.2460.2360.2410.2750.2510.2630.2530.2350.244球蛋白1×0.1350.1220.129吸光度值不在0.2-0.8范圍內(nèi)，不具有參考價(jià)值0.1340.1130.1240.1320.1280.130醇溶蛋白1×0.1120.1510.1320.0870.1160.1020.0930.120.107第三次提取清蛋白1×0.1880.1920.1900.1940.1970.1960.1830.1890.186⑥補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)-谷蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)谷蛋白單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)谷蛋白提取條件進(jìn)行五因素四水平正交實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見下表。根據(jù)方差分析可得，提取時(shí)間、料液比、溫度、堿液濃度和提取次數(shù)對(duì)谷蛋白含量的影響都極顯著。考慮實(shí)際問題，確定谷蛋白的提取條件為提取時(shí)間為90min，料液比為1:25，溫度為45℃，堿提液濃度為0.04mol/L，提取次數(shù)為1次。表正交實(shí)驗(yàn)因素水平水平因素提取時(shí)間/min料液比溫度/℃堿液濃度/mol/L提取次數(shù)1301:20300.0212601:25350.0323901:30400.04341201:35450.054表正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果編號(hào)ABCDE谷蛋白含量/%1111110.412122221.083133331.714144441.745212341.486221431.677234120.908243211.659313422.5910324312.5111331241.4512342130.9613414230.5314423140.9015432411.8616441321.97K11.231.251.370.791.61K21.431.541.351.181.63K31.881.481.711.921.22K41.311.581.421.961.39R0.640.330.371.170.41表正交實(shí)驗(yàn)方差分析表來源平方和自由度均方F值P顯著性A(提取時(shí)間)2.94230.981968.2260.0000**B(料液比)0.77430.258254.6560.0000**C(溫度)0.99630.332327.8280.0000**D(堿提液濃度)11.99533.9983947.8710.0000**E(提取次數(shù))1.40930.47463.6090.0000**誤差0.032320.001注：*.P＜0.05，差異顯著；**.P＜0.01，差異極顯著三、方法學(xué)驗(yàn)證分析報(bào)告方法線性關(guān)系：以牛血清白蛋白為定量外標(biāo)，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，蛋白含量在20-80μg范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2達(dá)到0.99，線性良好。方法準(zhǔn)確度和精密度：該方法的清蛋白樣品回收率為98.00%-100.00%、球蛋白樣品回收率為89.40%-95.07%、谷蛋白樣品回收率為93.90%-99.53%，平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的回收率RSD均小于5%，說明該方法精確度較好，能夠滿足精米中谷蛋白的準(zhǔn)確測(cè)定。具體方法驗(yàn)證結(jié)果見附件1：方法學(xué)驗(yàn)證報(bào)告采用國際標(biāo)準(zhǔn)的程度及水平，與現(xiàn)行有關(guān)法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系無相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。五、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)制定過程中無重大分歧意見。六、涉及專利的有關(guān)說明本標(biāo)準(zhǔn)不涉及專利。附件1精米中谷蛋白含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法方法學(xué)驗(yàn)證1.測(cè)定范圍分別取空白溶液、系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液中蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)（x），吸光度值為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。表1線性范圍蛋白質(zhì)含量μg01020406080100吸光度值00.1100.2060.3720.5480.6750.808線性方程及相關(guān)系數(shù)Y=0.008X+0.032R2=0.9937r=0.9968由表1可知，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量在20-80μg范圍內(nèi)，吸光度值滿足0.2-0.8范圍內(nèi)，線性回歸方程相關(guān)系數(shù)r2大于0.99，線性良好。2.檢出限和定量限基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法，對(duì)至少20個(gè)空白樣品進(jìn)行測(cè)試。按照LOD=3σ/S公式計(jì)算，LOQ=10σ/S公式計(jì)算，式中σ:空白樣品響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；S:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.008X+0.032時(shí)，20個(gè)空白樣品測(cè)試結(jié)果見表2。表2空白樣品的響應(yīng)值空白樣品吸光度平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差檢出限定量限0.7190.7180.0020.00075mg/mL0.0025mg/mL0.7200.7160.7170.7170.7160.7170.7150.7220.7160.7190.7190.7190.7180.7130.7200.7180.7190.7170.718由上述結(jié)果可知，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)谷蛋白含量的檢出限為0.00075mg/mL，定量限為0.0025mg/mL。