第十一章抗菌類藥物的分析第一節

概述第二節β-內酰胺類抗生素的分析第三節

氨基糖苷類抗生素的分析第四節

四環素類抗生素的分析第五節喹諾酮類藥物的分析第六節磺胺類藥物的分析第一節概述抗菌類藥物、抗生素的概念：

抗菌藥物是指對細菌具有抑制和殺滅作用的藥物，包括抗生素和人工合成抗菌藥。

抗生素（antibiotics）是指在低微濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用的化學物質的總稱。第一節概述一、抗生素的特點

1.化學純度低：同系物多、異構體多、降解產物多。2.活性組分易變異：菌株變化、發酵條件改變可引起產品質量變化。3.穩定性差：本身分子結構不穩定，易分解，使療效降低或失效甚至產生毒副作用

第一節概述二、抗生素的質量控制方法

（一）鑒別試驗

1.化學方法

2.儀器分析方法3.生物學方法第一節概述二、抗生素的質量控制方法

（二）雜質檢查1.異常毒性試驗

限制藥品中引起毒性反應的雜質。2.熱原試驗

限制藥品中引起體溫異常升高的致熱物質。3.降壓試驗

限制藥品中含有降低血壓的雜質。4.無菌試驗

檢查藥品中細菌污染的情況，保證產品用藥安全。第一節概述二、抗生素的質量控制方法

（二）雜質檢查5.澄明度檢查

限制藥品中不溶性雜質。6.水分測定

檢查藥品中水分含量，確保產品穩定。7.酸堿度檢查

規定產品溶液的酸堿度，使產品穩定且適合臨床應用。第一節概述二、抗生素的質量控制方法

（三）含量或效價測定1.抗生素微生物檢定法：抗生素微生物檢定法是以抗生素抑制細菌生長或殺滅細菌的能力作為衡量抗生素效價的標準。藥典中收錄的測定方法為管碟法和濁度法第一節概述二、抗生素的質量控制方法

（三）含量或效價測定1.抗生素微生物檢定法優點靈敏度高、用量少適用范圍廣，可用于已知、未知藥物與臨床要求一致缺點操作繁瑣、測定時間長、測定誤差大第一節概述二、抗生素的質量控制方法

（三）含量或效價測定2.化學及物理化學法：本類方法是根據抗生素的化學結構特點，利用其特有的化學或物理化學性質而進行的。優點簡單、快速專屬性高缺點不一定代表抗生素的效價第一節概述二、抗生素的質量控制方法

（三）含量或效價測定3.抗生素活性表示方法

抗生素的活性以效價單位表示，即指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。用單位（U）或微克（μg）表示。1mg青霉素鈉定為1670單位；1mg的慶大霉素定為590單位；1mg的硫酸卡那霉素定為670單位。第二節β-內酰胺類抗生素的分析一、結構與性質

（一）基本結構A:β-內酰胺環；B:氫化噻唑環A:β-內酰胺環；B:氫化噻唑環

青霉素類

頭孢菌素類第二節β-內酰胺類抗生素的分析常見青霉素類藥物的結構第二節β-內酰胺類抗生素的分析常見頭孢菌素類藥物的結構頭孢氨芐頭孢羥氨芐頭孢拉定頭孢噻吩鈉第二節β-內酰胺類抗生素的分析一、結構與性質

（二）理化性質1.性狀

青霉素類和頭孢菌素類藥物大多數為白色、類白色或微黃色結晶或結晶性粉末。其分子中的游離羧基具有較強的酸性，能與無機堿或某些有機堿形成鹽，它們的堿金屬鹽易溶于水。2.旋光性青霉素、頭孢菌素分子中均含有手性碳原子，故具有旋光性。如藥典規定苯唑西林鈉的比旋度應為+195°～+214°。第二節β-內酰胺類抗生素的分析一、結構與性質

（二）理化性質3.紫外吸收特征青霉素分子中的母核部分無共軛結構，但其側鏈部分具有苯環或其他共軛系統，則有最大吸收。如頭孢氨芐的水溶液在262nm處有最大吸收4.β-內酰胺環的不穩定性易受親核性或親電性試劑的進攻，在酸、堿、青霉素酶以及某些氧化劑的作用下，β-內酰胺環易分解或發生分子重排，產生一系列降解產物，從而失去抗菌作用。第二節β-內酰胺類抗生素的分析青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸pH2100℃α–青霉噻唑酰基羥胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2青霉素的降解反應第二節β-內酰胺類抗生素的分析二、鑒別（一）色譜法1.薄層色譜法與對照品比較比移值與斑點顏色。

