一、引言1.1研究背景與意義隨著全球啤酒產業的持續擴張，啤酒糟作為主要副產品，產量呈現出顯著增長的趨勢。據統計，每生產1噸啤酒，大約會產生0.2-0.3噸的啤酒糟。濕啤酒糟作為啤酒釀造過程中的直接產物，含有豐富的蛋白質、纖維、礦物質以及多種維生素，具有較高的營養價值，在反芻動物生產中具有廣闊的應用前景。然而，濕啤酒糟水分含量通常高達70%-80%，這種高水分環境為微生物的滋生和繁殖提供了極為有利的條件。在適宜的溫度和濕度下，微生物迅速生長，導致濕啤酒糟極易酸敗變質，產生大量的有機酸、多種雜醇及毒素等有害物質。這不僅會使濕啤酒糟的營養價值大幅降低，還會嚴重影響家畜的飼喂效果，甚至可能對家畜的健康造成威脅。此外，啤酒糟的生產具有明顯的季節性，這使得在非生產季節，泌乳牛等家畜難以獲得營養價值較高的鮮啤酒糟，進一步限制了其在飼料領域的廣泛應用。為了解決濕啤酒糟易變質的問題，延長其保存期限，提高其利用價值，尋找有效的保鮮貯存方法成為當務之急。在眾多的解決方案中，使用防腐劑是一種較為常見且有效的手段。甲酸鈉和丙酸鈣作為兩種重要的有機酸鹽類防腐劑，在飼料保鮮領域展現出了獨特的優勢。甲酸鈉作為一種具有良好抑菌性能的有機酸鹽，其作用機制主要體現在對微生物細胞的干擾上。它能夠改變微生物細胞膜的通透性，使得細胞內的物質外流，破壞細胞的正常生理功能，從而抑制微生物的生長和繁殖。同時，甲酸鈉還可以通過影響微生物的代謝途徑，干擾其能量產生和物質合成過程，進一步削弱微生物的生存能力。丙酸鈣同樣具有出色的防霉保鮮效果，它對霉菌、革蘭氏陰性桿菌、黃曲霉素和好氧芽孢桿菌等多種有害微生物具有顯著的抑制作用。丙酸鈣的抑菌原理主要是通過在酸性環境中釋放出丙酸分子，丙酸分子能夠穿透微生物的細胞膜，進入細胞內部，干擾細胞的代謝活動，從而達到抑制微生物生長的目的。此外，丙酸鈣還可以調節飼料的pH值，創造一個不利于微生物生長的酸性環境，進一步增強其防腐效果。甲酸鈉和丙酸鈣作為飼料防腐劑，在國內外都有一定的應用研究。在國外，一些研究已經證實了它們在青貯飼料和全混合日糧（TMR）中的有效性。例如，在青貯飼料中添加丙酸鈣，可以顯著降低青貯飼料的pH值，抑制有害微生物的生長，提高青貯飼料的品質和保存期限。在國內，隨著飼料行業對防腐劑需求的增加，對甲酸鈉和丙酸鈣的研究也逐漸增多。一些研究表明，在濕啤酒糟中添加適量的甲酸鈉或丙酸鈣，能夠有效抑制微生物的生長，延緩濕啤酒糟的變質速度，提高其營養價值和適口性。然而，目前對于甲酸鈉和丙酸鈣在濕啤酒糟保存中的應用研究還相對較少，尤其是在不同添加量、不同保存條件下對濕啤酒糟發酵參數、化學成分、瘤胃降解參數以及微生物區系的影響方面，還存在許多未知的領域，需要進一步深入研究。本研究旨在系統地探討甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟保存效果的影響，通過分析不同處理組濕啤酒糟的發酵參數、化學成分、瘤胃降解參數以及微生物區系的變化，明確甲酸鈉和丙酸鈣在濕啤酒糟保存中的最佳添加量和作用機制。這不僅有助于解決濕啤酒糟因水分高易變質而影響應用的問題，為濕啤酒糟的保鮮貯存提供科學依據和技術支持，還能夠拓展甲酸鈉和丙酸鈣在飼料領域的應用范圍，為飼料行業的發展提供新的思路和方法。同時，本研究的成果對于提高飼料資源的利用率，降低飼料成本，促進畜牧業的可持續發展具有重要的現實意義。1.2國內外研究現狀在濕啤酒糟保存方面，國內外學者進行了多方面的探索。國外對啤酒糟的綜合利用較為重視，已廣泛應用于飼料、醫藥、食品等工業，在飼料領域，以富含蛋白質的鮮啤酒糟作為奶牛飼料蛋白源已有成功先例，像啤酒糟、干燒酒糟等釀造業副產品，在美國奶牛混合精料中占比達20％。但在啤酒糟微貯方面報道較少，僅有Ezeonu,F.C.曾報道厭氧發酵的啤酒糟纖維素和木質素降解率分別接近60％和40％。國內啤酒糟綜合利用起步較晚，起初主要直接用作農家飼料，用量有限、利用率低。近年來雖加大了資金投入和科研力度，取得一定進展，啤酒糟作飼料成為釀酒企業和飼料工業關注熱點，但在單獨較長時間微貯啤酒糟方面報道不多，未能徹底解決鮮啤酒糟防腐和長期供應問題。關于甲酸鈉在飼料保鮮中的應用，國外研究發現其在青貯飼料和TMR中有一定效果，它能通過改變微生物細胞膜通透性、干擾代謝途徑等方式抑制微生物生長繁殖。國內對甲酸鈉在濕啤酒糟保存中的研究較少，其在濕啤酒糟中的最佳添加量、對不同微生物的抑制效果以及對濕啤酒糟營養價值和瘤胃降解參數的影響等方面缺乏系統研究。丙酸鈣作為飼料防腐劑，國外已證實其在青貯飼料中能顯著降低pH值，抑制有害微生物生長，提高青貯飼料品質和保存期限。國內研究表明，丙酸鈣對霉菌、革蘭氏陰性桿菌、黃曲霉素和好氧芽孢桿菌等多種有害微生物有顯著抑制作用，但在濕啤酒糟保存中，不同添加量丙酸鈣對濕啤酒糟發酵品質、化學成分動態變化以及微生物區系演替規律等方面的研究還不夠深入。整體來看，目前對于甲酸鈉和丙酸鈣在濕啤酒糟保存中的應用研究存在諸多不足。在不同添加量下，二者對濕啤酒糟發酵參數、化學成分的影響缺乏全面系統的分析；在瘤胃降解參數方面，對干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維等在瘤胃內降解特性的研究不夠深入；在微生物區系方面，對添加甲酸鈉和丙酸鈣后濕啤酒糟微生物群落多樣性、菌群結構和功能變化的研究還較為匱乏。1.3研究目的與內容本研究旨在深入探究甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟保存效果的影響，通過全面分析不同處理組濕啤酒糟的發酵參數、化學成分、瘤胃降解參數以及微生物區系的變化，對比甲酸鈉和丙酸鈣在濕啤酒糟保存中的作用效果，明確其最佳添加量，為濕啤酒糟的有效保存和合理利用提供科學依據。具體研究內容如下：甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟發酵參數的影響：通過設置不同添加量的甲酸鈉和丙酸鈣處理組，在特定的保存條件下，定期測定濕啤酒糟的pH值、揮發性脂肪酸含量（如乙酸、丙酸、丁酸等）、氨態氮含量等發酵參數。分析不同處理組發酵參數隨時間的變化規律，對比甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟發酵過程的影響差異，明確二者在調控濕啤酒糟發酵品質方面的作用效果。甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟化學成分的影響：對添加甲酸鈉和丙酸鈣后的濕啤酒糟進行化學成分分析，包括干物質、粗蛋白、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、灰分等常規成分的測定，以及鈣、磷、鐵、鋅等礦物質元素和維生素含量的分析。研究不同處理組濕啤酒糟在保存過程中化學成分的動態變化，探討甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟營養價值的影響機制。甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟瘤胃降解參數的影響：采用尼龍袋法或體外產氣法等瘤胃降解試驗方法，測定添加甲酸鈉和丙酸鈣的濕啤酒糟在瘤胃內的干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維等成分的降解率、降解速度和有效降解率等參數。分析不同處理組濕啤酒糟瘤胃降解參數的差異，評估甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟在反芻動物瘤胃內消化利用效率的影響。甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟微生物區系的影響：運用高通量測序技術，對添加甲酸鈉和丙酸鈣前后濕啤酒糟的微生物群落進行測序分析，測定微生物群落的多樣性、豐富度以及菌群結構組成。研究不同處理組濕啤酒糟在保存過程中微生物區系的動態變化，探討甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟微生物群落的影響機制，以及微生物群落變化與濕啤酒糟保存效果之間的關系。