3.方法精密度（1）重復(fù)性對(duì)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行6次平行測(cè)定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示RSD=0.48%<5%，重復(fù)性良好。表3標(biāo)準(zhǔn)品精密度結(jié)果樣品123456RSD/%吸光度值A(chǔ)0.8590.8600.8680.8680.8620.8600.48（2）中間精密度選擇3個(gè)不同時(shí)間對(duì)同一種實(shí)際樣品測(cè)定三次。稻花香2號(hào)樣品的谷蛋白平均含量為2.71%，三次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.31%、1.27%、1.90%，均小于5%，說明方法的精密度良好。具體結(jié)果見表4。表4不同時(shí)間稻花香2號(hào)谷蛋白含量測(cè)定對(duì)比樣品名稱谷蛋白含量%均值±標(biāo)準(zhǔn)差RSD/%稻花香2號(hào)2.67042.6357±0.03461.312.772.60122.63542.75522.7881±0.03541.272.78352.82552.64762.7059±0.05131.902.72622.74404.方法正確度分別在清蛋白、球蛋白、谷蛋白的實(shí)際樣品中進(jìn)行3水平、3平行的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果回收率和精密度，以評(píng)估方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，結(jié)果詳見下表5-表7。表5清蛋白實(shí)際樣品的加標(biāo)回收實(shí)際樣品含量/mg添加量/mg實(shí)測(cè)值/mg回收率/%平均值/%RSD/%3.231.504.7098.0098.720.703.271.504.7598.673.231.504.73100.003.233.006.2099.003.273.006.2599.333.233.006.2099.003.234.507.6498.003.274.507.7098.443.234.507.6498.00表6球蛋白實(shí)際樣品的加標(biāo)回收實(shí)際樣品含量/mg添加量/mg實(shí)測(cè)值/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.572.506.8691.6091.472.024.552.506.8090.004.562.506.8390.804.575.009.2493.404.555.009.0289.404.565.009.0790.204.577.5011.3590.404.557.5011.6895.074.567.5011.4992.40表7谷蛋白實(shí)際樣品的加標(biāo)回收實(shí)際樣品含量/mg添加量/mg實(shí)測(cè)值/mg回收率/%平均值/%RSD/%22.9210.0032.5195.9096.731.8023.4710.0032.8693.9023.6310.0033.3697.3021.9120.0041.3297.0521.8120.0040.8995.4021.9920.0041.5597.8020.6930.0050.5599.5320.9730.0049.9896.7020.4230.0049.5897.20由上表可知，該方法的清蛋白樣品回收率為98.00%-100.00%、球蛋白樣品回收率為89.40%-95.07%、谷蛋白樣品回收率為93.90%-99.53%，加標(biāo)回收率平均值均在90%-105%之間，方法的正確度良好，表明該提取方法對(duì)三種蛋白的提取率較高。鑒于牛血清白蛋白不溶于70%乙醇，故該方法對(duì)醇溶蛋白的回收率難以通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。5.不同品牌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較選擇了四個(gè)不同品牌（1：阿拉丁純度96%、2：購于慧興生化試劑有限公司、3：購于南京奧多福尼生物科技有限公司純度>98%、4：購于上海凱為化學(xué)科技有限公司純度98%）的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)其繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，主要比較標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和相關(guān)系數(shù)。四個(gè)不同品牌牛血清白蛋白繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表8。表8不同品牌牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比序號(hào)線性方程相關(guān)系數(shù)1y=0.008x+0.0480.99112y=0.0071x+0.04140.99063y=0.007x+0.04040.99004y=0.0076x+0.04050.9917由上表可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，斜率在0.007-0.008范圍內(nèi)，重復(fù)性良好。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用4號(hào)牛血清白蛋白。6.標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性對(duì)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，在加入考馬斯亮藍(lán)溶液后，每隔5min測(cè)一次吸光度，結(jié)果如下表9。表9標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性時(shí)間/min51015202530RSD/%吸光度值A(chǔ)0.8510.8280.8080.7870.7660.7425.05從表中可以看出，加入考馬斯亮藍(lán)溶液后測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)溶液在30min內(nèi)穩(wěn)定，RSD<10%。7.方法適用性（1）不同品種選