1.2基因工程的基本操作程序實施基因工程第一步

目前常用的方法有:1、從自然界已有的物種中分離

2、用人工方法合成目的基因的獲取目的基因:主要指編碼蛋白質的結構基因。

也可以是一些具有調控作用的因子。1.2

基因工程的基本操作程序原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區編碼區(編碼區上游)(編碼區下游)與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子編碼區非編碼區不編碼蛋白質，有調控作用編碼蛋白質編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列不編碼蛋白質，有調控作用編碼區非編碼區非編碼區啟動子終止子編碼區上游編碼區下游外顯子內含子與RNA聚合酶結合位點（間隔的、不連續的）真核細胞的基因結構1.從基因文庫中獲取目的基因。

(1)概念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。一、目的基因的獲取(2)分類：(3)基因文庫的構建基因組文庫部分基因文庫基因組文庫：包含了一種生物所有的基因。部分基因文庫：包含了一種生物的一部分基因。基因組文庫的構建通過對受體菌的培養而儲存基因mRNA單鏈cDNA雙鏈cDNA反轉錄DNA聚合酶cDNA文庫的構建2.利用PCR技術擴增目的基因（1）PCR——__________反應

PCR技術是一項在生物_____復制____________的核酸合成技術。（使用PCR擴增儀）（2）原理：（3）前提：要有一段______________的核苷酸序列，以便根據這一序列合成_____。（4）過程：（5）比較PRC技術與細胞中的DNA復制一、目的基因的獲取DNA雙鏈復制原理多聚酶鏈式體外特定DNA片段已知目的基因引物PCR技術DNA復制相同點原料條件不同點場所酶解旋方式結果四種脫氧核苷酸模板、ATP、酶體外復制細胞核內熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）細胞內的DNA聚合酶、解旋酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化在短時間內形成大量的DNA片段形成整個DNA分子3.人工合成基因一、目的基因的獲取反轉錄法根據已知的氨基酸序列合成DNA目的基因的mRNA單鏈cDNA雙鏈cDNA(即目的基因)反轉錄DNA聚合酶蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成二、構建表達載體同一種目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代，使目的基因表達和發揮作用。P15思考3&4幾種常見的轉化方法：1、導入到植物細胞2、導入到動物細胞3、導入到微生物細胞三、導入受體細胞顯微注射技術轉化

：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。農桿菌轉化法

基因槍法

花粉管通道法三、導入受體細胞導入植物細胞：農桿菌轉化法土壤農桿菌：具有趨化性（酚），感染雙子葉植物和裸子植物三、導入受體細胞基因槍法：

單子葉植物常用的一種基因轉化方法，但成本較高。三、導入受體細胞花粉管通道法：

十分簡便經濟的方法。我國的轉基因抗蟲棉就是用此方法獲得。三、導入受體細胞顯微注射法

重組DNA提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵發育新性狀動物三、導入受體細胞導入到微生物細胞將目的基因轉到大腸桿菌細胞中的操作步驟：1)獲得目的基因和質粒載體；2)形成重組質粒；3)用Ca+處理，制備感受態細胞,用重組質粒轉化大腸桿菌細胞；4)培養大腸桿菌，讓重組質粒形成大量拷貝；5)篩選含重組質粒的大腸桿菌細胞。1.篩選含有目的基因的受體細胞（1）抗藥性篩選法——標記基因（2）DNA分子雜交：2.檢測目的基因的表達——性狀體現（1）檢測目的基因是否轉錄出了mRNA（2）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（3）檢測性狀四、目的基因的檢測與鑒定分子雜交抗原—抗體雜交——個體生物學水平抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等四、目的基因的檢測與鑒定DNA分子雜交示意圖