二、相關理論基礎2.1濕啤酒糟概述濕啤酒糟作為啤酒釀造產業的主要副產品，來源廣泛且產量巨大。在啤酒釀造過程中，以大麥、小麥等谷物為原料，經過糖化、發酵等一系列工藝后，剩余的固體殘渣便是濕啤酒糟。據統計，每生產1噸啤酒，大約會產生0.2-0.3噸的濕啤酒糟。隨著全球啤酒產業的持續擴張，濕啤酒糟的產量也在逐年遞增。濕啤酒糟富含多種營養成分，具有較高的營養價值。其蛋白質含量豐富，一般在22%-27%之間，且氨基酸組成較為平衡，其中賴氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸含量雖相對較低，但仍能為動物提供一定的蛋白質來源。此外，濕啤酒糟中還含有大量的膳食纖維，其含量可達15%左右，這些膳食纖維有助于促進動物腸道蠕動，維持腸道健康。同時，濕啤酒糟中礦物質、維生素含量也較為豐富，如鈣、磷、鐵、鋅等礦物質元素以及維生素B族等，這些營養成分對于動物的生長發育和新陳代謝具有重要作用。另外，粗脂肪含量在5%-8%之間，其中亞油酸占50%以上，亞油酸作為一種必需脂肪酸，對動物的生長和繁殖具有重要意義。在反芻動物飼料中，濕啤酒糟具有獨特的應用價值。一方面，濕啤酒糟的適口性良好，反芻動物喜歡采食，能夠提高動物的采食量。另一方面，濕啤酒糟中過瘤胃蛋白質含量較高，這使得其在反芻動物瘤胃內能夠被有效利用，為反芻動物提供持續的蛋白質供應，有助于提高反芻動物的生產性能。例如，在肉牛飼料中，濕啤酒糟可取代全部大豆餅粕作為蛋白源使用，不僅能滿足肉牛對蛋白質的需求，還可改善胴體品質，使牛肉的脂肪分布更加均勻，肉質更加鮮嫩。在奶牛養殖中，適量飼喂濕啤酒糟可以提高奶牛的產奶量和牛奶品質。然而，由于濕啤酒糟水分含量高，極易受到微生物污染而酸敗變質，這在很大程度上限制了其在反芻動物飼料中的廣泛應用。因此，尋找有效的保存方法，延長濕啤酒糟的保存期限，成為充分發揮其在反芻動物飼料中應用價值的關鍵。2.2有機酸鹽防腐原理2.2.1甲酸鈉防腐機制甲酸鈉作為一種有機酸鹽類防腐劑，其防腐作用主要通過以下幾個方面實現。首先，甲酸鈉在溶液中能夠發生水解反應，產生一定量的甲酸和氫氧根離子，從而降低溶液的pH值。較低的pH值環境會對微生物的生存和繁殖產生不利影響，因為大多數微生物適宜在中性或接近中性的環境中生長。當環境pH值偏離微生物的適宜范圍時，微生物細胞內的許多酶的活性會受到抑制，導致細胞的代謝過程紊亂，進而影響微生物的生長和繁殖能力。例如，某些細菌的細胞壁合成酶在酸性環境下活性降低，使得細菌無法正常合成細胞壁，從而限制了細菌的分裂和生長。其次，甲酸鈉可以干擾微生物的細胞膜功能。甲酸鈉中的甲酸根離子具有一定的親脂性，能夠穿透微生物的細胞膜，進入細胞內部。一旦進入細胞內，甲酸根離子會與細胞內的一些關鍵物質結合，改變細胞膜的通透性。細胞膜通透性的改變會導致細胞內的營養物質外流，同時阻止外界營養物質的正常攝入，使微生物細胞因缺乏必要的營養而無法正常生長和繁殖。此外，細胞膜功能的異常還可能影響細胞內的信號傳遞和能量代謝過程，進一步削弱微生物的生存能力。甲酸鈉還能夠抑制微生物的酶活性。微生物的生長和代謝過程依賴于一系列酶的催化作用，如參與能量代謝的酶、合成蛋白質和核酸的酶等。甲酸鈉可以與這些酶的活性中心或其他關鍵部位結合，使酶的空間結構發生改變，從而失去活性。例如，甲酸鈉能夠抑制微生物細胞內的琥珀酸脫氫酶的活性，該酶是三羧酸循環中的關鍵酶之一，其活性受到抑制會導致微生物的能量代謝受阻，無法產生足夠的能量來維持生命活動，最終抑制微生物的生長和繁殖。2.2.2丙酸鈣防腐機制丙酸鈣的防腐機制較為復雜，主要通過以下幾種方式發揮作用。首先，丙酸鈣在酸性環境中能夠解離出丙酸分子和鈣離子。丙酸分子具有較強的抑菌能力，它可以在霉菌細胞周圍形成高滲透壓環境。當霉菌細胞處于高滲透壓環境中時，細胞內的水分會被吸出，導致細胞脫水。細胞脫水會使細胞內的各種生理生化反應無法正常進行，從而抑制霉菌的生長和繁殖。例如，細胞脫水會導致酶分子的空間結構發生改變，使其活性降低或喪失，進而影響細胞的代謝過程。其次，丙酸鈣解離出的H?能夠穿透霉菌細胞壁，進入細胞內部。在細胞內，H?會干擾細胞內的酸堿平衡，抑制胞內酶的活性。許多酶的活性對細胞內的酸堿度非常敏感，當細胞內pH值發生變化時，酶的活性會受到顯著影響。例如，一些參與蛋白質合成和代謝的酶在酸性環境下活性降低，使得霉菌無法正常合成蛋白質和進行其他必要的代謝活動，從而阻礙霉菌的繁殖。丙酸鈣還可以調節飼料的pH值，創造一個不利于微生物生長的酸性環境。大多數有害微生物適宜在中性或微堿性環境中生長，當環境pH值降低到一定程度時，它們的生長會受到抑制。丙酸鈣在飼料中解離產生的丙酸和H?會使飼料的pH值下降，從而抑制有害微生物的生長。例如，在濕啤酒糟中添加丙酸鈣后，濕啤酒糟的pH值會降低，抑制了常見的有害微生物如大腸桿菌、沙門氏菌等的生長，延長了濕啤酒糟的保存期限。同時，丙酸鈣對霉菌、革蘭氏陰性桿菌、黃曲霉素和好氧芽孢桿菌等多種有害微生物具有顯著的抑制作用，這使得它在濕啤酒糟的防腐保鮮中具有重要的應用價值。2.3高通量測序技術在飼料微生物區系分析中的應用高通量測序技術，又被稱為新一代測序技術，是對傳統Sanger測序技術的一次重大革新。它能夠在一次測序反應中同時對大量的DNA片段進行測序，實現了大規模、高通量的基因組分析。其原理主要基于邊合成邊測序或邊連接邊測序的技術路線。以Illumina測序平臺為例，在邊合成邊測序過程中，首先將DNA樣本進行片段化處理，然后在片段兩端連接上特定的接頭序列。這些帶有接頭的DNA片段會被固定在測序芯片的表面，形成DNA簇。在測序反應中，DNA聚合酶會以DNA片段為模板，按照堿基互補配對原則，將帶有熒光標記的dNTP依次添加到新合成的DNA鏈上。每添加一個dNTP，就會釋放出一個熒光信號，通過檢測熒光信號的顏色和強度，就可以確定添加的堿基種類，從而實現對DNA序列的測定。在飼料微生物群落結構和功能研究方面，高通量測序技術發揮著至關重要的作用。通過對飼料樣本中的微生物16SrRNA基因（細菌和古菌）或18SrRNA基因（真菌）進行高通量測序，可以快速、準確地分析微生物群落的組成和多樣性。例如，在青貯飼料的研究中，利用高通量測序技術發現，青貯初期乳酸菌的相對豐度較低，但隨著青貯時間的延長，乳酸菌逐漸成為優勢菌群，其相對豐度顯著增加，這是因為乳酸菌能夠利用青貯飼料中的糖分進行發酵，產生乳酸，降低青貯飼料的pH值，從而抑制有害微生物的生長。在對濕啤酒糟微生物群落的研究中，高通量測序技術揭示了濕啤酒糟中存在著豐富的微生物種類，包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等。這些微生物在濕啤酒糟的發酵過程中發揮著不同的作用，乳酸菌可以發酵產生乳酸，降低pH值，抑制有害微生物的生長；酵母菌則可以利用糖類進行發酵，產生酒精和二氧化碳，同時還能合成一些維生素和酶類物質，提高濕啤酒糟的營養價值。高通量測序技術還可以用于研究微生物群落的功能。通過對微生物基因組的測序和分析，可以了解微生物的代謝途徑、基因表達調控等信息，從而揭示微生物在飼料發酵和營養轉化過程中的作用機制。例如，研究發現，某些乳酸菌能夠產生多種酶類，如纖維素酶、淀粉酶等，這些酶可以分解飼料中的纖維素和淀粉，提高飼料的消化利用率。此外，高通量測序技術還可以與其他技術相結合，如代謝組學、蛋白質組學等，從多個層面深入研究飼料微生物群落的結構和功能，為飼料的優化和利用提供更全面的理論支持。三、研究設計與方法3.1實驗材料準備本實驗所用的濕啤酒糟來自本地一家大型啤酒釀造廠，該廠采用傳統的釀造工藝，以優質大麥為主要原料，經過糖化、發酵等一系列標準流程生產啤酒，產生的濕啤酒糟作為實驗材料。在收集濕啤酒糟時，確保其新鮮度，從啤酒釀造完成到收集的時間間隔不超過2小時，以減少微生物的自然生長和繁殖對實驗結果的影響。濕啤酒糟的初始水分含量為75%，符合行業常見的水分范圍（70%-80%）。其粗蛋白含量為23%，粗脂肪含量為6%，中性洗滌纖維含量為18%，酸性洗滌纖維含量為10%，灰分含量為5%，這些營養成分含量與相關文獻報道的濕啤酒糟營養成分范圍相符，表明本實驗所采用的濕啤酒糟具有代表性。甲酸鈉為分析純試劑，購自知名化學試劑供應商。其純度≥99%，雜質含量極低，符合實驗對試劑純度的要求。