畜禽養殖過程細菌耐藥性監測技術規范2019-06-14發布2019-07-01實施上海市市場監督管理局發布I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由上海市農業農村委員會提出并組織實施。本標準由上海市畜牧標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：上海市動物疫病預防控制中心。1本標準規定了畜禽養殖過程細菌耐藥性監測的設備和材料、試劑和培養基、操作步驟、結果觀察和記錄、質量控制和結果判定、菌種保存及生物安全措施的技術要求。本標準適用于畜禽源性細菌(大腸埃希菌、沙門菌屬細菌、腸球菌屬細菌和金黃色葡萄球菌)分離、鑒定及常見抗菌藥物敏感性試驗(微量肉湯稀釋法)。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求CLSIM100抗菌藥物敏感性試驗執行標準(PerformanceStandardsforAntimicrobialSuscepti-3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。抗菌藥物敏感性試驗antimicrobialsusceptibilitytesting用于測試抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制或殺滅作用的試驗。藥敏試驗的結果通常用最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)表示，即體外能夠抑制細菌生長的最低藥物濃度。微量肉湯稀釋法brothmicrodilutionmethod定量檢測某一抗菌藥物對動物源性細菌的體外抑菌活性的一種標準方法。在藥敏測試板上設有一系列倍比稀釋濃度的抗菌藥物，通過加入待檢細菌的菌懸液，經一定時間的孵育后對藥敏板條進行讀數，經數據分析得到MIC值。根據美國臨床試驗室標準化委員會(CLSI)的相應標準獲得待檢菌對某種抗菌藥物敏感(S)、中介(I)或耐藥(R)的結果。使用推薦劑量時，菌株可被通常達到的抗微生物藥物濃度水平所抑制。分離菌株的MIC接近于抗微生物藥物在血液和組織中可達到的水平，對藥物治療的反應率可能低于敏感菌株。按常規給藥計劃通常可達到的藥物濃度不能抑制其生長的菌株，和(或)證實其MIC值落在可能存在微生物特殊耐藥機制的范圍內，且治療研究顯示該藥物臨床療效不可靠。2折點breakpoint用以區分菌株敏感、中介還是耐藥的最低抑菌濃度或抑菌圈直徑。4設備和材料除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料見附錄A中A.1。5試劑和培養基無菌0.85%氯化鈉溶液制備方法見A.2。抗菌藥物種類及貯備液和工作液的制備與保存見A.3。本標準采用的培養基如下：—營養瓊脂培養基，制備見B.2;—大腸埃希菌顯色培養基(麥康凱瓊脂培養基),制備見B.3; 沙門氏菌顯色培養基(膽硫乳瓊脂培養基),制備見B.6。——腸球菌顯色培養基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養基),制備見B.7。—-7.5%氯化鈉肉湯，制備見B.8。 金黃色葡萄球菌顯色培養基(Baird-Parker瓊脂培養基),制備見B.9。——Mueller-Hinton肉湯(M-H肉湯),制備見B.10。本標準中常用的質控菌株如下：——大腸埃希菌(Escherichiacoli,ATCC25922); 沙門氏菌(Salmonella,ATC——糞腸球菌(Enterococcusfaecal 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC29213)。質控菌株使用的代次應為3代~5代，-60℃以下超低溫冰箱保存。6操作步驟滅菌棉拭子一端插入家畜肛門或家禽泄殖腔1.5cm~2.0cm,旋轉2圈~3圈，沾上糞便后，將棉3拭子置于10mL運送培養基中。將儲奶罐中的生鮮乳攪拌均勻，使用無菌采樣管采集生鮮乳100mL。樣品采集時應填寫采樣登記表，參見附錄C。6.2樣品保存與運送采集的樣品于0℃~4℃保存，并使用密封保溫容器運送。糞便拭子保存時間不超過48h,生鮮乳樣品保存時間不超過24h。