2.高效液相色譜法

是通過比較供試品與對照品色譜行為的一致性進行鑒別的。一般規定：在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。第二節β-內酰胺類抗生素的分析二、鑒別（二）光譜法1.紫外-可見分光光度法（1）根據供試品的最大吸收波長進行鑒別將供試品配制成一定濃度的水溶液，根據其吸收光譜的最大吸收波長進行鑒別。（2）利用水解產物的最大吸收波長鑒別將供試品在一定條件下水解，測定水解物的最大吸收波長與吸光度。青霉素鈉第二節β-內酰胺類抗生素的分析二、鑒別（二）光譜法2.紅外分光光度法物質的紅外光譜可以反映其相應的分子結構。幾乎所有分子結構已知的抗生素原料藥都有其特征的紅外光譜，專屬性較強。中國藥典規定，在一定的條件下，將供試品的紅外吸收圖譜與標準對照圖譜，進行對照應一致。第二節β-內酰胺類抗生素的分析二、鑒別（三）化學鑒別法1.鉀、鈉鹽的焰色反應

青霉素類和頭孢菌素類抗生素的鈉鹽在無色火焰中燃燒顯鮮黃色。

青霉素類和頭孢菌素類抗生素測鉀鹽在無色火焰中燃燒顯紫色。第二節β-內酰胺類抗生素的分析二、鑒別（三）化學鑒別法2.呈色反應（1）肽鍵特征反應

本類藥物中含有-CONH-結構，一些取代基是α-氨基酸結構的藥物，可顯雙縮脲反應和茚三酮反應。如氨芐西林遇茚三酮顯藍紫色。第二節β-內酰胺類抗生素的分析二、鑒別（三）化學鑒別法2.呈色反應（2）羥肟酸鐵反應

β-內酰胺類抗生素中的β-內酰胺環在堿性介質中與羥胺反應，β-內酰胺環開裂，生成羥肟酸，在稀酸溶液中與三價鐵離子作用生成羥肟酸鐵配離子而呈色。不同的青霉素與頭孢菌素形成的配合物顯示出不同的顏色。如哌拉西林顯紅棕色。第二節β-內酰胺類抗生素的分析二、鑒別（三）化學鑒別法3.其他反應

頭孢菌素7位側鏈含有—C6H5OH基團時，能與重氮苯磺酸試液產生偶合反應，顯橙黃色。普魯卡因青霉素水溶液酸化后，游離出的芳伯胺基，顯重氮化偶合反應，生成紅色的偶氮化合物沉淀。第二節β-內酰胺類抗生素的分析三、雜質檢查

本類抗生素的特殊雜質主要有高分子聚合物、有關物質、異構體等，一般采用HPLC法控制其含量，也有采用測定雜質的吸光度來對雜質進行控制的方法。（一）高分子雜質抗生素藥物中的高分子雜質系指藥品中分子量大于藥物本身的雜質的總稱。

高分子雜質按其來源可分為外源性雜質和內源性雜質。第二節β-內酰胺類抗生素的分析

外源性雜質包括蛋白、多糖、多肽類等雜質或其與抗生素的結合物。來源：發酵工藝，其中蛋白多肽類雜質在抗生素的過敏反應中起著重要作用。內源型雜質系指藥物的自身聚合物。來源：生產過程，也可在貯存過程中形成，甚至也可因使用不當而產生。高分子雜質方法

分子排阻色譜法，如：青霉素聚合物照分子排阻色譜法（通則0514）測定。第二節β-內酰胺類抗生素的分析第二節β-內酰胺類抗生素的分析（二）有關物質的檢查

一般采用高效液相色譜法檢查。第二節β-內酰胺類抗生素的分析四、含量測定

青霉素和頭孢菌素含量測定可采用抗生素微生物檢定法和理化測定法。《中國藥典》2015年版多采用高效液相色譜法。

頭孢哌酮含量測定Ch.P.（2015）【含量測定】填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相三乙胺醋酸溶液-乙腈-水（1.2:120:880)對照品頭孢哌酮第三節氨基糖苷類抗生素的分析一、結構與性質

（一）化學結構鏈霉素第三節氨基糖苷類抗生素的分析一、結構與性質

（一）化學結構慶大霉素第三節氨基糖苷類抗生素的分析一、結構與性質

（一）化學結構慶大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7C2CH3HHC20H41N5O7C1aHHHC19H39N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7慶大霉素C復合物第三節氨基糖苷類抗生素的分析一、結構與性質