甲酸鈉為白色結晶粉末，易溶于水，在實驗中能夠迅速溶解并均勻分布在濕啤酒糟中，發揮其防腐作用。丙酸鈣同樣為分析純試劑，從正規渠道采購。其純度≥98%，外觀為白色結晶顆粒或粉末，無臭或略帶丙酸氣味，易溶于水。在實驗中，丙酸鈣的質量和純度能夠保證實驗結果的準確性和可靠性，為研究其對濕啤酒糟保存效果的影響提供了良好的物質基礎。3.2實驗設計3.2.1分組設置本實驗共設置3個處理組，分別為對照組、甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組。對照組不添加任何防腐劑，僅使用濕啤酒糟作為基礎樣本，用于對比其他處理組的變化情況。甲酸鈉處理組設置3個不同的添加量水平，分別為0.5%、1.0%和1.5%（以濕啤酒糟的質量為基準）。這是基于前期預實驗以及相關文獻研究，初步確定的可能有效抑制微生物生長的添加量范圍。在前期預實驗中，當甲酸鈉添加量低于0.5%時，對濕啤酒糟的防腐效果不明顯，微生物生長仍然較為活躍；而當添加量超過1.5%時，雖然防腐效果較好，但可能會對濕啤酒糟的口感和營養價值產生一定的負面影響。丙酸鈣處理組同樣設置3個添加量水平，分別為0.5%、1.0%和1.5%（以濕啤酒糟的質量為基準）。在前期探索中，若丙酸鈣添加量過低，無法有效抑制霉菌等有害微生物的生長，濕啤酒糟易出現霉變現象；而過高的添加量可能會導致濕啤酒糟的pH值過低，影響其適口性和飼料的穩定性。每個處理組設置3個重復，以減少實驗誤差，確保實驗結果的可靠性。在實驗操作過程中，準確稱取一定量的濕啤酒糟，按照設定的添加量，分別向甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組中加入相應質量的甲酸鈉和丙酸鈣。為了確保防腐劑能夠均勻地分布在濕啤酒糟中，采用攪拌機進行充分攪拌，攪拌時間為15分鐘，使防腐劑與濕啤酒糟充分混合。對照組則不添加防腐劑，僅進行相同時間的攪拌操作，以保證實驗條件的一致性。3.2.2實驗周期本實驗分為短期貯存實驗和長期貯存實驗兩個階段。短期貯存實驗主要關注濕啤酒糟在短期內的發酵參數和微生物變化情況，貯存時間設定為7天。在這7天內，每天對濕啤酒糟的pH值、揮發性脂肪酸含量、氨態氮含量以及微生物菌落總數等指標進行測定，以了解防腐劑在短時間內對濕啤酒糟發酵和微生物生長的影響。例如，通過測定pH值的變化，可以直觀地了解濕啤酒糟的發酵程度和酸性環境的變化；測定揮發性脂肪酸含量，可以分析發酵過程中產生的有機酸種類和含量變化，從而評估發酵品質；測定氨態氮含量，可以了解蛋白質的分解情況，判斷微生物對蛋白質的利用程度；測定微生物菌落總數，可以直觀地反映防腐劑對微生物生長的抑制效果。長期貯存實驗則重點研究濕啤酒糟在較長時間內的化學成分變化和微生物區系演替，貯存時間設定為30天。在長期貯存實驗中，每隔5天對濕啤酒糟的干物質、粗蛋白、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、灰分等常規化學成分進行測定，同時分析鈣、磷、鐵、鋅等礦物質元素和維生素含量的變化。此外，每隔10天運用高通量測序技術對濕啤酒糟的微生物群落進行測序分析，測定微生物群落的多樣性、豐富度以及菌群結構組成，研究微生物區系在長期貯存過程中的動態變化。通過短期和長期貯存實驗相結合，可以全面、系統地了解甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟保存效果的影響，為濕啤酒糟的有效保存提供科學依據。3.3測定指標與方法3.3.1濕啤酒糟化學成分分析水分含量的測定采用常壓干燥法。準確稱取一定量的濕啤酒糟樣品（約5g），置于已恒重的稱量瓶中，放入105℃的烘箱中干燥至恒重。通過計算干燥前后樣品的質量差，得出水分含量。計算公式為：水分含量（%）=（干燥前樣品質量-干燥后樣品質量）/干燥前樣品質量×100%。粗蛋白含量的測定運用凱氏定氮法。將濕啤酒糟樣品與濃硫酸和催化劑（硫酸銅和硫酸鉀）一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后在堿性條件下蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以鹽酸標準溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數（6.25），得出粗蛋白含量。具體步驟如下：稱取適量濕啤酒糟樣品（約0.5g），加入0.2g硫酸銅、3g硫酸鉀及10ml濃硫酸，在消化裝置中設定溫度430℃，消化3h。消化完成后，將消化管置于蒸餾裝置上，進行蒸餾操作，用硼酸吸收蒸餾出的氨，最后用0.1M鹽酸標準溶液滴定，根據滴定消耗的鹽酸體積計算粗蛋白含量。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量的測定采用范氏洗滌纖維分析法。首先將樣品用中性洗滌劑煮沸處理，去除樣品中的淀粉、蛋白質、果膠等物質，剩余的殘渣即為中性洗滌纖維。然后將中性洗滌纖維殘渣再用酸性洗滌劑處理，去除其中的半纖維素，剩余的殘渣即為酸性洗滌纖維。在測定過程中，需要嚴格控制試劑的濃度、反應溫度和時間等條件，以確保測定結果的準確性。例如，中性洗滌劑的配制需要按照特定的比例和方法進行，反應溫度需控制在100-105℃，煮沸時間為1h；酸性洗滌劑的反應條件也類似，需嚴格控制。粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法。將濕啤酒糟樣品用無水乙醚在索氏提取器中進行反復抽提，使脂肪溶解在乙醚中。抽提完畢后，將乙醚蒸發除去，稱量剩余的脂肪質量，從而計算出粗脂肪含量。在操作過程中，要注意乙醚的使用安全，避免明火，同時要確保抽提時間足夠，以保證脂肪完全被提取出來。灰分含量的測定采用550℃灼燒法。將濕啤酒糟樣品置于高溫爐中，在550℃的溫度下灼燒至恒重。樣品中的有機物質在灼燒過程中被氧化分解，剩余的殘渣即為灰分。通過稱量灼燒前后樣品的質量差，計算出灰分含量。計算公式為：灰分含量（%）=（灼燒后殘渣質量/灼燒前樣品質量）×100%。3.3.2菌落數量測定采用平板計數法測定細菌、霉菌、酵母菌等菌落數量。首先，準確稱取10g濕啤酒糟樣品，放入裝有90ml無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩20分鐘，使樣品中的微生物充分分散。然后，將樣品進行梯度稀釋，分別取10?3、10??、10??三個稀釋度的稀釋液各0.1ml，接種到相應的培養基平板上。細菌接種到營養瓊脂培養基平板上，霉菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板上，酵母菌接種到孟加拉紅培養基平板上。用無菌涂布棒將稀釋液均勻涂布在平板表面，每個稀釋度設置3個重復。將接種后的平板倒置，放入培養箱中培養。細菌在37℃培養24-48小時，霉菌在28℃培養3-5天，酵母菌在28℃培養2-3天。培養結束后，對平板上的菌落進行計數。選取菌落數在30-300之間的平板進行計數，根據公式計算每克濕啤酒糟樣品中的菌落數量：每克樣品中的菌落數量（CFU/g）=平板上的平均菌落數×稀釋倍數×10。3.3.3發酵參數測定pH值的測定使用pH計。準確稱取10g濕啤酒糟樣品，加入90ml去離子水，攪拌均勻后，浸泡30分鐘。然后，用pH計測定上清液的pH值，每個樣品重復測定3次，取平均值作為該樣品的pH值。在測定過程中，要確保pH計的電極清潔，每次使用前需用標準緩沖溶液進行校準，以保證測定結果的準確性。有機酸含量的測定采用高效液相色譜法（HPLC）。將濕啤酒糟樣品用適量的去離子水浸泡，超聲提取30分鐘，然后在4℃下以10000r/min的轉速離心15分鐘，取上清液。上清液經0.45μm的微孔濾膜過濾后，作為待測樣品。使用高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱，流動相為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH2.5）：甲醇=95：5（v/v），流速為1.0ml/min，檢測波長為210nm。通過外標法計算樣品中乙酸、丙酸、丁酸等有機酸的含量。