6.3細菌分離與鑒定不同細菌的分離鑒定按下述方法進行：——沙門氏菌屬細菌分離與鑒定見D.2;——腸球菌屬細菌分離與鑒定見D.3;——金黃色葡萄球菌分離與鑒定見D.4。6.4藥敏試驗當藥敏試驗使用商品化試劑盒時，參照試劑盒說明書進行操作。當藥敏試驗使用自配藥敏板時，按照6.4.2～6.4.6進行操作。將質控菌株和測試菌株分別轉種于營養瓊脂培養基，36℃±1℃培養18h~24h以得到單個純6.4.396孔藥敏板準備將抗菌藥物貯備液用無菌0.85%氯化鈉溶液或M-H肉湯按附錄A稀釋至工作濃度，使用同樣稀釋液按倍比稀釋法進一步稀釋至一系列所需濃度，然后按順序加入無菌孔板中，每孔50μL。分別設陰性和陽性對照孔。無菌棉簽用生理鹽水潤濕后，挑取培養18h~24h的純菌落3個~5個，轉移至含2mL~3mL無菌0.85%氯化鈉溶液或M-H肉湯的試管中混勻，用濁度儀或標準比濁管校正菌液濃度至0.5麥氏單位(細菌含量約為1×10?CFU/mL~2×10?CFU/mL),將調節至0.5麥氏單位的菌液用M-H肉湯稀釋100倍，混勻備用，調制好濃度的菌液應在15min內完成加樣。陰性對照孔中加入無菌M-H肉湯100μL,陽性對照孔中加入制備好的菌液(用前混勻)100μL,其余孔分別加入制備菌液50μL,蓋上無菌蓋并標記菌株編號。4將接種完畢的96孔藥敏板置于36℃±1℃恒溫培養箱中，孵育16h~20h。7結果觀察和記錄7.1藥敏板判讀方法自培養箱中取出藥敏板，置于襯有黑底板的光線下用肉眼觀察結果。如果無法辨別孔中是否有細菌生長時可使用觀察裝置幫助進行結果的判讀。在無菌生長的孔內所含最低抗菌藥物溶液的濃度如藥敏板上陰性對照孔內無細菌生長，液體未見渾濁；陽性對照孔內有敏板結果有效，可繼續判讀菌株MIC。如陰性孔或陽性孔異常，則該藥敏板結果無效。7.2.2質控菌株符合性判斷如藥敏板結果有效，且質控菌株MIC在規定范圍內，則本次試驗結果有效，可繼續判讀樣品藥敏結果。如質控菌株MIC不在規定范圍內，則本次試驗結果無效。先進行試驗結果有效性判斷，在試驗結果有效的前提下，繼續判讀樣品MIC,判讀完成后進行8質量控制和結果判定每次藥敏試驗均應采用合適的質控菌株進行質量控制，質控菌株藥敏結果應符合規定范圍質控菌株的實驗結果符合規定的前提下，按照附錄F中F1~F.3標準判定測試菌株的敏感性-—敏感(S)、中介(I)或耐藥(R)。對于只給出敏感判斷標準的藥物，只報告其是否敏感即可。9菌種保存及生物安全措施實驗分離的菌株應由具備相關資質的實驗室妥善保存。實驗過程及廢棄物處理應嚴格按照GB19489中的規定執行。5——冰箱：0℃~4℃和-60℃以下；A.2光菌0.85%氯化鈉溶液稱取0.85g氯化鈉溶于100mL蒸餾水中，115℃滅菌30min。成1000μg/mL(或最高測試濃度的10倍)的貯備液，6表A.1抗菌藥物濃度范圍稀釋濃度范圍/(μg/mL)稀釋濃度范圍/(μg/mL)阿莫西林阿莫西林恩諾沙星四環素頭孢他定恩諾沙星甲氧芐啶甲氧芐啶多西環素替米考星乙酰甲喹7(資料性附錄)培養基B.1運送培養基運輸培養基成分見表B.1。表B.1運輸培養基成分氯化鈉磷酸二氫鈉(Na?HPO·12H?O)氯化鈣0.1g稱取表B.1中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調節pH至8.4±0.1,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。B.2營養瓊脂培養基營養瓊脂培養基成分見表B.2。表B.2營養瓊脂培養基成分蛋白胨牛肉浸膏氯化鈉稱取表B.2中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，調節pH至7.2±0.2,121℃高壓滅菌15min,冷至50℃,搖勻后傾注平板。8B.3大腸埃希菌顯色培養基(麥康凱瓊脂培養基)B.3.1成分麥康凱瓊脂培養基成分見表B.3。表B.3麥康凱瓊脂培養基成分明膠胰酶水解物胨(或酪蛋白)中性紅結晶紫稱取表B.3中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調節pH至7.1±0.2,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。緩沖蛋白胨水成分見表B.4。表B.4緩沖蛋白胨水成分蛋白胨氯化鈉磷酸二氫鈉(Na?HPO?·12H?O)磷酸二氫鉀(KH?PO?)