（二）理化性質1.堿性該抗生素的分子中含有多個羥基和堿性基團，是具有堿性的水溶性抗生素，可與無機酸結合成可溶于水、但幾乎不溶于有機溶劑的鹽類。臨床上應用的主要為硫酸鹽。2.旋光性本類抗生素分子結構中含有多個氨基糖，具有旋光性。第三節氨基糖苷類抗生素的分析一、結構與性質

（二）理化性質3.水解性其硫酸鹽水溶液在pH=5～7.5，溫度低于25℃時最穩定；過酸或過堿均發生水解而失效，加溫可促進水解。第三節氨基糖苷類抗生素的分析一、結構與性質

（二）理化性質4.紫外吸收鏈霉素分子中含有胍基，在230nm處有紫外吸收。但慶大霉素、奈替米星在紫外區無吸收。第三節氨基糖苷類抗生素的分析二、鑒別（一）茚三酮反應α-氨基醇、羥基胺類藍紫色第三節氨基糖苷類抗生素的分析二、鑒別（一）茚三酮反應α-氨基醇、羥基胺類藍紫色第三節氨基糖苷類抗生素的分析二、鑒別（二）麥芽酚反應

鏈霉素特征的反應。鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經分子重排使環擴大形成六元環，然后消除N—甲基葡萄糖胺和鏈霉胍，再消除鏈霉胍生成麥芽酚。麥芽酚在弱酸性溶液中可與鐵離子（Fe3+）形成紫紅色配位化合物。第三節氨基糖苷類抗生素的分析二、鑒別（二）麥芽酚反應

鏈霉素特征的反應。鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經分子重排使環擴大形成六元環，然后消除N—甲基葡萄糖胺和鏈霉胍，再消除鏈霉胍生成麥芽酚。麥芽酚在弱酸性溶液中可與鐵離子（Fe3+）形成紫紅色配位化合物。紫紅色第三節氨基糖苷類抗生素的分析第三節氨基糖苷類抗生素的分析二、鑒別（三）N-甲基葡萄糖胺反應

本類抗生素經水解可產生葡萄糖胺衍生物，如鏈霉素經水解可產生N-甲基葡萄糖胺，在堿性溶液中可與乙酰丙酮反應，形成吡咯衍生物，再與對二甲氨基苯甲醛在酸性醇溶液中反應生成櫻桃紅色縮合物。第三節氨基糖苷類抗生素的分析二、鑒別（四）坂口反應

鏈霉胍特有反應橙紅色次溴酸鈉8-羥基喹啉（或α-萘酚）第三節氨基糖苷類抗生素的分析二、鑒別（五）硫酸鹽反應

本類藥物多為硫酸鹽，各國藥典都將硫酸根的鑒別試驗作為鑒別這類抗生素的一個方法。（六）色譜法

薄層色譜法，應用較廣泛。

高效液相色譜法

（七）光譜法

多采用紅外分光光度法鑒別此類藥物，比較供試品的紅外吸收圖譜和相應對照圖譜的一致性。第三節氨基糖苷類抗生素的分析三、雜質檢查

（一）有關物質的檢查

《中國藥典》2015年版多采用高效液相色譜法測定此類藥物有關物質的含量。

（二）慶大霉素C組分的測定*對微生物的活性無明顯差異*毒副作用和耐藥性不同發酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致方法：HPLC第三節氨基糖苷類抗生素的分析三、雜質檢查（三）溶液的澄清度與顏色

硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素均應檢查溶液的澄清度與顏色，以控制生產中引入的雜質、菌絲體、培養基、降解產物和色素等的限量。

硫酸鏈霉素受熱后可發生變質反應。（四）硫酸鹽測定

本類抗生素臨床應用的主要為其硫酸鹽，各國藥典規定利用配位滴定法測定硫酸鹽含量。第三節氨基糖苷類抗生素的分析四、含量測定

主要用微生物檢定法。部分藥物采用HPLC法。

例硫酸鏈霉素Ch.P.（2015）【含量測定】精密稱取本品適量，加滅菌水定量制成每1ml中約含1000單位的溶液，照抗生素微生物檢定法（通則1201）測定。可信限率不得大于7%。1000慶大霉素單位相當于1mg慶大霉素。一、結構與性質