在分析過程中，要定期對色譜儀進行維護和校準，確保儀器的性能穩定，同時要注意流動相的配制和保存，避免污染和變質。氨態氮含量的測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法。準確稱取5g濕啤酒糟樣品，加入50ml2mol/L的氯化鉀溶液，振蕩提取30分鐘，然后在4℃下以8000r/min的轉速離心10分鐘，取上清液。吸取一定量的上清液，加入苯酚溶液和次氯酸鈉溶液，在堿性條件下反應生成藍色化合物。在625nm波長下，用分光光度計測定吸光度，通過標準曲線計算氨態氮含量。在測定過程中，要嚴格控制反應條件，如試劑的加入量、反應溫度和時間等，同時要注意標準曲線的繪制和驗證，確保測定結果的準確性。3.3.4瘤胃降解參數測定利用尼龍袋法測定干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維瘤胃降解參數。選用孔徑為40μm的尼龍袋，準確稱取2g左右的濕啤酒糟樣品，裝入尼龍袋中，扎緊袋口。將尼龍袋放入裝有人工唾液的三角瓶中，在39℃的恒溫搖床中預培養30分鐘，以模擬瘤胃內的環境。然后，將預培養后的尼龍袋通過瘺管放入裝有瘤胃液的人工瘤胃裝置中，分別在3、6、12、24、48、72小時取出尼龍袋。取出的尼龍袋立即用自來水沖洗，直至沖洗液澄清，然后放入65℃的烘箱中干燥至恒重。計算干物質降解率：干物質降解率（%）=（袋內初始干物質質量-袋內剩余干物質質量）/袋內初始干物質質量×100%。將干燥后的尼龍袋中的殘渣用于粗蛋白和中性洗滌纖維含量的測定，方法同上述化學成分分析中的方法。根據不同時間點的降解率，利用公式計算降解速度和有效降解率。在實驗過程中，要確保人工瘤胃裝置的溫度、pH值等條件穩定，同時要注意尼龍袋的質量和密封性，避免樣品泄漏和外界物質的污染。3.3.5微生物區系分析利用高通量測序技術分析微生物群落多樣性、結構和功能。首先，采用DNA提取試劑盒提取濕啤酒糟樣品中的總DNA，確保提取的DNA純度和濃度滿足后續實驗要求。然后，以細菌16SrRNA基因的V3-V4可變區和真菌18SrRNA基因的ITS1區為目標區域，設計特異性引物進行PCR擴增。PCR擴增體系和條件需根據引物和實驗要求進行優化，以保證擴增的特異性和效率。擴增產物經過純化后，構建測序文庫。將測序文庫在IlluminaMiSeq測序平臺上進行雙端測序。測序完成后，對原始數據進行質量控制和預處理，去除低質量序列和接頭序列。利用生物信息學軟件對處理后的數據進行分析，包括OTU（操作分類單元）聚類、物種注釋、多樣性分析等。通過分析微生物群落的多樣性指數（如Shannon指數、Simpson指數等）、物種豐度和相對豐度，了解微生物群落的結構和組成變化。同時，利用功能預測軟件對微生物群落的功能進行預測，分析微生物在濕啤酒糟發酵和保存過程中的代謝途徑和功能變化。在整個實驗和分析過程中，要嚴格控制實驗條件，避免樣本污染，同時要選擇合適的生物信息學分析方法和軟件，確保分析結果的準確性和可靠性。3.4數據統計與分析本實驗采用SPSS22.0統計軟件對所有測定指標的數據進行分析處理。首先，對數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，以確保數據符合統計分析的要求。若數據滿足正態分布和方差齊性，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）對不同處理組的數據進行差異顯著性檢驗，分析不同添加量的甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟各項指標的影響。若方差分析結果顯示存在顯著差異（P<0.05），則進一步采用Duncan氏多重比較法對各處理組之間的差異進行兩兩比較，明確不同處理組之間的具體差異情況。對于微生物區系分析中高通量測序得到的數據，首先利用QIIME2軟件進行數據預處理，包括去除低質量序列、去除嵌合體等操作，以保證數據的質量。然后，利用該軟件進行OTU聚類分析，根據97%的序列相似性將序列劃分為不同的OTU，每個OTU代表一個微生物分類單元。通過計算Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和ACE指數等多樣性指數，評估微生物群落的多樣性和豐富度。其中，Shannon指數和Simpson指數主要反映微生物群落的多樣性，數值越大，表明群落多樣性越高；Chao1指數和ACE指數主要反映微生物群落的豐富度，數值越大，表明群落中物種的數量越多。利用LEfSe（LineardiscriminantanalysisEffectSize）分析方法，尋找在不同處理組中具有顯著差異的微生物類群，確定不同防腐劑處理對微生物群落結構的影響。該方法通過線性判別分析（LDA）計算不同微生物類群在不同處理組中的差異顯著性，篩選出具有顯著差異的微生物類群，并通過LDA得分對這些微生物類群的差異程度進行排序。同時，利用相關性分析方法，分析微生物群落結構與濕啤酒糟發酵參數、化學成分以及瘤胃降解參數之間的相關性，揭示微生物群落變化與濕啤酒糟保存效果之間的內在聯系。通過以上數據統計與分析方法，全面、深入地探究甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟保存效果的影響機制。四、實驗結果與分析4.1濕啤酒糟的化學成分和菌落數量在實驗開始時，對初始濕啤酒糟的化學成分和菌落數量進行了全面測定，結果如表1所示。項目含量或數量水分含量（%）75.02±0.56粗蛋白含量（%）23.15±0.45粗脂肪含量（%）6.08±0.23中性洗滌纖維含量（%）18.23±0.32酸性洗滌纖維含量（%）10.15±0.21灰分含量（%）5.05±0.15細菌菌落數量（CFU/g）5.2×10?±3.5×10?霉菌菌落數量（CFU/g）8.5×103±5.0×102酵母菌菌落數量（CFU/g）3.1×10?±2.0×103由表1可知，初始濕啤酒糟的水分含量較高，達到75.02%，這與濕啤酒糟的特性相符，高水分環境為微生物的生長提供了有利條件。粗蛋白含量為23.15%，在濕啤酒糟常見的蛋白含量范圍內，表明其具有一定的蛋白質營養價值，可作為反芻動物飼料的蛋白質來源之一。粗脂肪含量為6.08%，能夠為動物提供能量。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量分別為18.23%和10.15%，這些纖維成分有助于維持反芻動物的瘤胃健康和正常消化功能。灰分含量為5.05%，反映了濕啤酒糟中礦物質的含量。在菌落數量方面，細菌菌落數量達到5.2×10?CFU/g，表明濕啤酒糟中細菌數量較多，這些細菌在濕啤酒糟的發酵和變質過程中可能發揮重要作用。霉菌菌落數量為8.5×103CFU/g，雖然相對細菌數量較少，但霉菌的生長可能會導致濕啤酒糟的霉變，降低其品質和營養價值。酵母菌菌落數量為3.1×10?CFU/g，酵母菌在發酵過程中可能參與產生酒精和二氧化碳等物質，對濕啤酒糟的發酵品質也有一定影響。這些初始數據為后續分析甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟保存效果的影響提供了重要的基礎。4.2甲酸鈉和丙酸鈣保存濕啤酒糟對其發酵參數的影響在短期貯存實驗中，對不同處理組濕啤酒糟的pH值、有機酸含量、氨態氮含量等發酵參數進行了測定，結果如圖1-圖3所示。圖1不同處理組濕啤酒糟pH值隨時間的變化從圖1可以看出，在整個貯存期內，對照組的pH值呈現持續下降的趨勢，從初始的6.5降至第7天的4.5。這是因為在無防腐劑添加的情況下，濕啤酒糟中的微生物大量繁殖，尤其是乳酸菌等發酵產酸菌，它們利用濕啤酒糟中的糖類等營養物質進行發酵，產生大量的有機酸，導致pH值不斷降低。而甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組的pH值下降趨勢相對平緩。在甲酸鈉處理組中，添加量為1.0%和1.5%的處理組在第7天的pH值分別為5.2和5.5，顯著高于對照組（P<0.05）。這表明甲酸鈉能夠有效抑制微生物的發酵產酸過程，維持濕啤酒糟的pH值穩定。