稱取表B.4中各成分溶于1000mL蒸餾水中，調節pH至7.2±0.2,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。9B.5氯化鎂-孔雀綠增菌液B.5.1溶液AB.5.1.1成分溶液A成分見表B.5。表B.5溶液A成分氯化鈉磷酸二氫鉀稱取表B.5中各成分加入1000mL蒸餾水中，調節pH至7.0,加熱至70℃溶解。此溶液使用前在4℃冰箱儲存不超過24h。B.5.2溶液BB.5.2.1成分溶液B成分見表B.6。表B.6溶液B成分氯化鎂(MgCl?·6H?O)按照表B.6用量將MgCl?·6H?O溶于1000mL蒸餾水中。B,5.3溶液CB.5.3.1成分溶液C成分見表B.7。表B.7溶液C成分按照表B.7將孔雀綠溶于100mL蒸餾水中。溶液可室溫保存于棕色玻璃瓶中。完全培養基成分見表B.8。表B.8完全培養基成分溶液B溶液C按表B.8比例配制，調節pH,使滅菌后pH為5.2,分裝于試管中，每管10mL。115℃高壓滅菌B.6沙門氏菌顯色培養基(膽硫乳瓊脂培養基)B.6.1成分膽硫乳瓊脂培養基成分見表B.9。表B.9膽硫乳瓊脂培養基成分蛋白胨牛肉浸膏去氧膽酸鈉中性紅稱取表B.9中除中性紅和瓊脂以外各成分溶于400mL蒸餾水中，調節pH至7.3±0.2,再將瓊脂于600mL蒸餾水中煮沸至完全溶解，兩液合并，加入0.5%中性紅溶液6mL,待冷至50℃,搖勻后傾B.7腸球菌顯色培養基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養基)膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養基成分見表B.10。表B.10膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養基成分牛肉浸膏酵母浸膏牛膽粉氯化鈉疊氮化鈉稱取表B.10中各成分溶于1000mL蒸餾水中，調節pH至7.1±0.2,121℃高壓滅菌15min,于45℃~50℃保溫培養基，從保溫開始至傾注平板的時間不應超過4h。B.87.5%氯化鈉肉湯B.8.1成分7.5%氯化鈉肉湯成分見表B.11。蛋白胨牛肉浸粉氯化鈉稱取表B.11中各成分加熱溶于1000mL蒸餾水中，調節pH至7.4±0.1,分裝于三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。B.9金黃色葡萄球菌顯色培養基(Baird-Parker瓊脂培養基)Baird-Parker瓊脂培養基成分見表B.12。表B.12Baird-Parker瓊脂培養基成分牛肉音酵母膏丙酮酸鈉氯化鋰(LiCl·6H?O)B.9.2增菌劑30%卵黃鹽水50mL與通過0.22μm孔徑濾膜進行過濾除菌的1%的亞碲酸鉀10mL混合，4℃冰箱保存。稱取表B.12中各成分至1000mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調節pH至7.0±0.2,分裝每瓶95mL,121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱融化瓊脂，冷至50℃,每95mL加入預熱至50℃的卵黃亞硒酸鉀增菌劑5mL搖勻后傾注平板。培養基應是致密不透明的。使用前在4℃冰箱儲存不應超過48h。B.10Mueller-Hinton肉湯(M-H肉湯)B.10.1成分M-H肉湯的成分見表B.13。牛肉浸出粉酪蛋白水解物B.10.2制法稱取表B.13各成分加入蒸餾水1000mL,攪拌加熱煮沸至完全溶解，調節pH至7.4±0.2,分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min,定量(等體積)分裝于滅菌試管中。(資料性附錄)采樣登記表畜禽養殖抗菌藥物使用情況采樣登記表見表C.1。表C.1畜禽養殖抗菌藥物使用情況采樣登記表采樣時間姓名電話口注射口飲水口拌料□注射□飲水口拌料□注射□飲水□拌料(資料性附錄)D.1大腸埃希菌分離與鑒定棉拭子接種于大腸埃希菌顯色培養基，36℃±1℃培養18h~24h,挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，顯色培養基上純化一代，純化后可疑菌落接種于營養瓊脂培養基純化一代。對已純化的菌落，使用微生物生化鑒定系統或生化試條進行生化鑒定。大腸埃希菌分離與鑒定流程圖見圖D.1。