（一）化學結構

四環素類抗生素可以看作四并苯或萘并萘的衍生物，由A、B、C、D四個環組成。根據結構中各取代基R、R1、R2、R3的不同構成了不同的四環素類抗生素。慶大霉素第四節四環素類抗生素的分析一、結構與性質

（一）化學結構第四節四環素類抗生素的分析第四節四環素類抗生素的分析一、結構與性質

（二）性質二甲胺基弱堿性酚羥基、烯醇型羥基弱酸性1.酸堿性兩性第四節四環素類抗生素的分析一、結構與性質

（二）性質四環素含有6個結晶水，水含量達到19.6%。含結晶水的四環素類抗生素在加熱或放置在干燥器內則會失去結晶水，若再將其置于空氣中，則又吸收空氣中的水分，恢復到原來所含結晶水的數目。2.引濕性第四節四環素類抗生素的分析一、結構與性質

（二）性質（1）差向異構化反應3.不穩定性

第四節四環素類抗生素的分析一、結構與性質

（二）性質（2）酸性條件下的降解反應3.不穩定性

第四節四環素類抗生素的分析一、結構與性質

（二）性質（3）堿性條件下的降解反應3.不穩定性

四環素異四環素第四節四環素類抗生素的分析一、結構與性質

（二）性質4.與金屬離子形成配合物

四環素類抗生素分子中具有酚羥基和烯醇基，能與許多金屬離子形成有色配位化合物。5.紫外吸收和熒光特性

本類抗生素分子內含有共軛雙鍵系統，在紫外光區有吸收，在紫外光照射下能產生熒光，其降解產物也具有熒光，可供鑒別。6.旋光性四環素類抗生素分子中具有手性碳原子，因此具有旋光性。第四節四環素類抗生素的分析二、鑒別（一）硫酸反應

四環素類與硫酸反應，立即產生不同顏色，可用此法鑒別和區別各種四環素類藥物。鹽酸四環素

顯深紫色鹽酸金霉素

顯藍色后又轉變為橄欖綠色鹽酸土霉素

顯朱紅色鹽酸多西環素

顯黃色鹽酸美他環素

顯橙紅色。第四節四環素類抗生素的分析二、鑒別（二）三氯化鐵反應

四環素類抗生素分子結構中具有酚羥基，遇三氯化鐵試液立即產生顏色。

第四節四環素類抗生素的分析二、鑒別（三）氯化物反應

本類抗生素臨床多用其鹽酸鹽，顯氯化物鑒別反應。（四）紫外-可見分光光度法

四環素類抗生素分子中含有共軛雙鍵系統，在紫外光區有吸收，故可利用其紫外-可見分光光度法鑒別。如鹽酸多西環素在269nm和354nm的波長處有最大吸收，在234nm和296nm的波長處有最小吸收。第四節四環素類抗生素的分析二、鑒別（五）熒光分光光度法

本類抗生素分子結構中含有共軛雙鍵系統，在紫外光照射下可產生熒光，其降解產物也具有熒光，可供鑒別。（六）紅外分光光度法

《中國藥典》2015年版收載的四環素類抗生素可采用了紅外分光光度法鑒別。方法是測定其吸收圖譜后，與藥品的標準圖譜進行對比，判斷其真偽。第四節四環素類抗生素的分析二、鑒別（七）薄層色譜法

薄層色譜法設備簡單、操作方便，中國藥典采用本法鑒別此類抗生素。如《中國藥典》2015年版規定鹽酸土霉素的鑒別應用此法。（八）高效液相色譜法

中國藥典采用高效液相色譜法作為四環素類的鑒別方法。方法是：在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。第四節四環素類抗生素的分析三、雜質檢查

（一）有關物質的檢查

鹽酸四環素類藥物中如含有降解產物及異構雜質將會影響藥品的質量，不僅可使抗菌活性降低，而且有些患者出現惡心、嘔吐、糖尿、酸中毒及蛋白尿等毒副反應。四環素中的雜質，如差向四環素、脫水四環素以及差向脫水四環素是引起臨床上毒性反應的主要物質。檢查方法：HPLC第四節四環素類抗生素的分析三、雜質檢查

（一）有關物質的檢查

鹽酸四環素類藥物中如含有降解產物及異構雜質將會影響藥品的質量，不僅可使抗菌活性降低，而且有些患者出現惡心、嘔吐、糖尿、酸中毒及蛋白尿等毒副反應。四環素中的雜質，如差向四環素、脫水四環素以及差向脫水四環素是引起臨床上毒性反應的主要物質。檢查方法：HPLC第四節四環素類抗生素的分析三、雜質檢查（二）雜質吸光度的檢查