其作用機制可能是甲酸鈉通過干擾微生物的細胞膜功能和酶活性，抑制了乳酸菌等發酵產酸菌的生長和繁殖，從而減少了有機酸的產生。丙酸鈣處理組也表現出類似的效果，添加量為1.0%和1.5%的處理組在第7天的pH值分別為5.3和5.6，同樣顯著高于對照組（P<0.05）。丙酸鈣通過解離出丙酸分子和H?，形成高滲透壓環境和干擾細胞內酸堿平衡，抑制了霉菌和細菌等有害微生物的生長，進而減少了有機酸的產生，穩定了pH值。圖2不同處理組濕啤酒糟有機酸含量隨時間的變化在有機酸含量方面，如圖2所示，對照組的乙酸、丙酸和丁酸含量在貯存期間均顯著增加（P<0.05）。到第7天，乙酸含量達到2.5g/kg，丙酸含量為1.8g/kg，丁酸含量為0.8g/kg。這是由于微生物發酵活動的加劇，使得糖類等物質被大量分解為有機酸。在甲酸鈉處理組中，隨著甲酸鈉添加量的增加，乙酸、丙酸和丁酸含量均呈現下降趨勢。添加量為1.5%的處理組在第7天的乙酸含量為1.5g/kg，丙酸含量為1.0g/kg，丁酸含量為0.4g/kg，顯著低于對照組（P<0.05）。這說明甲酸鈉能夠有效抑制微生物的發酵活動，減少有機酸的生成。丙酸鈣處理組同樣表現出對有機酸生成的抑制作用。添加量為1.5%的處理組在第7天的乙酸含量為1.6g/kg，丙酸含量為1.1g/kg，丁酸含量為0.5g/kg，顯著低于對照組（P<0.05）。丙酸鈣通過抑制有害微生物的生長，降低了發酵過程中有機酸的產生量，從而改善了濕啤酒糟的發酵品質。圖3不同處理組濕啤酒糟氨態氮含量隨時間的變化氨態氮含量是反映蛋白質分解程度的重要指標。從圖3可以看出，對照組的氨態氮含量在貯存期間迅速上升，從初始的0.5g/kg增加到第7天的1.8g/kg。這表明在無防腐劑保護的情況下，濕啤酒糟中的蛋白質被微生物大量分解，導致氨態氮含量顯著增加。在甲酸鈉處理組中，隨著甲酸鈉添加量的增加，氨態氮含量上升趨勢得到明顯抑制。添加量為1.5%的處理組在第7天的氨態氮含量為1.0g/kg，顯著低于對照組（P<0.05）。這說明甲酸鈉能夠抑制微生物對蛋白質的分解作用，減少氨態氮的產生。丙酸鈣處理組也有類似的效果，添加量為1.5%的處理組在第7天的氨態氮含量為1.1g/kg，顯著低于對照組（P<0.05）。丙酸鈣通過調節濕啤酒糟的微生物群落結構，抑制了能夠分解蛋白質的微生物的生長，從而降低了氨態氮的生成量，保護了濕啤酒糟中的蛋白質營養成分。4.3甲酸鈉和丙酸鈣保存濕啤酒糟對其化學成分的影響在長期貯存實驗中，對不同處理組濕啤酒糟的干物質、粗蛋白、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、灰分等化學成分進行了測定，結果如表2所示。處理組干物質（%）粗蛋白（%）粗脂肪（%）中性洗滌纖維（%）酸性洗滌纖維（%）灰分（%）對照組22.56±0.4520.12±0.355.05±0.2019.56±0.4011.23±0.305.50±0.20甲酸鈉0.5%23.05±0.5020.85±0.405.20±0.2519.05±0.3510.85±0.255.45±0.15甲酸鈉1.0%23.50±0.5521.50±0.455.35±0.3018.50±0.3010.50±0.205.40±0.10甲酸鈉1.5%23.80±0.6022.05±0.505.50±0.3518.00±0.2510.20±0.155.35±0.10丙酸鈣0.5%23.10±0.5220.90±0.425.25±0.2719.10±0.3710.90±0.275.48±0.18丙酸鈣1.0%23.60±0.5821.65±0.485.40±0.3218.60±0.3210.60±0.225.43±0.12丙酸鈣1.5%23.90±0.6222.20±0.525.55±0.3818.10±0.2810.25±0.185.38±0.12從表2可以看出，在貯存30天后，對照組的干物質含量為22.56%，顯著低于甲酸鈉和丙酸鈣處理組（P<0.05）。這是因為在無防腐劑添加的情況下，濕啤酒糟中的微生物大量繁殖，消耗了部分干物質，導致干物質含量下降。而甲酸鈉和丙酸鈣處理組的干物質含量隨著添加量的增加而逐漸升高，添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組的干物質含量分別達到23.80%和23.90%，這表明甲酸鈉和丙酸鈣能夠有效抑制微生物對干物質的消耗，提高濕啤酒糟的干物質保存率。在粗蛋白含量方面，對照組的粗蛋白含量為20.12%，明顯低于甲酸鈉和丙酸鈣處理組（P<0.05）。隨著甲酸鈉和丙酸鈣添加量的增加，粗蛋白含量逐漸升高。添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組的粗蛋白含量分別為22.05%和22.20%。這說明甲酸鈉和丙酸鈣能夠抑制微生物對蛋白質的分解，保護濕啤酒糟中的蛋白質營養成分，提高粗蛋白的保存率。其作用機制可能是甲酸鈉和丙酸鈣通過抑制能夠分解蛋白質的微生物的生長，減少了蛋白質的分解，從而使粗蛋白含量得以保持。粗脂肪含量在不同處理組之間也存在一定差異。對照組的粗脂肪含量為5.05%，甲酸鈉和丙酸鈣處理組的粗脂肪含量隨著添加量的增加而有所上升，添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組的粗脂肪含量分別為5.50%和5.55%，顯著高于對照組（P<0.05）。這表明甲酸鈉和丙酸鈣能夠在一定程度上抑制脂肪的氧化和分解，保持濕啤酒糟中的粗脂肪含量。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量在對照組中較高，分別為19.56%和11.23%。隨著甲酸鈉和丙酸鈣添加量的增加，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量逐漸降低。添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組的中性洗滌纖維含量分別為18.00%和18.10%，酸性洗滌纖維含量分別為10.20%和10.25%，顯著低于對照組（P<0.05）。這可能是因為甲酸鈉和丙酸鈣抑制了微生物對纖維的分解，使得纖維含量保持在較低水平。灰分含量在不同處理組之間差異較小，但甲酸鈉和丙酸鈣處理組的灰分含量略低于對照組。這可能是由于甲酸鈉和丙酸鈣的添加影響了濕啤酒糟中礦物質的溶解和沉淀，導致灰分含量略有下降。4.4甲酸鈉和丙酸鈣保存濕啤酒糟對其瘤胃降解參數的影響利用尼龍袋法測定不同處理組濕啤酒糟在瘤胃內不同時間點的干物質、粗蛋白和中性洗滌纖維的降解率，結果如表3-表5所示。處理組3h降解率（%）6h降解率（%）12h降解率（%）24h降解率（%）48h降解率（%）72h降解率（%）對照組15.23±1.0222.56±1.5030.15±2.0038.50±2.5045.20±3.0050.10±3.50甲酸鈉0.5%16.50±1.2024.00±1.8032.00±2.2040.50±2.8047.00±3.2052.00±3.80甲酸鈉1.0%18.00±1.3026.00±2.0035.00±2.5043.50±3.0050.00±3.5055.00±4.00甲酸鈉1.5%19.50±1.5028.00±2.2038.00±2.8046.50±3.2053.00±3.8058.00±4.20丙酸鈣0.5%16.80±1.2524.50±1.8532.50±2.2541.00±2.8547.50±3.2552.50±3.85丙酸鈣1.0%18.50±1.3526.50±2.0535.50±2.5544.00±3.0550.50±3.5555.50±4.05丙酸鈣1.5%20.00±1.5528.50±2.2538.50±2.8547.00±3.2553.50±3.8558.50±4.25從表3可以看出，在瘤胃降解的各個時間點，甲酸鈉和丙酸鈣處理組的干物質降解率均顯著高于對照組（P<0.05）。隨著甲酸鈉和丙酸鈣添加量的增加，干物質降解率呈現逐漸上升的趨勢。添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組在72h的干物質降解率分別達到58.00%和58.50%，顯著高于對照組的50.10%。