.S0SY2.團 體 標 準A4化妝品舒緩功效測試角質形成細胞白介素8生成抑制法—s5發布 5實施浙江省健康產品化妝品行業協會 發布中 國 標 準 出 版 社 出版A4前 言本文件按照T0標準化工作導則 第1部分標準化文件的結構和起草規則的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由浙江省食品藥品檢驗研究院提出。本文件由浙江省健康產品化妝品行業協會歸口。本文件起草單位浙江省食品藥品檢驗研究院廣東博溪生物科技有限公司珀萊雅化妝品股份有限公司愛茉莉太平洋上海研發有限公司高浪控股股份有限公司。本文件主要起草人桑晶何立成盧永波馮瀟田超凡徐行行。ⅠA4化妝品舒緩功效測試角質形成細胞白介素8生成抑制法范圍本文件描述了化妝品舒緩功效的一種體外測試方法。本文件適用于可均勻分散在溶液中的化妝品及原料的舒緩功效的測試。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件僅該日期對應的版本適用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于本文件。2分析實驗室用水規格和試驗方法術語及定義下列術語和定義適用于本文件。

角質形成細胞e構成表皮基底層至角質層的主要細胞。88巨噬細胞和上皮細胞等分泌的細胞因子。注白介素是白細胞及其他特殊細胞產生并在這些細胞間發揮調節作用的細胞因子。注8是白介素的一種亞型。舒緩g有助于改善皮膚刺激等狀態的功效。試驗原理角質形成細胞白介素8生成抑制法以下簡稱本方法利用微生物引起角質形成細胞發生刺激反應的原理即通過脂多糖誘導角質形成細胞表面R跨膜受體激活B炎癥信號傳導通路從而下游釋放系列炎癥因子如8等引發皮膚出現紅斑瘙癢等癥狀的過程。通過計算受試物抑制8釋放的水平來反應受試物的舒緩功效。試劑和材料除非另有說明本方法所用試劑均為分析純水為2規定的三級水。1A4細胞原代人源角質形成細胞0代以內或人永生化表皮角質形成細胞株如。與角質形成細胞相適應的培養基及血清。A溶液。磷酸鹽緩沖液H。水符合2規定的三級水。脂多糖純度9用水配成5L儲備液使用終濃度為L的溶液。聚肌胞苷酸純度0用水配成0L儲備液使用終濃度為L的溶液。噻唑藍純度8臨用新配成5L的T溶液。二甲基亞砜。人8A檢測試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法或其他8檢測試劑。陽性對照物地塞米松純度8用二甲基亞砜配成0L儲備液使用終濃度為L的溶液。陰性對照組分別加入聚肌胞苷酸和脂多糖于培養基中聚肌胞苷酸的終濃度為脂多糖的終濃度為作為陰性對照溶液。陽性對照組聚肌胞苷酸和脂多糖誘導液處理h后再加入終濃度為L地塞米松溶液。空白對照組不加聚肌胞苷酸和脂多糖誘導的培養基其余操作與陰性對照組一致。儀器天平分度值為。二氧化碳培養箱7℃1℃2體積分數范圍內)相對濕度5。可調節移液器最大量程為。超凈工作臺。水平低速離心機轉速大于或等于。倒置顯微鏡放大倍數至少為0或以上。細胞培養板振蕩器。酶標儀。試驗步驟實驗前準備受試物準備受試物制備需要滿足以下條件:水溶性受試物直接采用培養基作為溶劑水難溶的受試物采用二甲基亞砜作為溶劑;使用渦旋混合超聲處理或加熱等方法輔助溶解配成溶液或均勻混懸液;無法配成溶液或均勻混懸液的受試物不適用于本試驗;受試物應臨用新配。2刺激物準備

A4分別加入聚肌胞苷酸和脂多糖于細胞培養基中聚肌胞苷酸的終濃度為脂多糖的終濃度為誘導劑量可根據不同實驗室細胞特性適當進行調整。預試驗細胞毒性試驗)細胞接種選用生長良好的角質形成細胞以55L的細胞懸液接種每孔0L接種到6孔板中。培養箱中培養細胞融合度應在00時進行試驗。分組加樣受試物以原液作為最高劑量2倍稀釋多個濃度至幾乎無毒性用于預試驗細胞毒性篩選。預試驗設受試物組和陰性對照組每組至少3個復孔。先吸去6孔板中的培養液分別加入受試物組溶液和陰性對照組溶液。每孔加樣量均為再放入二氧化碳培養箱中培養。細胞存活率測定和計算以T法為例細胞培養h后每孔加入5L的T溶液于培養箱中培養45。孵育結束后吸取T溶液每孔加入L將6孔板放置于振蕩器上避光振搖0。酶標儀m處讀取吸光度值D值。計算細胞存活率計算各組平均吸光度值并用平均吸光度值來計算各受試物組細胞存活率見公式。陰性對照組平均吸光度值細胞存活率=受試物組平均吸光度值0 1)陰性對照組平均吸光度值正式試驗試驗濃度選擇選擇細胞存活率達到0左右的濃度作為起始濃度下設1個3個濃度作為正式試驗的濃度。具體濃度選擇可根據試驗情況做出適當調整。細胞接種選用生長良好的角質形成細胞以55L的細胞懸液接種每孔1L到4孔板中培養。加樣正式試驗設受試物組陰性對照組陽性對照組和空白對照組每組至少3個復孔。棄去培養板中的培養液受試物組和陰性對照組分別加入受試物組溶液和陰性對照組溶液陽性對照組先加誘導液處理4h后再加入陽性對照液空白對照組加入細胞培養液。每孔加樣量為1。加樣后放回培養箱中培養。3A4細胞上清收集培養結束后分別收集每孔細胞的上清液于5L離心管中放入0℃超低溫冰箱冷凍保存。8檢測和計算對每組上清液進行8含量測定。具體根據A檢測試劑盒或其他檢測試劑盒操作說明進行。以8A檢測為例以標準品的濃度為縱坐標m處吸光度值為橫坐標繪制標準曲線得出回歸方程式。將每孔測定的m吸光度值代入標準曲線中計算每孔上清液8含量。8抑制率計算:= - 0 …………(T計算每組= - 0 …………(T式中:

C抑制率 C T受試物組或陽性對照組8含量均值;C陰性對照組8含量均值。統計分析比較各受試物組陽性對照組與空白對照組8含量采用方差檢驗進行統計學分析p5表明統計學上有顯著性差異。結果判定試驗成立的條件試驗系統有效每次試驗均須設置陰性對照組陽性對照組以及空白對照組。陰性對照組相較空白對照組8的含量顯著性增加具有統計學差異p則試驗模型有效。陽性對照組相較陰性對照組8含量顯著性降低具有統計學差異p則試驗系統有效。試驗平行性有效每次試驗各組平行孔間吸光度的變異系數V值0則數據有效。每次試驗至少要重復1次結果一致則該試驗有效。結果判定受試物組與陰性對照組相比8的含量下降且具有顯著性差異p<說明受試物在該劑量下有抑制8含量的作用。受試物任何一個劑量條件下呈現顯著的抑制作用并有可重復性則該受試物判定為有舒緩功效。評價結果為無舒緩功效則需用結合其他試驗方法進一步確認。試驗報告4試驗報告至少應