四環素類抗生素的異構體、降解產物及差向脫水物越多，表現出顏色越深，并且吸光度也越大。各國藥典規定雜質吸光度的最大值以限制雜質的限量。鹽酸多西環素的吸光度檢查如下：取本品，精密稱定，加鹽酸溶液（9→100）的甲醇溶液(1→100）溶解并定量稀釋制成每1ml中含10mg的溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在490nm波長處測定，吸光度不得過0.12第四節四環素類抗生素的分析四、含量測定

《中國藥典》2015年版已全部采用高效液相色譜法測定其含量。鹽酸四環素Ch.P.（2015）填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相：醋酸銨溶液[0.15mol/L醋酸銨溶液-0.01mol/L的EDTA溶液-三乙胺（100:10:1）用醋酸調節pH至8.5]-乙腈（83:17）按外標法以峰面積計算第五節喹諾酮類藥物的分析概述喹諾酮類藥物是一類化學合成抗菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、使用安全、易于制造及不易產生耐藥性等優點臨床使用的喹諾酮類抗菌藥分為四代。分類代表藥物第一代萘啶酸第二代吡哌酸第三代諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星第四代加替沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、司帕沙星一、結構與性質（一）化學結構喹諾酮類藥物母核結構：4-喹諾酮-3-羧酸典型藥物（二）理化性質1.性狀：白色或微黃色至黃色結晶性粉末。2.酸堿兩性：酸性——羧基；堿性——氮原子。3.還原性：哌嗪基4.與金屬離子反應：易與金屬離子（鈣、鎂、鐵、鋅）形成螯合物。使用注意：不宜與含鈣或鐵的食物、藥物同服；長期使用注意鈣流失。（二）理化性質5.紫外吸收光譜特性分子結構中均有共軛體系，可用紫外分光光度法進行鑒別和含量測定。二、鑒別試驗（一）氟元素反應F-+茜素氟藍+Ce3+

藍紫色（二）紫外-可見分光光度法鑒別多種喹諾酮類藥物（三）紅外分光光度法標準圖譜對照法PH4.3二、鑒別試驗（四）薄層色譜法諾氟沙星的鑒別：取本品與諾氟沙星對照品適量，分別加三氯甲烷-甲醇（1:1）制成每1ml中含2.5mg的溶液，作為供試品溶液與對照溶液，照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨溶液（15:10:3）為展開劑，展開，晾干，置紫外燈（365nm）下檢視，供試品溶液所顯主斑點的位置與熒光應與對照品溶液主斑點的位置與熒光相同。（五）高效液相色譜法供試液主峰保留時間應與對照品主峰保留時間一致。三、雜質檢查（一）溶液澄清度檢查控制堿不溶性雜質的限量：喹諾酮類藥物在堿中易溶，而中間體等雜質不溶。（二）有關物質檢查多數喹諾酮類藥物均需做有關物質檢查。方法：HPLC法舉例：1.諾氟沙星中有關物質的檢查2.司帕沙星中有關物質檢查四、含量測定（一）非水溶液滴定法多利用喹諾酮類藥物的弱堿性，以冰醋酸為溶劑，高氯酸為滴定液進行滴定。吡哌酸的含量測定：取本品約0.2g，精密稱定，加冰醋酸20ml溶解后，加結晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.lmol/L）滴定至溶液顯純藍色，并將滴定的結果用空白試驗校正。每lml高氯酸滴定液（0.lmol/L）相當于30.33mgC14H17N5O3。（二）紫外-可見分光光度法喹諾酮類藥物分子結構中具有共軛體系，在紫外區具有特征性吸收，可利用吸收系數法或對照品比較法進行含量測定和溶出度測定。（三）高效液相色譜法《中國藥典》2015年版幾乎對所有喹諾酮類藥物采用HPLC測定其含量。第六節磺胺類藥物的分析概述磺胺類藥物是分子中具有對氨基苯磺酰胺的母核結構的衍生物。母體結構中磺酰胺基上的氫原子被取代后的衍生物，稱為N1取代物；對氨基上的氫被取代的衍生物稱為N4取代物。臨床上使用的主要是N1取代物。一、結構與性質（一）化學結構781.芳伯氨基：重氮化-偶合反應；芳醛縮合反應2.堿性、弱還原性3.可在堿性條件下與金屬離子形