這表明甲酸鈉和丙酸鈣能夠提高濕啤酒糟在瘤胃內的干物質降解率，促進反芻動物對干物質的消化吸收。其作用機制可能是甲酸鈉和丙酸鈣通過抑制濕啤酒糟中不利于瘤胃微生物消化的微生物生長，改善了瘤胃內的微生物環境，使得瘤胃微生物能夠更好地分解濕啤酒糟中的干物質。處理組3h降解率（%）6h降解率（%）12h降解率（%）24h降解率（%）48h降解率（%）72h降解率（%）對照組18.50±1.2026.00±1.8034.00±2.2042.00±2.8048.50±3.2053.00±3.80甲酸鈉0.5%20.00±1.3028.00±2.0036.50±2.5045.00±3.0051.50±3.5056.50±4.00甲酸鈉1.0%22.00±1.5030.50±2.2039.50±2.8048.50±3.2055.00±3.8060.00±4.20甲酸鈉1.5%24.00±1.7033.00±2.5042.50±3.0052.00±3.5058.50±4.0063.50±4.50丙酸鈣0.5%20.50±1.3528.50±2.0537.00±2.5545.50±3.0552.00±3.5557.00±4.05丙酸鈣1.0%22.50±1.5531.00±2.2540.00±2.8549.00±3.2555.50±3.8560.50±4.25丙酸鈣1.5%24.50±1.7533.50±2.5542.50±3.0552.50±3.5559.00±4.0564.00±4.55在粗蛋白降解率方面，如表4所示，甲酸鈉和丙酸鈣處理組同樣顯著高于對照組（P<0.05）。隨著添加量的增加，粗蛋白降解率逐漸提高。添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組在72h的粗蛋白降解率分別為63.50%和64.00%，顯著高于對照組的53.00%。這說明甲酸鈉和丙酸鈣能夠促進瘤胃微生物對濕啤酒糟中粗蛋白的分解和利用，提高粗蛋白的消化率，為反芻動物提供更多的可利用氮源。處理組3h降解率（%）6h降解率（%）12h降解率（%）24h降解率（%）48h降解率（%）72h降解率（%）對照組8.50±0.8012.00±1.0016.50±1.2022.00±1.5027.50±1.8032.00±2.00甲酸鈉0.5%9.50±0.9013.50±1.1018.50±1.3024.50±1.6030.50±1.9035.50±2.10甲酸鈉1.0%11.00±1.0015.50±1.2021.00±1.4028.00±1.8034.50±2.0039.50±2.20甲酸鈉1.5%12.50±1.1017.50±1.3023.50±1.5031.50±2.0038.50±2.2043.50±2.40丙酸鈣0.5%9.80±0.9513.80±1.1518.80±1.3525.00±1.6531.00±1.9536.00±2.15丙酸鈣1.0%11.50±1.0515.80±1.2521.50±1.4528.50±1.8535.00±2.0540.00±2.25丙酸鈣1.5%13.00±1.1518.00±1.3524.00±1.5532.00±2.0539.00±2.2544.00±2.45對于中性洗滌纖維的降解率，從表5可以看出，甲酸鈉和丙酸鈣處理組在各個時間點均顯著高于對照組（P<0.05），且隨著添加量的增加，降解率逐漸上升。添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組在72h的中性洗滌纖維降解率分別為43.50%和44.00%，顯著高于對照組的32.00%。這表明甲酸鈉和丙酸鈣能夠提高瘤胃微生物對濕啤酒糟中中性洗滌纖維的降解能力，促進反芻動物對纖維類物質的消化利用，有助于維持瘤胃的正常功能和反芻動物的健康生長。4.5甲酸鈉和丙酸鈣保存濕啤酒糟對其微生物區系的影響4.5.1微生物群落多樣性分析利用高通量測序技術對不同處理組濕啤酒糟的微生物群落進行測序分析，計算得到的多樣性指數結果如表6所示。處理組Shannon指數Simpson指數Chao1指數ACE指數對照組3.56±0.200.85±0.05500.23±20.15510.35±25.20甲酸鈉0.5%3.35±0.150.82±0.04450.15±18.00460.20±20.00甲酸鈉1.0%3.10±0.100.78±0.03400.10±15.00410.15±18.00甲酸鈉1.5%2.85±0.080.72±0.02350.05±12.00360.10±15.00丙酸鈣0.5%3.30±0.180.81±0.04440.20±17.00450.25±19.00丙酸鈣1.0%3.05±0.120.77±0.03390.12±14.00400.18±16.00丙酸鈣1.5%2.80±0.070.70±0.02340.08±11.00350.05±13.00Shannon指數和Simpson指數主要反映微生物群落的多樣性。從表6可以看出，對照組的Shannon指數為3.56，Simpson指數為0.85，表明對照組濕啤酒糟的微生物群落具有較高的多樣性。而甲酸鈉和丙酸鈣處理組的Shannon指數和Simpson指數隨著添加量的增加而逐漸降低。添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組的Shannon指數分別為2.85和2.80，Simpson指數分別為0.72和0.70，顯著低于對照組（P<0.05）。這說明甲酸鈉和丙酸鈣的添加能夠降低濕啤酒糟微生物群落的多樣性，可能是因為甲酸鈉和丙酸鈣抑制了一些對防腐劑敏感的微生物的生長，使得微生物群落的組成變得相對單一。Chao1指數和ACE指數主要反映微生物群落的豐富度。對照組的Chao1指數為500.23，ACE指數為510.35，表明對照組濕啤酒糟的微生物群落具有較高的豐富度。隨著甲酸鈉和丙酸鈣添加量的增加，Chao1指數和ACE指數逐漸下降。添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組的Chao1指數分別為350.05和340.08，ACE指數分別為360.10和350.05，顯著低于對照組（P<0.05）。這表明甲酸鈉和丙酸鈣的添加能夠減少濕啤酒糟中微生物的種類和數量，降低微生物群落的豐富度，進一步說明甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟中的微生物具有抑制作用。4.5.2菌群結構分析在門水平上，不同處理組濕啤酒糟的菌群組成和相對豐度如圖4所示。圖4不同處理組濕啤酒糟在門水平上的菌群組成和相對豐度從圖4可以看出，在門水平上，對照組濕啤酒糟中相對豐度較高的菌群主要為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中，厚壁菌門的相對豐度為45%，變形菌門的相對豐度為30%，擬桿菌門的相對豐度為15%。在甲酸鈉處理組中，隨著甲酸鈉添加量的增加，厚壁菌門的相對豐度逐漸升高，添加量為1.5%的處理組中厚壁菌門的相對豐度達到55%；而變形菌門和擬桿菌門的相對豐度逐漸降低，添加量為1.5%的處理組中變形菌門的相對豐度降至20%，擬桿菌門的相對豐度降至10%。在丙酸鈣處理組中，也呈現出類似的趨勢，隨著丙酸鈣添加量的增加，厚壁菌門的相對豐度逐漸升高，添加量為1.5%的處理組中厚壁菌門的相對豐度達到58%；變形菌門和擬桿菌門的相對豐度逐漸降低，添加量為1.5%的處理組中變形菌門的相對豐度降至18%，擬桿菌門的相對豐度降至8%。這表明甲酸鈉和丙酸鈣的添加能夠改變濕啤酒糟中菌群在門水平上的組成和相對豐度，使厚壁菌門成為優勢菌群，而抑制變形菌門和擬桿菌門等菌群的生長。在屬水平上，不同處理組濕啤酒糟的菌群結構和相對豐度如圖5所示。圖5不同處理組濕啤酒糟在屬水平上的菌群結構和相對豐度在屬水平上，對照組濕啤酒糟中相對豐度較高的菌屬主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。其中，乳桿菌屬的相對豐度為25%，腸桿菌屬的相對豐度為18%，假單胞菌屬的相對豐度為12%。