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GDFSCodeofpracticeforinvitrocryopreservationofgermplasmresourcesofPinusI 2 2 3 4 5 6 7本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的本文件由廣東省林學會團體標準化技術委員會提出1濕地松種質資源離體超低溫保存技術規范本文件規定了濕地松（PinuselliottiiEngelm.）種質資源離體超低溫保存的儀器設備、基本程GB21551.4家用和類似用途電器的抗菌、除菌、凈化功能電冰箱的特殊GJB2253A氮氣和液氮安全應用3.1濕地松PinuselliottiiEngelm.3.23.34儀器設備24.3冰箱4,4程序降溫儀分儲運型和運輸型兩類，技術指標應符合GB/T5濕地松種質資源離體超低溫保存應遵循的操作流程見-16.2胚性愈傷組織的誘導于6月～7月采收濕地松未成熟球果，記錄采收球果母株的相關信息并編號（參）；6.3胚性無性系的建立3性愈傷團，待胚性愈傷團穩定增殖至大于500mg時，建立胚性無性6.4胚性無性系的增殖擴繁材料的擴繁以固體培養為優，具體操作為：選取已培養13±1d的胚性愈傷團新鮮生長的部得預培養混合物，優選的預培養液為液體增殖培養基附加0.4M在預培養混合物中分次緩慢滴加冷凍保護劑，充分混合后，置于冰上預處理1.5h，每10min搖晃液體一次，使其充分混合，優選的冷凍保護劑為7.5%7.2冷凍b)將凍存小管裝盒后置于程序降溫儀內，設定降溫程序為-0.33℃/min，起始溫度為0℃,目標溫度為-40℃,且在目標溫度保持30min以上。將經過程序降溫后的盒裝冷凍小管裝入液氮罐貯藏專用格件中，放入盛有液態氮（-196℃)的大每個胚性無性系應保存不同繼代次數的胚性細胞團至少2批次，每批次不少于10個凍存小管，通過初始生活力檢測后，該批次凍存小管入庫登記并長期保a)用于長期保存的液氮罐，應盡可能減少取放材7.3復蘇及利用4迅速取出凍存小管置于液氮中，待管內液氮揮發后，用37℃~40℃無菌溫水均勻浸泡凍存小管，將復水后的胚性愈傷團連同濾紙一起置于固體增殖培養基上進行恢復培將恢復生長的胚性愈傷團按上述6.4的方法進行擴繁后，轉移至成熟培養基上進行成熟培養；將成7,4生活力檢測），e)以相應的0.25g新鮮胚性愈傷團為取凍存材料，按7.3.1、7.3.2、7.3.3的步驟操作，記錄已恢復培養的板數，計算恢復生長的板數b)如抽檢結果顯示凍存材料已失去細胞活力，應事先提交申請，在數據庫中核對無誤并登記后，由專人進行提取操作，提取方法同75b)按入庫的先后順序，對采種母株進行編號，形成采種母株編號表（參見附錄Ac)來自同一采收母株的胚性無性系，按建系的先后順序進行編號；a)建立數據庫存儲種質資源的基本信息和超低溫保存的相關信息；b

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