動物肛門或泄殖腔拭子動物肛門或泄殖腔拭子運送培養基接種于大腸埃希菌顯色培養基，36℃±1℃,培養18h~24h挑取大腸埃希菌可疑菌落純化生化鑒定大腸埃希菌圖D.1大腸埃希菌分離與鑒定流程圖D.2沙門氏菌屬細菌分離與鑒定棉拭子置于緩沖蛋白胨水中，36℃±1℃培養18h~24h,取100μL預增菌液置于10mL氯化鎂-孔雀綠培養基中，42℃±1℃培養22h~24h,隨后將增菌液混勻，接種于沙門氏菌顯色培養基，42℃±1℃培養22h~24h,挑取沙門氏菌顯色培養基上無色半透明或粉紅色，菌落中心黑色或幾乎全黑色的可疑菌落，接種至營養瓊脂培養基純化一代。對已純化的菌落，應使用微生物生化鑒定系統或生化試條進行生化鑒定。沙門氏菌屬細菌分離與鑒定流程圖見圖D.2。或者通過附錄E的方法進行分子生物學運送培養基緩沖蛋白胨水預增菌，36℃±1℃,培養18h~24h接種氯化鎂-孔雀綠增菌液，42℃±1℃,培養22h~24h生化鑒定PCR鑒定圖D.2沙門氏菌屬細菌分離與鑒定流程圖D.3腸球菌屬細菌分離與鑒定棉拭子接種于腸球菌顯色培養基，36℃±1℃培養18h~24h,挑取褐色可疑菌落，顯色培養基上純化一代，純化后可疑菌落接種至營養瓊脂培養基純化一代。對于已純化的菌落，使用微生物生化鑒定系統或生化試條進行生化鑒定。腸球菌屬細菌分離與鑒定流程圖見圖D.3。接種于腸球菌顯色培養基，36℃±1℃,培養18h~24h生化鑒定圖D.3腸球菌屬細菌分離與鑒定流程圖取1mL生鮮乳樣品至9mL7.5%氯化鈉肉湯中，振蕩混勻后36℃±1℃培養18h~24h,將培養物劃線接種到金黃色葡萄球菌顯色培養基上，36C±1℃培養24h~48h,挑取灰黑色至黑色可疑菌落接種至營養瓊脂培養基純化一代。對于已純化的菌落，使用微生物生化鑒定系統或者生化試條進行生化鑒定。金黃色葡萄球菌分離與鑒定流程圖見圖D.4。金黃色葡萄球菌圖D.4金黃色葡萄球菌分離與鑒定流程圖(資料性附錄)沙門氏菌屬細菌PCR鑒定E.1InvA基因引物上游為5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'下游為5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'E.2陽性菌株鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)CVCC541,或其他等效標準菌株。E.35×TBE緩沖液5×TBE緩沖液成分見表E.1。表E.15×TBE緩沖液成分乙二酸四乙酸二鈉E.450×TAE緩沖液50×TAE緩沖液的成分見表E.2。表E.250×TAE緩沖液成分E.5PCR法鑒定E.5.1PCR模板的制備用接種環從營養瓊脂培養基上挑選16h～24h的純培養物，置于0.5mL滅菌生理鹽水中，12000r/min離心2min,棄上清液。再加0.5mL滅菌蒸餾水，懸浮并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷卻后以12000r/min離心2min,取上清液為PCR模板。陰性對照模板為滅菌蒸餾水，陽性對照模板由陽性菌株根據上述方法提取獲得。E,5.2PCR反應體系的配制根據不同廠家PCR試劑用量，配制PCR反應體系，擴增片段長度為284bp。E.5.3PCR反應條件95℃預變性5min,94℃變性30s,64℃退火30s,72℃延伸30s,30個循環，最后72℃延伸10min,設立陰性對照和陽性對照，按同方法擴增稱取1.2g瓊脂糖，加人100mL0.5×TBE(或1×TAE)緩沖液中，加入核酸染料，依據樣品數選用適宜的梳子，瓊脂糖溶解后混勻倒人在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子，取出膠塊放入電泳槽中，加0.5×TBE(或1×TAE)緩沖液淹沒膠面，E.5.4.2加樣取10μLPCR擴增產物和3μL上樣緩沖液混勻后加入加樣孔。E.5.4.3電泳條件電壓110V,電泳時間30min。電泳結束后，取出膠塊置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進行成像分析。如果某一待檢樣品擴增產物的條帶與沙門氏菌陽性對照的條帶在一條直線上，即條帶與加樣孔的距離相同，而陰性對照無此條帶，則該樣品分離到的菌株可初步判定為沙門氏菌，必要時可通過測序來進一步確證。