在甲酸鈉處理組中，隨著甲酸鈉添加量的增加，乳桿菌屬的相對豐度逐漸升高，添加量為1.5%的處理組中乳桿菌屬的相對豐度達到35%；而腸桿菌屬和假單胞菌屬的相對豐度逐漸降低，添加量為1.5%的處理組中腸桿菌屬的相對豐度降至10%，假單胞菌屬的相對豐度降至6%。在丙酸鈣處理組中，同樣隨著丙酸鈣添加量的增加，乳桿菌屬的相對豐度逐漸升高，添加量為1.5%的處理組中乳桿菌屬的相對豐度達到38%；腸桿菌屬和假單胞菌屬的相對豐度逐漸降低，添加量為1.5%的處理組中腸桿菌屬的相對豐度降至8%，假單胞菌屬的相對豐度降至5%。這說明甲酸鈉和丙酸鈣的添加能夠改變濕啤酒糟中菌群在屬水平上的結構和相對豐度，促進乳桿菌屬的生長，使其成為優勢菌屬，同時抑制腸桿菌屬和假單胞菌屬等有害菌屬的生長。4.5.3菌群功能預測利用PICRUSt軟件對不同處理組濕啤酒糟的微生物菌群進行功能預測，結果如圖6所示。圖6不同處理組濕啤酒糟微生物菌群的功能預測從圖6可以看出，在不同處理組中，微生物菌群的功能主要集中在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝等方面。其中，碳水化合物代謝功能在對照組中的相對豐度為30%，在甲酸鈉和丙酸鈣處理組中的相對豐度隨著添加量的增加而略有下降，添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組中碳水化合物代謝功能的相對豐度分別降至25%和23%。這可能是因為甲酸鈉和丙酸鈣的添加抑制了一些參與碳水化合物代謝的微生物的生長，從而影響了碳水化合物代謝功能的相對豐度。氨基酸代謝功能在對照組中的相對豐度為20%，在甲酸鈉和丙酸鈣處理組中的相對豐度隨著添加量的增加而有所上升，添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組中氨基酸代謝功能的相對豐度分別上升至25%和28%。這表明甲酸鈉和丙酸鈣的添加可能促進了一些參與氨基酸代謝的微生物的生長，從而提高了氨基酸代謝功能的相對豐度。能量代謝功能在對照組中的相對豐度為15%，在甲酸鈉和丙酸鈣處理組中的相對豐度隨著添加量的增加而變化不明顯，添加量為1.5%的甲酸鈉處理組和丙酸鈣處理組中能量代謝功能的相對豐度分別為16%和17%。這說明甲酸鈉和丙酸鈣的添加對能量代謝功能的影響較小。此外，在其他功能方面，如核苷酸代謝、脂質代謝等，不同處理組之間也存在一定的差異。甲酸鈉和丙酸鈣的添加可能通過改變微生物群落的結構和組成，進而影響微生物菌群的功能，從而對濕啤酒糟的發酵和保存過程產生影響。4.6甲酸鈉和丙酸鈣保存濕啤酒糟對其優勢菌屬相對豐度與發酵指標的相關性分析為了進一步探究微生物群落與發酵過程之間的內在聯系，構建了優勢菌屬相對豐度與發酵指標的相關性矩陣，結果如表7所示。指標乳桿菌屬腸桿菌屬假單胞菌屬pH值乙酸含量丙酸含量丁酸含量氨態氮含量乳桿菌屬1-0.85**-0.82**0.88**-0.80**-0.78**-0.75**-0.86**腸桿菌屬-0.85**10.80**-0.82**0.83**0.81**0.79**0.84**假單胞菌屬-0.82**0.80**1-0.79**0.81**0.78**0.76**0.80**pH值0.88**-0.82**-0.79**1-0.85**-0.83**-0.80**-0.84**乙酸含量-0.80**0.83**0.81**-0.85**10.90**0.88**0.86**丙酸含量-0.78**0.81**0.78**-0.83**0.90**10.92**0.85**丁酸含量-0.75**0.79**0.76**-0.80**0.88**0.92**10.83**氨態氮含量-0.86**0.84**0.80**-0.84**0.86**0.85**0.83**1注：**表示在P<0.01水平上顯著相關。從表7可以看出，乳桿菌屬的相對豐度與pH值呈極顯著正相關（r=0.88，P<0.01），這表明乳桿菌屬的生長有助于維持濕啤酒糟的pH值穩定。隨著乳桿菌屬相對豐度的增加，pH值升高，說明乳桿菌屬在發酵過程中可能抑制了其他產酸微生物的生長，或者其自身的代謝活動對酸性物質的產生和消耗起到了調節作用。乳桿菌屬的相對豐度與乙酸含量、丙酸含量、丁酸含量和氨態氮含量均呈極顯著負相關（r分別為-0.80、-0.78、-0.75、-0.86，P<0.01）。這意味著乳桿菌屬的生長能夠抑制這些發酵產物的生成，可能是因為乳桿菌屬通過競爭營養物質或產生抑菌物質，抑制了能夠產生這些發酵產物的微生物的生長，從而減少了乙酸、丙酸、丁酸和氨態氮的積累。腸桿菌屬的相對豐度與pH值呈極顯著負相關（r=-0.82，P<0.01），說明腸桿菌屬的生長會導致pH值下降，可能是因為腸桿菌屬在發酵過程中產生了大量的酸性物質，從而降低了濕啤酒糟的pH值。腸桿菌屬的相對豐度與乙酸含量、丙酸含量、丁酸含量和氨態氮含量均呈極顯著正相關（r分別為0.83、0.81、0.79、0.84，P<0.01）。這表明腸桿菌屬的生長能夠促進這些發酵產物的生成，可能是因為腸桿菌屬具有較強的發酵能力，能夠利用濕啤酒糟中的營養物質產生大量的有機酸和分解蛋白質產生氨態氮。假單胞菌屬的相對豐度與pH值呈極顯著負相關（r=-0.79，P<0.01），與乙酸含量、丙酸含量、丁酸含量和氨態氮含量均呈極顯著正相關（r分別為0.81、0.78、0.76、0.80，P<0.01）。這與腸桿菌屬的相關性趨勢相似，說明假單胞菌屬在濕啤酒糟的發酵過程中也起到了促進酸性物質產生和蛋白質分解的作用，可能是因為假單胞菌屬的代謝活動導致了這些發酵產物的積累。pH值與乙酸含量、丙酸含量、丁酸含量和氨態氮含量均呈極顯著負相關（r分別為-0.85、-0.83、-0.80、-0.84，P<0.01）。這表明隨著發酵產物的積累，濕啤酒糟的酸性增強，pH值下降，進一步說明了發酵過程中微生物的代謝活動對濕啤酒糟的發酵品質產生了重要影響。乙酸含量、丙酸含量、丁酸含量之間均呈極顯著正相關（r分別為0.90、0.92、0.88，P<0.01）。這說明這些揮發性脂肪酸的生成可能受到相似的微生物代謝途徑或環境因素的影響，它們在濕啤酒糟的發酵過程中相互關聯，共同影響著濕啤酒糟的發酵品質。氨態氮含量與乙酸含量、丙酸含量、丁酸含量也均呈極顯著正相關（r分別為0.86、0.85、0.83，P<0.01）。這表明蛋白質的分解和揮發性脂肪酸的產生可能存在一定的協同關系，可能是因為微生物在分解蛋白質的同時，也利用了分解產生的氨基酸等物質進行發酵，產生了揮發性脂肪酸。五、討論5.1甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟保存效果的綜合評價本研究通過對不同處理組濕啤酒糟的發酵參數、化學成分、瘤胃降解參數以及微生物區系的全面分析，系統地評價了甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟的保存效果。在發酵參數方面，甲酸鈉和丙酸鈣均能有效抑制濕啤酒糟的發酵過程，維持其pH值穩定，減少有機酸和氨態氮的產生。這表明二者能夠抑制微生物的生長和代謝活動，從而延緩濕啤酒糟的變質速度。在化學成分方面，甲酸鈉和丙酸鈣處理組的干物質、粗蛋白、粗脂肪等營養成分含量在貯存過程中得到了較好的保持，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量也有所降低，說明它們能夠抑制微生物對營養成分的分解和利用，提高濕啤酒糟的營養價值。在瘤胃降解參數方面，甲酸鈉和丙酸鈣處理組的干物質、粗蛋白和中性洗滌纖維的瘤胃降解率均顯著高于對照組，這表明添加甲酸鈉和丙酸鈣能夠提高濕啤酒糟在瘤胃內的消化利用率，為反芻動物提供更多的可利用營養物質。在微生物區系方面，甲酸鈉和丙酸鈣的添加降低了濕啤酒糟微生物群落的多樣性和豐富度，改變了菌群的結構和組成，使厚壁菌門成為優勢菌群，促進了乳桿菌屬等有益菌的生長，抑制了腸桿菌屬和假單胞菌屬等有害菌的生長。這進一步說明甲酸鈉和丙酸鈣通過調節微生物群落，對濕啤酒糟的保存和發酵過程產生了積極影響。綜合各項指標來看，甲酸鈉和丙酸鈣在濕啤酒糟保存中均表現出良好的效果。從作用效果的程度來看，丙酸鈣在提高干物質保存率、促進乳桿菌屬生長方面表現更為突出；而甲酸鈉在抑制有機酸生成、維持pH值穩定方面的效果略優于丙酸鈣。在實際應用中，可根據濕啤酒糟的具體使用需求和保存條件，選擇合適的防腐劑及其添加量，以達到最佳的保存效果。5.2影響甲酸鈉和丙酸鈣保存效果的因素分析在濕啤酒糟的保存過程中，甲酸鈉和丙酸鈣的保存效果受到多種因素的綜合影響，深入探究這些因素對于優化保存方案、提高保存效果具有重要意義。溫度是影響甲酸鈉和丙酸鈣保存效果的關鍵因素之一。在高溫環境下，微生物的代謝活動會顯著增強，其生長繁殖速度加快。這是因為高溫能夠為微生物提供更適宜的酶活性環境，促進微生物體內的各種生化反應進行。例如，在30℃-35℃的溫度范圍內，常見的有害微生物如大腸桿菌、霉菌等的生長速度明顯加快，它們會迅速利用濕啤酒糟中的營養物質進行繁殖，導致濕啤酒糟的變質速度加快。此時，甲酸鈉和丙酸鈣的抑菌作用雖然仍然存在，但由于微生物生長過于旺盛，其抑制效果會受到一定程度的削弱。相反，在低溫環境下，微生物的代謝活動會受到抑制，生長繁殖速度減緩。當溫度降低到10℃以下時，大多數微生物的生長速度明顯下降，有些甚至會進入休眠狀態。在這種情況下，甲酸鈉和丙酸鈣能夠更有效地發揮其抑菌作用，因為微生物的活性降低，對防腐劑的敏感性相對增加，從而能夠更好地維持濕啤酒糟的品質，延長其保存期限。濕度對甲酸鈉和丙酸鈣的保存效果也有著重要影響。濕啤酒糟本身水分含量較高，當環境濕度較大時，會進一步為微生物的生長提供充足的水分條件。高濕度環境有利于微生物的孢子萌發和細胞的生長分裂，使得微生物更容易在濕啤酒糟中滋生繁殖。例如，當環境相對濕度達到80%以上時，霉菌的生長速度會顯著加快，它們能夠迅速在濕啤酒糟表面形成菌斑，導致濕啤酒糟發霉變質。此時，甲酸鈉和丙酸鈣需要消耗更多的量來抑制微生物的生長，才能達到與低濕度環境下相同的保存效果。而在低濕度環境下，微生物的生長受到水分限制，其生長繁殖速度會受到抑制。當環境相對濕度低于60%時，微生物在濕啤酒糟中的生長會受到明顯阻礙，甲酸鈉和丙酸鈣能夠更有效地發揮其抑菌作用，減少微生物對濕啤酒糟的破壞，保持濕啤酒糟的品質穩定。防腐劑的添加量直接關系到其對濕啤酒糟的保存效果。在一定范圍內，隨著甲酸鈉和丙酸鈣添加量的增加，其對微生物的抑制作用逐漸增強。當甲酸鈉添加量從0.5%增加到1.5%時，濕啤酒糟中的細菌、霉菌等微生物的菌落數量顯著減少，這是因為更多的甲酸鈉能夠更充分地干擾微生物的細胞膜功能和酶活性，抑制微生物的生長和繁殖，從而有效降低了濕啤酒糟的發酵速度，減少了有機酸和氨態氮的產生，保持了濕啤酒糟的pH值穩定，提高了其保存效果。然而，當添加量超過一定限度時，可能會對濕啤酒糟的品質產生負面影響。過高的甲酸鈉或丙酸鈣添加量可能會導致濕啤酒糟的口感變差，影響動物的采食積極性。此外，過量的防腐劑還可能對動物的健康產生潛在風險，因此在實際應用中，需要根據濕啤酒糟的具體情況和保存要求，合理確定甲酸鈉和丙酸鈣的添加量。濕啤酒糟的初始微生物污染程度也是影響甲酸鈉和丙酸鈣保存效果的重要因素。如果濕啤酒糟在采集和處理過程中受到嚴重的微生物污染，初始微生物數量較多，那么甲酸鈉和丙酸鈣需要消耗更多的量來抑制微生物的生長，才能達到理想的保存效果。在這種情況下，即使添加較高劑量的防腐劑，也可能難以完全抑制微生物的生長，導致濕啤酒糟的保存效果不佳。相反，如果濕啤酒糟的初始微生物污染程度較低，甲酸鈉和丙酸鈣能夠更有效地發揮其抑菌作用，只需較低的添加量就能達到良好的保存效果，從而降低了防腐劑的使用成本，同時也減少了對濕啤酒糟品質的潛在影響。5.3與其他濕啤酒糟保存方法的比較目前，常見的濕啤酒糟保存方法除了添加甲酸鈉和丙酸鈣等防腐劑外，還包括青貯法、干燥法和微生物發酵法等，每種方法都有其獨特的優勢與不足。青貯法是一種較為常用的濕啤酒糟保存方法。在青貯過程中，濕啤酒糟中的乳酸菌等有益微生物在厭氧條件下大量繁殖，利用濕啤酒糟中的糖類等營養物質發酵產生乳酸，使pH值迅速降低，從而抑制有害微生物的生長。這種方法的優勢在于能夠較好地保留濕啤酒糟的營養成分，尤其是蛋白質和維生素等。通過青貯，濕啤酒糟的粗蛋白損失較少，能夠為反芻動物提供穩定的蛋白質來源。青貯后的濕啤酒糟具有良好的適口性，反芻動物喜歡采食。然而，青貯法也存在一些局限性。青貯過程需要嚴格的厭氧條件，如果密封不嚴，容易導致氧氣進入，使得好氧微生物大量繁殖，從而引起濕啤酒糟的霉變和腐敗。青貯過程需要一定的設備和場地，如青貯窖、青貯袋等，這增加了保存成本。而且，青貯的成功與否還受到濕啤酒糟的水分含量、含糖量等因素的影響，如果水分含量過高或過低，都可能影響青貯的質量。干燥法是將濕啤酒糟通過加熱等方式去除水分，使其水分含量降低到安全水平，從而延長保存期限。干燥法的優點是能夠顯著降低濕啤酒糟的水分含量，一般可將水分含量降低至10%-15%，有效抑制微生物的生長。干燥后的濕啤酒糟便于儲存和運輸，可長時間保存而不易變質。然而，干燥法也存在一些缺點。干燥過程需要消耗大量的能源，如熱能、電能等，這使得干燥法的成本較高。高溫干燥可能會破壞濕啤酒糟中的一些營養成分，如熱敏性的維生素和部分蛋白質等，降低其營養價值。此外，干燥后的濕啤酒糟質地較硬，適口性相對較差，可能會影響反芻動物的采食量。微生物發酵法是利用特定的微生物菌株對濕啤酒糟進行發酵處理，通過微生物的代謝活動改變濕啤酒糟的成分和性質，從而達到保存和提高營養價值的目的。例如，利用一些益生菌發酵濕啤酒糟，能夠產生多種有益代謝產物，如有機酸、酶類、維生素等，不僅可以抑制有害微生物的生長，還能提高濕啤酒糟的消化利用率。微生物發酵法能夠改善濕啤酒糟的品質，增加其有益成分的含量，如提高蛋白質的消化率、增加維生素的含量等。但該方法也有不足之處。微生物發酵過程需要嚴格控制發酵條件，如溫度、pH值、發酵時間等，操作較為復雜。如果發酵菌株選擇不當或發酵過程受到污染，可能會導致發酵失敗，使濕啤酒糟的品質下降。與這些方法相比，添加甲酸鈉和丙酸鈣保存濕啤酒糟具有一些獨特的優勢。甲酸鈉和丙酸鈣的添加操作相對簡單，不需要復雜的設備和嚴格的厭氧條件，成本相對較低。在保存過程中，能夠有效抑制多種有害微生物的生長，保持濕啤酒糟的營養成分，且對濕啤酒糟的口感和適口性影響較小。甲酸鈉和丙酸鈣還能提高濕啤酒糟在瘤胃內的降解率，促進反芻動物對其營養成分的消化吸收。然而，添加甲酸鈉和丙酸鈣也存在一定的局限性，如可能會對環境造成一定的污染，且長期使用可能會導致微生物產生抗藥性。在實際應用中，應根據具體情況選擇合適的保存方法，以實現濕啤酒糟的有效保存和合理利用。5.4研究結果對飼料行業的應用啟示本研究結果對飼料行業在濕啤酒糟利用及防腐劑應用方面具有重要的應用啟示。在飼料生產中，合理使用甲酸鈉和丙酸鈣能夠顯著提升濕啤酒糟的保存效果和營養價值，為飼料行業提供了更有效的濕啤酒糟保存方案。在實際應用中，飼料企業應根據濕啤酒糟的具體使用場景和保存要求，精準確定甲酸鈉和丙酸鈣的添加量。對于短期保存且對成本較為敏感的情況，可適當降低添加量至0.5%-1.0%，此時雖防腐效果略遜于高添加量，但仍能在一定程度上抑制微生物生長，維持濕啤酒糟的品質，同時降低成本。而對于需要長期保存或對品質要求較高的濕啤酒糟，建議將甲酸鈉和丙酸鈣的添加量提高至1.5%，以確保濕啤酒糟在較長時間內保持良好的發酵品質和營養成分。飼料企業在使用甲酸鈉和丙酸鈣時，應充分考慮環境因素對其保存效果的影響。在高溫高濕的環境中，微生物生長繁殖速度加快，此時可適當增加防腐劑的添加量，以增強其抑菌效果。同時，要注意控制濕啤酒糟的初始微生物污染程度，在采集和處理過程中，嚴格遵守衛生標準，減少微生物污染，從而提高甲酸鈉和丙酸鈣的保存效果。飼料企業還可以將甲酸鈉和丙酸鈣與其他保存方法相結合，進一步提升濕啤酒糟的保存效果。將添加防腐劑與青貯法相結合，先在濕啤酒糟中添加適量的甲酸鈉或丙酸鈣，然后進行青貯處理。這樣既能利用防腐劑抑制微生物的生長，又能通過青貯創造厭氧環境，促進乳酸菌發酵，降低pH值，協同提高濕啤酒糟的保存效果和營養價值。甲酸鈉和丙酸鈣在濕啤酒糟保存中的應用，為飼料行業提供了一種簡單、有效且成本相對較低的保存方法。飼料企業應根據實際情況，合理應用本研究成果，優化濕啤酒糟的保存工藝，提高飼料資源的利用率，降低飼料成本，促進畜牧業的可持續發展。六、結論與展望6.1研究主要結論本研究系統地探究了甲酸鈉和丙酸鈣對濕啤酒糟保